達(dá)格列凈對2型糖尿病合并慢性心力衰竭患者微小RNA-423-5p的調(diào)控作用及心功能的影響研究

陳瑞敏，劉放，談紅*，韓淑芳，陳英劍，蘇叢叢

心力衰竭（HF）是各種心血管疾病導(dǎo)致心室收縮和/或舒張功能障礙的一組臨床綜合征［1］。HF患者糖尿病患病率為10%～47%，住院HF患者糖尿病患病率達(dá)40%以上；糖尿病是HF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，糖尿病患者中HF患病率為9%～22%，比普通人群高4倍，60歲及以上糖尿病患者HF患病率更高［2-3］。合并HF的2型糖尿?。═2DM）患者發(fā)生心腎臨床結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)增加［4-5］。西班牙的一項(xiàng)回顧性研究中發(fā)現(xiàn)T2DM合并HF患者的住院期間死亡風(fēng)險(xiǎn)和心腎臨床結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)均顯著增加［6］。目前臨床上采用以“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）/血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）/血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（ARNI）、醛固酮受體拮抗劑、β-受體阻滯劑”為主的“金三角”藥物治療HF，但HF患者的再住院率、死亡率仍然很高。2019年DAPA-HF研究結(jié)果重磅發(fā)布，國內(nèi)外指南相繼更新，達(dá)格列凈被正式列入HF標(biāo)準(zhǔn)治療，推動(dòng)HF治療由“金三角”轉(zhuǎn)向“新四聯(lián)”，為HF的治療增加了新的選擇［7］。

達(dá)格列凈作為鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抑制劑（SGLT2i）的代表藥物，已證實(shí)其具有獨(dú)立于降糖作用之外的心血管保護(hù)作用?！?021年歐洲心臟病學(xué)會(huì)急慢性心力衰竭診斷與治療指南》［7］已明確推薦將SGLT2i（達(dá)格列凈、恩格列凈）用于HF的治療。CURTAIN等［8］研究表明在射血分?jǐn)?shù)減少的心力衰竭（HFrEF）患者的常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用達(dá)格列凈可降低患者發(fā)生嚴(yán)重室性心律失常、心臟驟停和猝死的風(fēng)險(xiǎn)。LIN等［9］研究表明達(dá)格列凈能夠抑制心肌纖維化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善血流動(dòng)力學(xué)。王慧等［10］進(jìn)行的關(guān)于SGLT2i治療HF療效及安全性的Meta分析表明，SGLT2i尤其是達(dá)格列凈可提高HFrEF患者的生存率，且安全性較好。上述證據(jù)均表明達(dá)格列凈具有較好的心血管保護(hù)作用，但其改善HF預(yù)后的作用機(jī)制尚未完全闡明。已有研究表明，微小RNA（miRNA）可以調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，在心肌細(xì)胞損傷、凋亡、心肌纖維化等方面發(fā)揮著重要作用［11-12］。既往研究表明慢性心力衰竭（CHF）患者血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平升高，并且隨著心功能好轉(zhuǎn)，其表達(dá)水平降低［13］。但達(dá)格列凈是否通過調(diào)控miRNA-423-5p表達(dá)而發(fā)揮改善心功能的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。故本研究納入T2DM合并CHF患者，觀察達(dá)格列凈對心功能的改善作用及其與miRNA-423-5p水平的相關(guān)性，進(jìn)一步探索達(dá)格列凈改善HF預(yù)后的作用機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2021-04-01至2021-11-30就診于解放軍第九六〇醫(yī)院的T2DM合并CHF患者50例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～80歲；（2）CHF診斷符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018年》［14］標(biāo)準(zhǔn)，即HF病程≥3個(gè)月，紐約心臟病協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)，且左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜40%；（3）T2DM診斷符合《中國2型糖尿病防治指南（2020年）》［15］標(biāo)準(zhǔn)，存在典型的糖尿病癥狀，隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FBG）≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L或糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%，且T2DM病程≥3個(gè)月；（4）入組前未服用過SGLT2i；（5）簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性失代償HF者；（2）1型糖尿病者；（3）嚴(yán)重心律失常、急性心肌梗死、瓣膜病、嚴(yán)重肺心病、肥厚型心肌病者；（4）低血壓、反復(fù)低血糖發(fā)作者；（5）嚴(yán)重肝、腎功能不全者；（6）嚴(yán)重感染性疾病、血液透析、惡性疾病患者；（7）妊娠期及哺乳期婦女。另納入同一時(shí)期于本院健康體檢的心功能正常者25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者18～80歲；（2）無心血管系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)解放軍第九六〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)〔（2021）科研倫理審第（113）號(hào)〕，所有患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑及儀器 達(dá)格列凈片（阿斯利康，10 mg/片）；miRNA提取分離試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異上游引物由美國GeneCopoeia公司合成。微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000型）購自美國Therom Scientific公司，Light Cycle 480Ⅱ PCR擴(kuò)增儀購自瑞士Roche公司。

1.2.2 分組 將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的T2DM合并CHF患者分為達(dá)格列凈組（n=25）和對照組（n=25），達(dá)格列凈組給予達(dá)格列凈10 mg/d，對照組給予其他降糖藥物，余治療原則相同，治療6個(gè)月。健康體檢心功能正常者為健康人群組（n=25）。

1.2.3 資料收集 通過數(shù)字病歷系統(tǒng)收集患者的基本資料，包括年齡、性別、吸煙史（定義為連續(xù)或累計(jì)吸煙時(shí)長≥6個(gè)月，吸煙量≥1支/d）、高血壓史（定義為臨床診斷明確、服用或未服用降壓藥物）、血壓水平、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、血脂〔總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）〕、血糖（FBG、HbA1c）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酐（Cr）、氨基末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）、NYHA心功能分級(jí)、心臟彩超〔LVEF、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、每搏輸出量（SV）、左心室短軸縮短率（LVFS）〕、合并用藥情況。合并用藥包括利尿劑（呋塞米片、螺內(nèi)酯片）、β-受體阻滯劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）抑制劑（ACEI，ARB）、硝酸酯類藥物、血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑、抗血小板藥物、曲美他嗪；并留取血液標(biāo)本進(jìn)行miRNA-423-5p的檢測。資料收集由兩位心內(nèi)科醫(yī)師獨(dú)立完成，并進(jìn)行交叉核對，確保信息的準(zhǔn)確性及真實(shí)性。

1.2.4 隨訪 以納入患者入組后首次服用達(dá)格列凈的時(shí)間為隨訪起點(diǎn)，隨訪觀察6個(gè)月。治療4周時(shí)進(jìn)行門診隨訪，收集患者心功能指標(biāo)及miRNA-423-5p的結(jié)果。治療6個(gè)月時(shí)進(jìn)行門診隨訪，收集患者心功能指標(biāo)、血壓水平、ALT、AST、Cr。

1.2.5 血漿樣本的收集、分離及儲(chǔ)存 分別于患者入院后第2天清晨和健康體檢者體檢時(shí)采集空腹肘靜脈血4 ml，置于抗凝管中，于4 ℃條件下3 000 rpm離心10 min（離心半徑15 cm），收集上清液。將上清液等量分裝后保存于-80 ℃冰箱中備用。T2DM合并CHF患者于治療4周后再次采集肘靜脈血4 ml，如前方法處理。

1.2.6 血漿總RNA的提取 將凍存的血漿樣本在室溫下解凍，4 ℃條件下15 000 rpm/min離心5 min，轉(zhuǎn)移200 μl上清液至新的RNase-Free EP管中。按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，以RNase-Free水作為空白對照進(jìn)行調(diào)零，1.9＜OD260/OD280＜2.1說明RNA純度良好。選取質(zhì)量好的標(biāo)本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.7 檢測血漿miRNA-423-5p水平 血漿miRNA-423-5p水平檢測采用反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR法。按照試劑盒說明書進(jìn)行3'末端加多聚A尾及反轉(zhuǎn)錄。將得到的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液作為模板，以U6作為內(nèi)參，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。miRNA-423-5p的相對表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，采用配對t檢驗(yàn)比較組內(nèi)干預(yù)前后的指標(biāo)變化；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，采用配對秩和檢驗(yàn)比較組內(nèi)干預(yù)前后的指標(biāo)變化；計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析探究miRNA-423-5p表達(dá)水平與患者心功能指標(biāo)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 3組研究對象年齡、性別、吸煙史、高血壓、收縮壓、舒張壓、BMI、TC、LDL-C、HDL-C、TG、Cr比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；達(dá)格列凈組與對照組患者NYHA心功能分級(jí)、利尿劑使用情況、其他藥物使用情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 3組間一般資料的比較Table 1 Comparison of general data between three groups

2.2 對照組與達(dá)格列凈組干預(yù)4周、干預(yù)6個(gè)月心功能指標(biāo)的比較 干預(yù)6個(gè)月達(dá)格列凈組患者LVEF、SV、LVFS高于對照組，LVEDD低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組干預(yù)4周、干預(yù)6個(gè)月LVEDD較同組干預(yù)前降低，LVEF、SV、LVFS較同組干預(yù)前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組與達(dá)格列凈組干預(yù)前后心功能指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of cardiac function indices between control group and agliazine group before and after intervention

2.3 干預(yù)4周NT-proBNP與miRNA-423-5p水平比較干預(yù)4周達(dá)格列凈組NT-proBNP、miRNA-423-5p水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組干預(yù)后NT-proBNP、miRNA-423-5p水平較同組干預(yù)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 對照組與達(dá)格列凈組干預(yù)4周NT-proBNP、miRNA-423-5p水平的比較Table 3 Comparison of NT-proBNP and miRNA-423-5p levels between control group and dapagliflozin group after four weeks of intervention

2.4 干預(yù)4周miRNA-423-5p表達(dá)水平與NT-proBNP水平、LVEF的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平與NT-proBNP水平呈正相關(guān)（rs=0.609，P＜0.05），與LVEF呈負(fù)相關(guān)（r=-0.406，P＜0.05）。

2.5 達(dá)格列凈組干預(yù)前與干預(yù)6個(gè)月血壓及肝腎功能指標(biāo)的比較 達(dá)格列凈組患者干預(yù)后收縮壓、舒張壓較干預(yù)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)后ALT、AST、Cr與干預(yù)前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 達(dá)格列凈組干預(yù)前與干預(yù)6個(gè)月后血壓及肝腎功能指標(biāo)比較Table 4 Levels of blood pressure，and liver and kidney function indices in dagagliflozin group before treatment and after six months of treatment

3 討論

HF的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，發(fā)病早期交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，RAAS激活發(fā)揮代償作用以維持正常的心臟輸出，但隨著病情進(jìn)展逐漸出現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷、心肌纖維化、心室重構(gòu)等不可逆轉(zhuǎn)的心臟結(jié)構(gòu)變化［1］。隨著社會(huì)進(jìn)步發(fā)展，糖尿病患者數(shù)量不斷增加，臨床上糖尿病與HF多合并發(fā)生，二者相互促進(jìn)并彼此增加疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。2019年DAPA-HF研究重磅發(fā)布，國內(nèi)外指南相繼更新，達(dá)格列凈被正式列入HF標(biāo)準(zhǔn)治療［7］。

DAPA-HF研究入選伴或不伴T2DM的HFrEF患者4 744例，以HF加重或心血管死亡作為主要終點(diǎn)事件，經(jīng)過18.2個(gè)月的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈可減少26%的HF患者死亡等不良事件風(fēng)險(xiǎn)［16］。相關(guān)研究表明，達(dá)格列凈具有利尿、降糖降壓、促進(jìn)酮體生成、增加血紅蛋白水平等作用，但其改善HF預(yù)后的具體機(jī)制尚不明確［17］。劉海浪等［18］研究發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈可以明顯下調(diào)HF大鼠心臟miRNA-671的表達(dá)水平，改善心功能。達(dá)格列凈通過影響miRNA的表達(dá)來發(fā)揮其改善心功能的作用有待進(jìn)一步研究。

miRNA是一類長20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在人體生長、發(fā)育的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要作用。miRNA不僅可在疾病的某些特定階段特異性表達(dá)，還可通過調(diào)控基因表達(dá)，在心肌細(xì)胞損傷、凋亡、纖維化及血管生成等病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［11-12］。近年國外研究表明，miRNA-423-5p在HF患者中的表達(dá)水平升高，并且隨著HF的發(fā)展而出現(xiàn)變化，與LVEF及NT-proBNP水平有一定的相關(guān)性［19-21］。既往研究表明，HF患者血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平上調(diào)，并且其診斷CHF具有良好的特異度和靈敏度［22］。但達(dá)格列凈對miRNA-423-5p表達(dá)的調(diào)控作用及其與心功能改善的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。

本研究納入T2DM合并CHF患者，研究達(dá)格列凈對其血漿miRNA-423-5p表達(dá)的影響及與心功能之間的相關(guān)性，進(jìn)一步明確達(dá)格列凈改善心功能的作用機(jī)制。本研究中達(dá)格列凈組與對照組患者基線一般資料匹配，排除相關(guān)臨床干預(yù)因素對研究結(jié)果的影響。治療前達(dá)格列凈組與對照組患者心功能及血漿miRNA-423-5p的表達(dá)水平無明顯差異，排除基線水平差異可能對結(jié)果產(chǎn)生的影響。T2DM合并CHF患者在常規(guī)治療藥物基礎(chǔ)上加用達(dá)格列凈治療4周后，對照組與達(dá)格列凈組NT-proBNP及血漿miRNA-423-5p的表達(dá)水平均明顯下降，同時(shí)與對照組相比，達(dá)格列凈組NT-proBNP及血漿miRNA-423-5p的表達(dá)水平下降更為明顯，且血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平與NT-proBNP水平呈正相關(guān)。治療4周后，達(dá)格列凈組及對照組患者左心室收縮功能改善，且血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平與LVEF呈負(fù)相關(guān)。治療6個(gè)月后，與對照組相比，達(dá)格列凈組左心室收縮功能改善更為顯著。本研究結(jié)果明確了血漿miRNA-423-5p的表達(dá)水平對HF診斷的意義，并證明達(dá)格列凈可改善T2DM合并CHF患者的心功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)控血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平有關(guān)，為達(dá)格列凈改善心功能、治療HF的機(jī)制研究提供了新的方向。

本研究存在以下局限性：本研究觀察病例數(shù)較少，有待繼續(xù)擴(kuò)大病例數(shù)量增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性。周詠梅等［23］的研究表明磷脂酰肌醇3-激酶通路可能在miRNA-423-5p參與的HF發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，下一步可針對此信號(hào)通路行進(jìn)一步機(jī)制研究。未來的研究可繼續(xù)擴(kuò)大研究病例數(shù)量并針對miRNA-423-5p的下游靶標(biāo)和其他相關(guān)miRNA進(jìn)行臨床試驗(yàn)及基礎(chǔ)研究，在分子水平上明確達(dá)格列凈改善HF患者預(yù)后的作用機(jī)制，以期有助于HF的診斷及治療。

綜上所述，達(dá)格列凈可改善T2DM并發(fā)CHF患者的心功能，降低NT-proBNP及LVEDD，提高LVEF、SV、LVFS，其作用機(jī)制可能與調(diào)控血漿miRNA-423-5p表達(dá)水平有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)：陳瑞敏、談紅負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思、研究的設(shè)計(jì)及可行性分析；劉放、陳英劍負(fù)責(zé)研究的實(shí)施；劉放、韓淑芳、蘇叢叢負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳瑞敏負(fù)責(zé)結(jié)果的分析與解釋、論文撰寫；談紅負(fù)責(zé)論文修訂、文章的質(zhì)量控制及審校，監(jiān)督管理，對文章整體負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。