褐牙鲆卵黃原蛋白免疫膠體金技術(shù)的開(kāi)發(fā)及其在環(huán)境雌激素檢測(cè)中的應(yīng)用?

滕哈燕，張振忠，汝少?lài)?guó)，王 軍

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

卵黃原蛋白(Vitellogenin, Vtg)是一種雌激素特異性蛋白，通常只存在于卵黃生成期的雌魚(yú)體內(nèi)，雄魚(yú)或幼魚(yú)只有在外源雌激素的刺激下才能產(chǎn)生該蛋白[1]。鑒于該特性，Vtg被廣泛用作檢測(cè)環(huán)境雌激素污染的生物標(biāo)志物。通過(guò)測(cè)定雄魚(yú)或幼魚(yú)體內(nèi)Vtg的含量可以有效地指示水環(huán)境的雌激素污染狀況[2]。如Sun等[3]以日本蝦虎魚(yú)(Acanthogobiusflavimanus)體內(nèi)的Vtg含量評(píng)價(jià)了日本沿岸海水的雌激素污染水平；Zhang等[4]利用褐牙鲆Vtg指標(biāo)評(píng)價(jià)了乙炔雌二醇的雌激素活性。目前，Vtg的檢測(cè)多采用Western blot、ELISA與電化學(xué)傳感器等免疫學(xué)方法[5-6]。這些方法雖然具有靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、需要特殊的設(shè)備與試劑，并且只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開(kāi)展，滿足不了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。為快速評(píng)估海洋環(huán)境雌激素的污染狀況，有必要開(kāi)發(fā)一種適用于野外魚(yú)類(lèi)的Vtg快速檢測(cè)技術(shù)。

免疫膠體金試紙條是目前最常用的即時(shí)檢測(cè)工具。該試紙條以條狀纖維材料為固相載體，借助毛細(xì)管的吸附作用，使樣品在層析材料上移動(dòng)，樣品中的待測(cè)物質(zhì)與試紙條的抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而出現(xiàn)顏色變化，從而獲得直觀的測(cè)試結(jié)果[7-8]。免疫膠體金試紙條在無(wú)需額外試劑和設(shè)備的條件下即可快速完成檢測(cè)，非常適用于野外檢測(cè)工作的開(kāi)展。如Selvarajan等[9]建立了可用于香蕉片花葉病毒檢測(cè)的膠體金試紙條，并用于該病毒的田間檢測(cè)工作。目前，已經(jīng)建立了團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)和銅色吸口魚(yú)(Moxostomahubbsi)等淡水魚(yú)類(lèi)的Vtg膠體金試紙條，但是這兩種試紙條的檢出限分別為10和0.6 μg·mL-1，并不能滿足環(huán)境雌激素當(dāng)量為ng·L-1級(jí)別的野外檢測(cè)需求，亟需開(kāi)發(fā)更為靈敏的Vtg膠體金試紙條。

本研究以中國(guó)近海常見(jiàn)魚(yú)種褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)為受試生物，利用高特異性、高親和力的單克隆抗體與金納米顆粒偶聯(lián)開(kāi)發(fā)了褐牙鲆Vtg的免疫膠體金試紙條。在對(duì)其特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了其用于測(cè)定3種常見(jiàn)雌激素類(lèi)污染物對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)血漿Vtg的誘導(dǎo)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法用于環(huán)境雌激素活性檢測(cè)的可靠性，以期為中國(guó)海洋環(huán)境雌激素的快速檢測(cè)提供簡(jiǎn)單、可靠的工具。

1 材料與方法

1.1 卵黃原蛋白的純化與抗體制備

褐牙鲆Vtg抗原的純化和抗體制備工作參照Z(yǔ)hang等[10]描述的方法。首先，利用凝膠過(guò)濾層析與離子交換層析相結(jié)合的方法從17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)誘導(dǎo)的褐牙鲆血漿中純化獲得Vtg蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和糖、磷、脂特異性染色鑒定后透析，并測(cè)定蛋白濃度。隨后，利用純化的Vtg腹腔注射小鼠，免疫3次后取血液，經(jīng)離心獲得褐牙鲆Vtg多克隆抗血清；取脾臟細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)至少3次篩選出穩(wěn)定的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系，獲得褐牙鲆Vtg的單克隆抗體。利用Protein G親和層析柱純化對(duì)制備的Vtg單/多克隆抗體進(jìn)行純化，測(cè)定濃度后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 膠體金溶液的制備

根據(jù)Liu等[11]的方法制備膠體金溶液。將100 mL 0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰后，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.6 mL，溶液由灰色轉(zhuǎn)為酒紅色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱10 min。待溶液冷卻后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，將制備好的膠體金溶液進(jìn)行紫外光譜掃描(450～650 nm)和透射電鏡分析。

1.3 膠體金-單克隆抗體的復(fù)合物制備

使用絮凝法確定膠體金標(biāo)記的最佳抗體濃度和K2CO3的量：首先，向1 mL膠體金溶液中加入12 μL 0.2 mol·L-1的K2CO3溶液(過(guò)量)后，分別加入1～64 μg褐牙鲆卵黃原蛋白單克隆抗體，震蕩30 min后，加入100 μL 10% NaCl溶液，靜置2 h后，測(cè)定580 nm下的紫外吸光值確定最佳抗體濃度；其次，向1 mL膠體金溶液中分別加入1～10 μL 0.2 mol·L-1的K2CO3溶液后，加入20 μg褐牙鲆卵黃原蛋白單克隆抗體(過(guò)量)，震蕩30 min后，加入100 μL 10% NaCl溶液，靜置2 h后觀察顏色變化；最后，將不同pH值標(biāo)記的膠體金噴涂于金標(biāo)墊，顯色后確定最佳的K2CO3溶液。

隨后根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果，向1 mL膠體金中加入最佳蛋白量和K2CO3溶液，室溫震蕩30 min后，加入10% BSA封閉30 min，12 000 r/min離心30 min后棄上清，加入100 μL復(fù)溶液重懸膠體金。

1.4 膠體金試紙條的開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

以玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊，以聚酯纖維素膜作為樣品墊，將樣品墊浸泡入樣品墊處理液中(0.02 mol/L Tris-HCl、5%蔗糖和 2%Tween-20)，烘干后備用。使用噴金劃膜儀(上海金標(biāo))將膠體金-單克隆抗體的復(fù)合物噴涂于金標(biāo)墊上，將褐牙鲆Vtg多克隆抗體和羊抗鼠lgG抗體固定于硝酸纖維素膜(Millipore, USA)作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，上述組件均置于37 ℃干燥。將干燥后的組件，按照樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜、吸水墊的順序組裝好(見(jiàn)圖1(A))，利用斬切機(jī)縱向剪切成4 mm的條狀并裝入卡殼后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?duì)膠體金試紙條T線和C線進(jìn)行優(yōu)化，將不同濃度的C線和T線包被液噴涂于硝酸纖維素膜，顯色后觀察最佳的C線和T線濃度(見(jiàn)圖1(B))。

((A)Vtg免疫膠體金結(jié)構(gòu)示意圖;(B)檢測(cè)結(jié)果:(+)陽(yáng)性, 測(cè)試線上的紅色密度與質(zhì)控線相同;(-)陰性;(×)無(wú)效。(A)Diagrammatic sketch of colloidal gold monoclonal antibody conjugate-based immunochromatographic assay for Vtg(not to scale);(B)Determination of test results:(+)positive, red color density on test line is the same as that of control line;(-)negative;(×)invalid.)

將30 μL不同稀釋濃度的褐牙鲆Vtg(1.95～1 000 ng·mL-1)滴加于樣品墊位置，15 min后觀察結(jié)果，并用Image J軟件統(tǒng)計(jì)試紙條T線位置的光密度，以建立褐牙鲆Vtg的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 膠體金試紙條穩(wěn)定性

為檢測(cè)夾心法膠體金試紙條的穩(wěn)定性，將0、20和1 000 ng·mL-1的褐牙鲆Vtg溶液分別滴加于保存了1、30和90 d的膠體金試紙條上，觀察結(jié)果。

1.6 雙酚A、雌二醇和乙炔雌二醇對(duì)褐牙鲆Vtg的誘導(dǎo)情況

采用半靜態(tài)水體暴露的方式對(duì)褐牙鲆成魚(yú)(質(zhì)量為(900±100)g, 體長(zhǎng)為(35±5)cm)進(jìn)行暴露。將褐牙鲆成魚(yú)分別暴露于1、10和100 μg·L-1的17β-雌二醇、乙炔雌二醇(Ethinylestradiol, EE2)、雙酚A(Bisphenol A, BPA)中，7 d后取血漿，在4 ℃下離心10 min，取上清，利用本研究建立的膠體金試紙條和此前建立的ELISA方法[4]檢測(cè)血漿中Vtg的含量。

2 結(jié)果

2.1 膠體金溶液的制備

紫外光譜掃描結(jié)果顯示，本研究制備的膠體金溶液最大吸收峰為521 nm，在電鏡下顆粒均勻、無(wú)聚團(tuán)現(xiàn)象，平均粒徑約為20 nm(見(jiàn)圖2)，證明已成功制備出可用于抗體標(biāo)記工作的膠體金顆粒。

圖2 膠體金的紫外可見(jiàn)光譜(A)透射電子顯微鏡結(jié)果(B)

2.2 膠體金標(biāo)記抗體的最佳PH值的優(yōu)化

使用K2CO3對(duì)膠體金溶液PH進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在加入不同量K2CO3的膠體金溶液均未發(fā)生聚沉反應(yīng)(見(jiàn)圖3(A))，隨后將這些膠體金濃縮并噴涂于金標(biāo)墊上。通過(guò)顯色觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)0.2 mol·L-1K2CO3加入量大于2 μL時(shí)，膠體金顯色開(kāi)始變淺，因此本研究選擇0.2 mol·L-1K2CO32 μL作為膠體金標(biāo)記抗體的最佳標(biāo)記條件(見(jiàn)圖3(B))。

圖3 最佳K2CO3濃度優(yōu)化后結(jié)果(A)和 K2CO3濃度對(duì)T線顏色變化的影響(B)

2.3 膠體金標(biāo)記抗體的最佳抗體量的確定

最佳抗體量的結(jié)果如圖4所示：當(dāng)加入抗體量為1～8 μg時(shí)，膠體金溶液在加入NaCl后發(fā)生聚沉現(xiàn)象。當(dāng)加入抗體量上升至16 μg時(shí)，膠體金溶液仍保留原來(lái)的顏色。測(cè)定膠體金溶液的OD580，發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗體量為16 μg時(shí)，OD值較小，且隨著抗體量的增加，OD580變化較小，證明該抗體量為最佳的抗體標(biāo)記量。

圖4 Vtg單克隆抗體濃度對(duì)膠體金穩(wěn)定性的影響(A)和抗體量?jī)?yōu)化后結(jié)果(B)

2.4 膠體金試紙條的優(yōu)化

夾心法膠體金試紙條的T線顯色強(qiáng)度隨著包被在NC膜上的褐牙鲆多克隆抗體濃度(0.05～0.8 mg·mL-1)增大而增強(qiáng)(見(jiàn)圖5)。然而，當(dāng)T線處Vtg多克隆抗體濃度達(dá)到1.0 mg·mL-1時(shí)，反而導(dǎo)致C線顏色變?nèi)?。因此?.8 mg·mL-1anti-Vtg多克隆抗體為T(mén)線最佳包被濃度。

圖5 T線處最佳抗Vtg多克隆抗體濃度

夾心法膠體金試紙條C線顯色強(qiáng)度隨著羊抗鼠lgG濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)抗體濃度升高至8 mg·mL-1時(shí)，膠體金試紙條C線顯色效果最好(見(jiàn)圖6)，可以用于構(gòu)建膠體金試紙條。

圖6 C線處最佳羊抗鼠lgG濃度

2.5 夾心法膠體金試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以0.8 mg·mL-1褐牙鲆Vtg多克隆抗體為T(mén)線，以8 mg·mL-1羊抗鼠lgG為C線建立的夾心法膠體金試紙條靈敏度較高。經(jīng)過(guò)Image J軟件分析發(fā)現(xiàn)，該條件下制備的膠體金試紙條工作范圍為15.7～1 000 ng·mL-1(R2=0.982 9), 肉眼檢出限為7.8 ng·mL-1(見(jiàn)圖7)。

圖7 使用膠體金試紙條檢測(cè)不同濃度Vtg標(biāo)準(zhǔn)溶液的肉眼觀察結(jié)果(A)和使用Image J軟件分析T線處的光密度定量結(jié)果(B)

2.6 夾心法膠體金試紙條的穩(wěn)定性

用存放1、30和90 d的膠體金試紙條檢測(cè)含有0、20和1 000 ng·mL-1的抗原稀釋液，結(jié)果分別為陰性(見(jiàn)圖8(A))、弱陽(yáng)性(見(jiàn)圖8(B))和陽(yáng)性(見(jiàn)圖8(C))，3個(gè)批次制備的夾心法膠體金試紙條顯色結(jié)果并無(wú)明顯差異。這證明本研究建立的膠體金試紙條檢測(cè)的結(jié)果穩(wěn)定性較強(qiáng)。

(A: 0 ng·mL-1 Vtg; B: 20 ng·mL-1 Vtg; C: 1 000 ng·mL-1 Vtg)

2.7 三種常見(jiàn)環(huán)境雌激素對(duì)褐牙鲆Vtg的誘導(dǎo)情況

利用膠體金試紙條檢測(cè)雙酚A(BPA)、雌二醇(E2)和乙炔基雌二醇(EE2)暴露后的褐牙鲆血漿發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組中未檢測(cè)到Vtg的產(chǎn)生(見(jiàn)圖9(A));BPA和E2組中Vtg含量較少,T線顯色較淺(見(jiàn)圖9(B)、(C));EE2組中Vtg含量較高，T線顯色清晰(見(jiàn)圖9(D))。通過(guò)Image J軟件定量分析發(fā)現(xiàn)BPA、E2、EE2處理組Vtg含量分別為(149.26±8.23)、(161.34±8.96)和(2 697.26±35.30)ng·mL-1(見(jiàn)圖10)，與Zhang等[12]建立的電化學(xué)傳感器和ELISA的定量結(jié)果相一致。

((A)對(duì)照組。(A)Control group.)

(代表差異極顯著，P<0.01。 indecates that the difference is very significant, P<0.01.)

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

本研究以粒徑為20 nm的膠體金作為標(biāo)記物制備了快速檢測(cè)褐牙鲆Vtg的膠體金試紙條。該試紙條以Vtg生物標(biāo)志物為檢測(cè)對(duì)象，可有效彌補(bǔ)氣質(zhì)聯(lián)用和高效液相色譜等化學(xué)分析方法無(wú)法反應(yīng)環(huán)境中雌激素活性的不足[13-14]。同時(shí)，該試紙條同重組酵母檢測(cè)法[15]、酵母雙雜交法[16]和新型菌株法[17]相比，有效節(jié)省了細(xì)胞培養(yǎng)的繁瑣步驟。目前，最常用的Vtg定量方法為ELISA方法[4,10,18]，該方法包括包被、洗滌、孵育和顯色等流程，至少需要14 h才能完成Vtg的檢測(cè)[19]。相比之下，本研究開(kāi)發(fā)的膠體金試紙條可在15 min之內(nèi)完成樣品檢測(cè)，縮減了檢測(cè)時(shí)間[20]。此外，與目前的商品化ELISA試劑盒相比[21]，該試紙條成本更為低廉，無(wú)需借助精密儀器，更適用于野外即時(shí)檢測(cè)工作。

3.2 檢測(cè)靈敏度

膠體金試紙條主要分為競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法[22]。本研究采用夾心法制備膠體金試紙條，利用抗體對(duì)抗原進(jìn)行2次選擇，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[23]。同時(shí)，為了提高試紙條的靈敏度，本研究使用具有較高親和力的褐牙鲆Vtg單克隆抗體作為標(biāo)記抗體，并對(duì)標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化。研究表明，T線和C線處抗體的濃度對(duì)試紙條的構(gòu)建至關(guān)重要，過(guò)高的抗體濃度可能會(huì)導(dǎo)致抗原的阻滯，而過(guò)低的抗體濃度會(huì)降低試紙條的靈敏度[24]。本研究對(duì)T線和C線抗體濃度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的膠體金試紙條檢測(cè)范圍為15.7～1 000 ng·mL-1，明顯優(yōu)于鱈魚(yú)(Gadusmorhua, 300～87 200 ng·mL-1)和綠背鰈(Rhombosoleatapirine, 160～20 000 ng·mL-1)的Vtg ELISA[25-26]。同Maltais等[27]建立的銅色吸口魚(yú)(Moxostomahubbsi)的Vtg膠體金試紙條檢測(cè)范圍(80～600 ng·mL-1)相近。該試紙條的視覺(jué)檢出限為7.8 ng·mL-1，比楊方星等[28]建立的團(tuán)頭魴Vtg膠體金試紙條檢出限低了至少3個(gè)數(shù)量級(jí)，這表明本研究建立的膠體金試紙條具有良好的檢測(cè)性能。

3.3 檢測(cè)方法的實(shí)用性

為了驗(yàn)證建立的膠體金試紙條的可靠性，本研究分別選擇了具有弱雌激素效應(yīng)的BPA、以及典型雌激素E2和EE2暴露成年雄性褐牙鲆。利用膠體金試紙條測(cè)定暴露21 d后褐牙鲆體內(nèi)的Vtg含量，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與ELISA的測(cè)定結(jié)果相近，證明本研究建立的膠體金試紙條具有較高的準(zhǔn)確性[4]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)E2濃度低至1 μg·L-1時(shí)，利用本研究建立的膠體金試紙條仍能有效的檢測(cè)到Vtg的產(chǎn)生，這同馬淑偉等[19]建立的金魚(yú)Vtg ELISA相近，進(jìn)一步證明本研究建立的膠體金試紙條具有較高的靈敏度。此外，將保存30和90 d的膠體金試紙條進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與制備1 d的膠體金試紙條并無(wú)明顯區(qū)別，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。因此，本研究建立的膠體金試紙條可以用于環(huán)境雌激素活性的快速檢測(cè)。

3.4 結(jié)語(yǔ)

本研究利用膠體金顆粒和Vtg單/多克隆抗體制備了褐牙鲆Vtg的夾心法免疫膠體金試紙條。通過(guò)對(duì)膠體金標(biāo)記條件和T線、C線濃度進(jìn)行優(yōu)化后，該試紙條的檢測(cè)范圍為15.7～1 000 ng·mL-1，檢出限為7.8 ng·mL-1，與目前常用的Vtg ELISA方法檢測(cè)性能相近。本研究開(kāi)發(fā)的膠體金試紙條可在15 min之內(nèi)完成樣品檢測(cè)，使用非常便捷，為海洋環(huán)境雌激素活性的快速檢測(cè)提供了一種可靠工具。