牙鲆TAK1基因的表達分析及免疫功能探究?

李恒順，司 瑜，王宣剛，曲江波，王志剛，劉金相,2,3，張全啟,2,3，于海洋??

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.中國海洋大學三亞海洋研究院 海南省熱帶水產種質重點實驗室，海南 三亞 572000；3.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

轉化生長因子β激活激酶1(Transforming growth factor β-activated kinase 1, TAK1)又稱絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7, MAP3K7)，屬于絲氨酸/蘇氨酸(Serine/threonine)蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的重要成員[1]。作為細胞內的關鍵信號分子，TAK1基因可以響應外界各種刺激信號，參與調節(jié)多種細胞信號轉導過程[2-3]。TAK1基因于1995年首次在轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路中被發(fā)現(xiàn)，最初被鑒定為TGF-β信號通路中激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的關鍵調節(jié)因子，可被TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)激活[4]。隨后的研究表明，TAK1也是免疫信號傳導和促炎細胞因子通路中的關鍵調節(jié)蛋白，可被多種免疫刺激信號分子激活，包括白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、B和T細胞受體(BCR和TCR)配體以及 Toll 樣受體(TLR)配體(LPS、病毒ssRNA、dsRNA和DNA等)[3,5]。TAK1通過激活多種信號通路(如TGF-β/BMP、Wnt/Fz、JNK和NF-κB通路等)，在先天性和適應性免疫反應、炎癥反應、神經褶皺形態(tài)發(fā)生、血管發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[6-8]。其中，關于TAK1對促炎和先天免疫信號通路的調節(jié)作用已被廣泛研究。當細胞受到外界病原體等刺激后，位于上游的TRAF2和TRAF6通過形成K63連接的多聚泛素鏈來誘導TAK1的激活，隨后激活的TAK1 通過分別磷酸化激活IκB激酶(IKK)復合物和MAPKs(ERK、JNK、p38 MAPK)來介導核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)轉錄因子的激活，使NF-κB和AP-1轉錄因子從細胞質轉移至細胞核中，從而激活下游促炎細胞因子基因(TNF-α、IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)等)的轉錄表達[3,5,9]。同樣，部分硬骨魚中的研究也表明TAK1具有一定的免疫功能。如Zhao F等發(fā)現(xiàn)TAK1參與了草魚(Ctenopharyngodonidella)抵抗小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染的先天免疫防御過程[10]；Li Y W等克隆鑒定了斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)TAK1基因，并發(fā)現(xiàn)其對TLR信號通路具有負調控作用[11]；Jang J H等發(fā)現(xiàn)在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)RTH-149細胞中敲降TAK1能夠顯著阻斷由LPS誘導的p38 MAPK和JNK的磷酸化，并可顯著下調由LPS誘導的MAPKs和NF-κB下游炎癥細胞因子基因的表達[12]。

牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬硬骨魚綱鰈形目牙鲆科牙鲆屬，是中國重要的海水經濟養(yǎng)殖物種，近年來高密度的集約化養(yǎng)殖使得牙鲆易受細菌、病毒、寄生蟲等病原體的感染，嚴重阻礙了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[13-15]。遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)屬革蘭氏陰性胞內寄生致病菌，是一種牙鲆養(yǎng)殖過程中常見的致病菌，能夠引起牙鲆的腹水病和出血性敗血癥，嚴重危害牙鲆的健康生存[16-18]。與哺乳動物不同，作為變溫、低等脊椎動物，先天免疫系統(tǒng)在硬骨魚免疫應答過程中發(fā)揮著主要作用[19-21]。因此在基因層面對牙鲆的免疫系統(tǒng)和免疫反應機制進行深入研究，可以針對不同類型的病原體制定出相應的有效對策，避免因藥物濫用而導致耐藥菌出現(xiàn)、魚制品中抗生素殘留和水體環(huán)境污染等不良后果[22]，這將有助于牙鲆疾病的進一步防治，減少養(yǎng)殖過程中的經濟損失。

本研究以牙鲆為研究對象，鑒定克隆了牙鲆TAK1基因(PoTAK1)，對其序列特征、同源性和系統(tǒng)進化關系進行了分析；通過qRT-PCR檢測了PoTAK1在健康牙鲆各組織的分布情況；進行了牙鲆鰓細胞系體外免疫刺激實驗和成體牙鲆體內攻毒實驗，并通過qRT-PCR檢測了PoTAK1在刺激后的表達變化情況；通過亞細胞定位檢測了PoTAK1在細胞中的表達位置；通過雙螢光素酶報告實驗探究了PoTAK1對MAPK通路下游AP-1轉錄因子的調控作用；最后通過體外免疫調節(jié)檢測實驗探究了過表達PoTAK1對AP-1下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子轉錄表達的影響。本研究為更好地理解PoTAK1在牙鲆抵御病原體感染時發(fā)揮的免疫反應機制提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗中所用牙鲆由海陽市黃海水產有限公司提供，體長320～420 mm，體重500～700 g。實驗前，將上述牙鲆置于海水中馴養(yǎng)一周，馴養(yǎng)期間保持水溫18～20 ℃，pH 7.9～8.1，鹽度28～30，光周期12 h光照12 h黑暗(12L∶12D)，氨氮濃度(0.13 ± 0.05)mg/L，溶解氧濃度(7.95 ± 0.50)mg/L。每天用商業(yè)飼料投喂2次，每隔一日換水一次。

本實驗中所用遲緩愛德華氏菌由中國水產科學研究院黃海水產研究所贈予。實驗前將該菌株在LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數生長期。

本實驗室中所用牙鲆鰓細胞系(FG9307)和HEK-293T細胞系由中國海洋大學細胞工程技術實驗室贈予。使用DMEM/F12培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1%MEM非必需氨基酸溶液)培養(yǎng)牙鲆鰓細胞系，培養(yǎng)條件為24 ℃。使用DMEM培養(yǎng)基(10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% MEM非必需氨基酸溶液)培養(yǎng)HEK-293T細胞系，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2 實驗試劑

1.3 PoTAK1基因核心片段的獲取

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensemble(http://www.ensembl.org)數據庫中檢索得到斑馬魚(Daniorerio)和半滑舌鰨(Cynoglossussemi-laevis)TAK1的核酸序列，將這些序列與本實驗室已有的牙鲆基因組和轉錄組進行本地BLAST(e值為1×10-5)，獲得牙鲆TAK1基因序列，將獲得的牙鲆TAK1基因序列與NCBI和Ensemble數據庫中牙鲆TAK1基因序列進行比較，最終確定牙鲆TAK1基因序列，隨后使用IDT(https://sg.idtdna.com/pages)在線網站設計牙鲆TAK1的特異性引物(見表1)，以牙鲆各組織混合cDNA為模板,進行PCR克隆驗證。

表1 實驗所用引物

1.4 PoTAK1基因序列分析

使用DNAMAN軟件導出PoTAK1基因的核苷酸序列與氨基酸序列對應圖。使用SignalP 4.1工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)預測PoTAK1是否存在信號肽。使用SMART在線網站(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI中的CD-Search工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測PoTAK1基因的蛋白結構域。使用Phyre2在線工具(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預測PoTAK1的蛋白質三級結構，使用PyMol軟件顯示PoTAK1的蛋白質三級結構。使用ExPASy在線網站中的ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)計算PoTAK1蛋白的分子量(Mw)和理論等電點(pI)。使用ClustalX 2.1程序將牙鲆與其他物種TAK1的氨基酸序列進行多序列比對分析(見表2)，探究不同物種中TAK1氨基酸序列的一致性。使用Muscle方法將PoTAK1與其他物種TAK1基因的氨基酸序列進行多序列比對(見表2)，然后通過MEGA7.0軟件并采用鄰接法(Neighbor-joining met-hod)構建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展值(Bootstrap)=1 000。

表2 實驗所用TAK1蛋白序列登錄號

1.5 牙鲆遲緩愛德華氏菌攻毒實驗

具體的牙鲆攻毒實驗步驟詳見本實驗室先前的報道[23]。

1.6 免疫刺激實驗

1.7 PoTAK1-EGFP-N1過表達載體構建

在PoTAK1的ORF兩端設計分別帶有EcoR Ⅰ 和SacⅡ 酶切位點的引物(見表1)。通過雙酶切獲得PoTAK1的ORF克隆片段，將其連接到pEGFP-N1質粒中，得到PoTAK1-EGFP-N1重組質粒，待轉染備用。

1.8 PoTAK1的過表達與亞細胞定位

將生長狀態(tài)良好的牙鲆鰓細胞系FG-9307接種于12孔板中，當細胞覆蓋率達到80%以上時，按照說明書步驟，使用LipofectamineTM3000轉染試劑將PoTAK1-EGFP-N1重組質粒轉染至牙鲆FG-9307鰓細胞中，同時設置轉染pEGFP-N1空載質粒對照組。轉染6 h后更換一次新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% NEAAS)，轉染48 h后，每個孔中加入DAPI(10 μg/mL)避光孵育10 min，孵育完成后，每個孔使用無菌PBS緩沖液清洗細胞3次，隨后將12孔細胞培養(yǎng)板迅速置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 雙螢光素酶報告實驗

設置空載質粒對照組：pEGFP-N1(300 ng)+ pAP1-luc(100 ng)+ pRL-TK(10 ng)和實驗組：PoTAK1-EGFP-N1(300 ng)+ pAP1-luc(100 ng)+ pRL-TK(10 ng)。將生長狀態(tài)良好的HEK-293T細胞接種于24孔板中，當細胞覆蓋率達到80%以上時，嚴格遵循說明書步驟，使用LipofectamineTM3000轉染試劑按照上述分組情況將對應的質粒共轉染至HEK-293T細胞中，轉染6 h后更換一次新鮮的DMEM培養(yǎng)基(10% FBS+1%青霉素-鏈霉素-新霉素三抗+1% NEAAS)，轉染48 h后按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega, USA)說明書的步驟進行雙螢光素酶活性檢測。

1.10 免疫調節(jié)檢測實驗

除增設空白對照組(不轉染質粒)外，其余轉染步驟與1.8中步驟相同。轉染48 h后，每孔加入TNF-α(20 ng/mL)進行免疫刺激。在24 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，收集細胞樣品，提取RNA，通過qRT-PCR檢測AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的表達變化情況。

1.11 牙鲆各組織、細胞RNA的提取及cDNA的合成

具體的RNA提取及cDNA合成實驗步驟詳見本實驗室先前的報道[24]。

1.12 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用SYBR qPCR SuperMix定量試劑盒在Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀(Roche, Basel, Switzerland)上進行qRT-PCR檢測。選擇牙鲆β-actin基因作為內參基因。qRT-PCR反應程序設定為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s(40個循環(huán))，60 ℃ 40 s，每個反應設置3個重復。根據目的基因和內參基因的Ct值并使用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，2-ΔΔCt法中相對值的設定和具體的算法可參照Livak K J等的報道[25]。本文中基因的表達變化倍數(Fold change)的計算方法為將實驗組和對照組在相應時間點的目的基因的相對表達量求比值得到基因的表達變化倍數。

1.13 數據分析

所有數據均以三個重復的平均值±標準誤(Mean±SEM)表示。所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 20.0(IBM，NY，USA)進行單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PoTAK1基因的序列分析

以牙鲆各組織混合cDNA為模板，PCR擴增獲得PoTAK1基因的ORF序列，將其與NCBI數據庫中的牙鲆TAK1序列進行比對，結果完全一致。PoTAK1的最長開放閱讀框(ORF)長為1 728 bp，編碼575個氨基酸，ExPASy中的ProtParam工具預測其蛋白分子量(Mw)約為64.33 kDa，理論等電點(pI)為6.66。SignalP 4.1工具在線預測發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白不存在信號肽。SMART在線網站和NCBI中的CD-Search工具預測PoTAK1蛋白在第27～275 aa位點存在一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域(Serine/threonine protein kinase catalytic domain, S_TKc domain)，在第499～562 aa位點存在一個卷曲螺旋區(qū)域(Coiled coil region)(見圖1)。同樣，在PoTAK1蛋白中也鑒定出與哺乳動物TAK1蛋白S_TKc結構域中一致的兩個保守的蘇氨酸殘基(Thr)和一個典型的絲氨酸殘基(Ser)，分別位于PoTAK1蛋白序列中的Thr175、Thr178和Ser183氨基酸位點(見圖1)。此外，蛋白質三級結構分析結果也顯示,在PoTAK1的N端存在一個S_TKc結構域，在C端存在一個卷曲螺旋區(qū)域(見圖2)。

(灰色陰影部分表示S_TKc結構域(27～275 aa位點)。綠色陰影部分表示卷曲螺旋區(qū)域(499～562 aa位點)。紅色字體表示保守的絲氨酸(Ser183)和蘇氨酸殘基(Thr175、Thr178)。星號表示終止密碼子。The S_TKc domain(27～275 aa)is shown in gray shadow.The coiled coil region(499～562 aa)is shown in green shadow.The conserved serine(Ser183)and threonine(Thr175, Thr178)residues are indicated by red font.The asterisk represents the stop codon.)

(藍色部分表示S_TKc結構域。橙色部分表示卷曲螺旋區(qū)域。綠色部分表示PoTAK1蛋白質的其余部位。The blue part represents the S_TKc domain.The orange part represents the coiled-coil region.The green part represents the rest of the PoTAK1 protein.)

2.2 氨基酸多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

牙鲆(P.olivaceus)的TAK1與半滑舌鰨(C.semilaevis)、斑馬魚(D.rerio)、斑點雀鱔(Lepisosteusoculatus)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、原雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)和人(Homosapiens)的TAK1的氨基酸多序列比對結果顯示，TAK1蛋白序列在各物種中具有較高的保守性。在TAK1的N端均存在一個保守的S_TKc結構域，在C端均存在一個保守的卷曲螺旋區(qū)域。此外，在S_TKc結構域中均存在兩個保守的Thr殘基和一個典型的Ser殘基(見圖3)。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示系統(tǒng)進化樹分為明顯的3枝，其中牙鲆TAK1與其他硬骨魚聚為一枝，四足類動物TAK1(人、小鼠、原雞和熱帶爪蟾)聚為一枝，而牙鲆MAP3K2作為外類群單獨為一枝，且牙鲆TAK1與半滑舌鰨TAK1在親緣關系上最接近(見圖4)。

(不同顏色陰影區(qū)表示各序列中該位置處氨基酸的保守程度。紅色星號表示保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基。藍色條表示S_TKc結構域，橙色條表示卷曲螺旋區(qū)域。The shaded regions with different colors indicate the degree of conservation of amino acids at this position in each sequence.Red asterisks indicate conserved serine and threonine residues.Blue bars indicate the S_TKc domain and orange bars indicate the coiled coil region.)

圖4 脊椎動物TAK1的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 PoTAK1基因的組織表達分析

通過qRT-PCR檢測PoTAK1基因在健康牙鲆各組織中的表達情況，如圖5所示，PoTAK1基因在各組織中均有表達，但表達水平具有一定的差異性。其中PoTAK1基因在肝臟、腦、鰓和肌肉中的表達量較高，心臟次之，在脾臟、腎臟和腸中的表達量較低。

(所有數據以三個生物學重復的平均值±標準誤表示。相同字母代表差異不顯著(p > 0.05)，不同字母代表差異顯著(p < 0.05)。All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.The same letter represents not significant difference(p > 0.05), and different letters represent significant difference(p < 0.05).)

2.4 遲緩愛德華氏菌感染牙鲆后PoTAK1基因的表達分析

本研究使用遲緩愛德華氏菌感染牙鲆成體魚后，對6個不同時間點(0、3、8、12、24和48 h)的注菌組和對照組的3個組織(脾臟、頭腎和鰓)進行了取樣，通過qRT-PCR檢測遲緩愛德華氏菌感染后牙鲆各組織中PoTAK1基因的表達量變化，結果顯示遲緩愛德華氏菌感染能引起PoTAK1基因表達量不同程度的變化。如圖6(A)所示，在脾臟中，PoTAK1的表達量呈先升高后降低趨勢，在感染后12 h達到峰值，是對照組表達量的1.67倍；如圖6(B)所示，在頭腎中，PoTAK1的表達量呈升高-降低-升高的趨勢，在感染后3和48 h出現(xiàn)2個峰值，分別是對照組表達量的1.37和1.43倍；如圖6(C)所示，在鰓中，注菌組和對照組之間PoTAK1的表達量無顯著變化。

((A)脾臟；(B)頭腎；(C)鰓。所有數據以三個生物學重復的平均值±標準誤表示。和代表差異顯著(:p < 0.05，:p < 0.01)。(A)Spleen;(B)Head kidney;(C)Gill.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates. and represent significant difference(:p < 0.05, :p < 0.01).)

2.5 免疫刺激牙鲆鰓細胞系后PoTAK1基因的表達分析

((A)PBS；(B)Poly I C；(C)TNF-α；(D)遲緩愛德華氏菌。所有數據以三個生物學重復的平均值±標準誤表示。和代表差異顯著(:p < 0.05，:p < 0.01)。(A)PBS;(B)Poly I C;(C)TNF-α;(D)E. tarda.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates. and represent significant difference(:p < 0.05, :p < 0.01).)

2.6 PoTAK1蛋白的亞細胞定位

使用激光共聚焦顯微鏡觀察轉染 pEGFP-N1空載質粒和PoTAK1-EGFP-N1重組質粒后牙鲆鰓細胞的熒光情況，結果顯示與其他脊椎動物蛋白類似，PoTAK1蛋白主要在細胞質中表達(見圖8)。

2.7 過表達PoTAK1對MAPK通路下游AP-1的轉錄調控作用

為確定PoTAK1對MAPK通路下游AP-1的轉錄調控作用，我們在HEK-293T細胞系中進行了雙螢光素酶報告實驗。結果顯示，與pEGFP-N1空載質粒對照組相比，PoTAK1-EGFP-N1重組質粒組中AP-1的螢光素酶活性顯著升高(見圖9)，表明PoTAK1的過表達能夠激活MAPK通路下游AP-1轉錄因子的活性。

(所有數據以三個生物學重復的平均值±標準誤表示。代表差異顯著(p < 0.01)。All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.represent significant difference(p < 0.01).)

2.8 過表達PoTAK1對AP-1通路下游 IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的調節(jié)作用

本研究使用牙鲆FG-9307鰓細胞系轉染PoTAK1-EGFP-N1重組質粒對PoTAK1進行過表達，如圖10(A)所示，PoTAK1-EGFP-N1重組質粒組中PoTAK1的表達量顯著高于空白對照組和pEGFP-N1空載質粒對照組，表明PoTAK1過表達成功。隨后，我們使用TNF-α(20 ng/mL)作為免疫原，對PoTAK1過表達成功的牙鲆FG-9307鰓細胞系刺激24 h后，對各對照組和實驗組的細胞進行取樣，并通過qRT-PCR檢測AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的表達量變化。結果顯示，PoTAK1的過表達使得AP-1通路下游各促炎細胞因子的表達量均有不同程度的升高，其中與空白對照組和pEGFP-N1空載質粒對照組相比，IL-1β的表達量均升高約1.50倍(見圖10(B))；IL-6的表達量分別升高61.50和123.40倍(見圖10(C))；IL-8的表達量分別升高1 532.70和55.40倍(見圖10(D))；TNF-α的表達量分別升高7.65和5.73倍(見圖10(E))。

((A)：在牙鲆鰓細胞中過表達PoTAK1后，TAK1基因的表達量變化；(B)、(C)、(D)、(E)：轉染48 h后，牙鲆鰓細胞用TNF-α(20 ng/mL)刺激24 h，通過qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達變化。所有數據以三個生物學重復的平均值±標準誤表示。相同字母表示差異不顯著(p > 0.05)，不同字母表示差異顯著(p < 0.05)。(A)：Changes of expression levels of the TAK1 gene in Japanese flounder gill cells after PoTAK1 overexpression.(B)、(C)、(D)、(E)：After transfection 48 h, the gill cells of Japanese flounder were stimulated with TNF-α(20 ng/mL)for 24 h, and the expression changes of IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α were detected by qRT-PCR.All data were shown as mean ± SEM of three biological replicates.The same letter represents not significant difference(p > 0.05), and different letters represent significant difference(p < 0.05).)

3 討論

轉化生長因子β激活激酶1(TAK1，又稱MAP3K7)屬于絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族成員，在哺乳動物中已被證明是炎癥和免疫信號通路中的關鍵調節(jié)因子[3]。有研究表明,從蒼蠅(Muscadomestica)到哺乳動物，TAK1基因在先天免疫中發(fā)揮的功能是保守的[2,8]。在哺乳動物組織中(如小鼠的小腸、結腸上皮組織、皮膚表皮組織和腎臟組織等)，TAK1基因對于多種炎癥配體的反應至關重要[8, 26-28]；而在果蠅(Drosophila)的先天免疫反應中，TAK1基因對于某些抗菌肽的表達是必需的[8,29]。在過去的幾十年里，大量有關TAK1基因的研究報道主要集中于哺乳動物,如對小鼠的研究表明，TAK1基因是介導轉錄因子AP-1激活的關鍵核心分子，并在發(fā)育、細胞存活和免疫反應等生物過程中發(fā)揮著重要作用[30-33]。然而，對于硬骨魚，尤其是牙鲆TAK1基因的結構和功能方面的研究還十分有限。因此，本研究以我國重要的海水經濟養(yǎng)殖物種——牙鲆為研究對象，對PoTAK1基因的序列特征、蛋白保守結構域、表達模式和免疫功能等進行了探究。

在哺乳動物中的研究表明，TAK1蛋白N端的S_TKc結構域能與TAB1結合激活TAK1的激酶活性，并進一步磷酸化IKKs和MAPKs[34-35]，而C端的卷曲螺旋區(qū)域能與TAB2結合，從而介導TAK1與TRAF6之間的相互作用[36]。在本研究中，通過蛋白結構域預測，我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白同樣在其N端具有一個保守的S_TKc結構域，在其C端具有一個保守的卷曲螺旋區(qū)域，提示PoTAK1蛋白可能也具有與哺乳動物TAK1類似的功能。多序列比對結果顯示，PoTAK1氨基酸序列與其他物種的一致性非常高，均在80%以上。且PoTAK1蛋白同樣具有相當保守的氨基酸殘基(Thr175、Thr178和Ser183)，這些氨基酸殘基在哺乳動物TAK1中已被證明是TAB1誘導的TAK1自激活過程中重要的自磷酸化位點[34]，提示PoTAK1可能也保留了類似的磷酸化自激活功能。此外，系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，PoTAK1與其他物種TAK1具有良好的聚類關系, PoTAK1先與半滑舌鰨TAK1聚為一小枝，再與其他硬骨魚類TAK1聚為一大枝,其原因可能是牙鲆和半滑舌鰨同屬于鲆鰈魚類，親緣關系較近。我們推測TAK1基因在進化上高度保守，其在各物種之間具有相似的結構與功能。

對人(H.sapiens)[37]、中華蜜蜂(Apisceranacerana)[38]、草魚(C.idella)[10]等物種的研究表明，TAK1廣泛表達于各組織中。類似的，在本研究中，通過qRT-PCR檢測，我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1在牙鲆各組織中均有廣泛表達，但表達水平有一定的差異性，PoTAK1在肝臟和鰓中的表達量較高，這與虹鱒(O.mykiss)[12]、梭魚(Lizahaematocheila)[39]中TAK1的組織表達情況(肝臟中的表達量較高)以及斜帶石斑魚(E.coioides)[11]中TAK1的組織表達情況(鰓中的表達量較高)類似，但與大黃魚(Larimichthyscrocea)中TAK1的組織表達情況差別較大(腎臟和脾臟中的表達量較高)[40]，這種組織表達差異可能是魚種類不同所導致的?？紤]到肝臟和鰓是硬骨魚類重要的免疫器官[41]，PoTAK1在牙鲆肝臟和鰓中的高表達提示其可能在牙鲆的先天免疫中發(fā)揮一定的作用。Qi Z T等通過qRT-PCR檢測了腹腔注射停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)后梭魚(L.haematocheila)體內脾臟、頭腎、鰓、腸等多個免疫器官中TAK1的表達變化，發(fā)現(xiàn)經停乳鏈球菌刺激后，梭魚TAK1在各免疫器官中的表達量均顯著上調，這表明TAK1可能參與了梭魚抵御細菌感染的免疫反應[39]。類似的，為了探究PoTAK1潛在的免疫功能，本研究選取了牙鲆養(yǎng)殖過程中最常見的病原菌之一——遲緩愛德華氏菌為感染源[17-18]，通過腹腔注射遲緩愛德華氏菌和qRT-PCR實驗，檢測了遲緩愛德華氏菌感染后牙鲆三種重要免疫器官脾臟、頭腎和鰓中TAK1的表達變化，結果顯示，與對照組相比，脾臟和頭腎中PoTAK1的表達量在遲緩愛德華氏菌感染后均顯著上調，這表明PoTAK1可能參與了牙鲆抵御遲緩愛德華氏菌感染的免疫反應。從整體上看，經遲緩愛德華氏菌刺激后，在脾臟中，PoTAK1的表達量呈先升高后降低的趨勢，而在頭腎中，PoTAK1的表達量呈升高-降低-升高的趨勢，PoTAK1表達模式的不同可能與各組織在免疫反應中行使的功能不同有關。在鰓中PoTAK1的表達量在感染前后無顯著變化，我們推測鰓中的PoTAK1可能在牙鲆抵抗遲緩愛德華氏菌感染過程中不發(fā)揮主要作用。

亞細胞定位有助于我們理解該基因所編碼的蛋白在細胞中存在的具體位置及其可能發(fā)揮的功能[43]。Li Y W等通過GFP綠色熒光融合蛋白法發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚(E.coioides)的TAK1蛋白主要在 HeLa 細胞的細胞質中表達[11]。類似的，在本研究中，通過在牙鲆FG-9307細胞中轉染PoTAK1-EGFP-N1融合蛋白表達質粒我們發(fā)現(xiàn)PoTAK1蛋白也主要在細胞質中表達，這表明TAK1蛋白可能在硬骨魚中具有相似的定位表達模式?？紤]到TAK1是細胞內的關鍵信號分子[4-5]，我們推測PoTAK1參與了細胞質的細胞信號轉導過程。

在哺乳動物中的研究表明，TAK1通過磷酸化激活MAPKs進而激活AP-1[30]。AP-1是MAPK信號通路下游的轉錄因子，因此AP-1的激活情況在一定程度上反映了MAPK信號通路的激活情況[44]。在本研究中，蛋白序列分析結果顯示，PoTAK1保留了與哺乳動物TAK1蛋白中相對應的保守磷酸化位點(牙鲆中為Thr169和Thr175；哺乳動物中為Thr178和Thr184)，這兩個氨基酸位點的磷酸化對于TAK1介導的AP-1的激活是必須的[33]?；谝延械奈墨I報道和結果，我們猜測PoTAK1也能夠激活AP-1。為了驗證這一猜想，我們在HEK-293T細胞中進行了雙螢光素酶報告實驗。結果顯示PoTAK1的過表達顯著激活了AP-1 螢光素酶報告質粒的活性，這表明我們的猜想正確，PoTAK1保留了哺乳動物中TAK1激活AP-1轉錄因子的功能，并提示在牙鲆中可能也是通過TAK1激活MAPK信號通路進而激活AP-1。

炎癥細胞因子是一類主要由免疫細胞分泌的小分子多肽物質，可分為促炎和抗炎細胞因子兩類，主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-18(IL-18)等。炎癥細胞因子通過與靶細胞上的受體相結合，介導和調節(jié)機體的免疫應答及炎癥反應[45-46]。作為細胞內重要的轉錄因子，AP-1可以調節(jié)脊椎動物中促炎細胞因子的表達。如Gao Y等發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的小鼠THP-1細胞中，LL202可以通過抑制AP-1的活性來抑制IL-1β、IL-6的mRNA及其蛋白的表達[47]；Ondrey F G等發(fā)現(xiàn)激活的 AP-1 能促進人頭頸部鱗狀細胞癌細胞系中IL-8的表達[48]；Smolinska M J等發(fā)現(xiàn)在LPS刺激的人原代巨噬細胞中，激活的AP-1參與了IL-6和TNF-α的表達[49]。類似的，在本研究中，為了進一步研究PoTAK1在AP-1通路中的作用，基于雙螢光素酶報告實驗結果，我們通過在牙鲆鰓細胞系FG-9307中過表達PoTAK1的方式激活AP-1，以TNF-α為免疫刺激物，隨后檢測了AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的表達變化，qRT-PCR結果顯示PoTAK1的過表達能顯著上調IL-6、IL-8和TNF-α的表達，IL-1β的表達變化雖不顯著，但與對照組相比也有1.5倍的上升，這提示PoTAK1可能通過上調IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的表達來促進牙鲆的免疫應答與炎癥反應。結合雙螢光素酶報告和免疫調節(jié)檢測實驗結果，我們推測在受到免疫刺激后，牙鲆通過PoTAK1激活MAPK信號通路從而激活AP-1，激活的AP-1通過調節(jié)其下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥細胞因子的表達來調節(jié)牙鲆的免疫應答和炎癥反應。

4 結語

本研究克隆了牙鲆PoTAK1基因，并對其序列進行了驗證。氨基酸多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，TAK1基因在各物種間高度保守；組織表達分析顯示，PoTAK1基因具有潛在的免疫功能；體內攻毒和體外免疫刺激實驗表明，PoTAK1可能在牙鲆抵御病原體侵染過程中發(fā)揮了重要作用；亞細胞定位顯示，PoTAK1為胞質蛋白，可能參與了細胞質的細胞信號轉導過程；雙螢光素酶報告和免疫調節(jié)檢測顯示，PoTAK1的過表達能夠激活MAPK通路下游AP-1轉錄因子的活性并上調AP-1通路下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎細胞因子的表達。本研究結果為進一步研究PoTAK1在牙鲆先天免疫反應所發(fā)揮的作用奠定了基礎。