忍冬苷對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能保護(hù)作用的研究

洪明奕，劉玉洲，顧應(yīng)江

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州 646699

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH），中醫(yī)又稱(chēng)出血性中風(fēng)，是指非外傷情況下腦內(nèi)血管破裂所致的腦實(shí)質(zhì)出血[1]，具有高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了身體健康[2]。在眾多引起ICH 繼發(fā)損害的因素中，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是引起繼發(fā)神經(jīng)功能損傷的重要原因之一[3]。因此，尋找并驗(yàn)證能夠特異性減輕ICH 后炎癥損害的藥物及方法，可能成為改善腦出血后神經(jīng)功能缺損這一難題的重要途徑。許多研究表明，清熱解毒中藥對(duì)于ICH 的治療發(fā)揮著積極的作用[4-5]。忍冬，別名金銀花，中醫(yī)認(rèn)為其具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、涼血止痢的功效。忍冬苷（lonicerin，LN）是一種提取自忍冬干燥枝葉的黃酮類(lèi)單體，其在抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗真菌、保肝、抗谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性等方面發(fā)揮生物學(xué)活性[6-8]。但是，對(duì)于忍冬苷在腦出血后腦損傷中是否也具有神經(jīng)保護(hù)活性，目前尚不清楚，因此本研究探討忍冬苷對(duì)ICH 大鼠模型神經(jīng)功能的保護(hù)作用及可能存在的相關(guān)機(jī)制，為忍冬苷治療腦出血的臨床應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量250～300g，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)：SCXK（川）2018-065。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審批號(hào)：SWMU20220056）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 膠原酶Ⅶ（c0773-1.5KU）（德國(guó)SIGMA 公司）；忍冬苷（成都德思特生物公司）；MyD88 兔克隆抗體、NF-κB p65 兔克隆抗體（英國(guó)Abcam 公司）；兔克隆TLR4 抗體（美國(guó)GenXspan公司）；鼠克隆β-actin 抗體（德國(guó)Merck millipore）；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海茁彩公司，批號(hào)：ZC-37624）。垂直電泳槽、DYY-6C 電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó) Bio-RAD 公司）；酶標(biāo)儀（Multlskan Mk3、賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.2 方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將72 只成年雄性SD 大鼠分為假手術(shù)組（SHAM 組，n=24）、腦出血組（ICH 組，n=24）、ICH+忍冬苷組（LN 組，n=24）。ICH 組和LN 組大鼠ICH 模型的建立參照Alharbi 等[9]的造模方法，每組大鼠以10%水合氯醛（0.4ml/100g）麻醉后標(biāo)記右側(cè)尾狀核在顱骨表面的定位穿刺點(diǎn)，微量注射器抽取2μl 膠原酶Ⅶ（0.25U/μl）垂直刺入硬腦膜后進(jìn)針6.0mm；緩慢勻速推注膠原酶，假手術(shù)組大鼠抽取2μl 生理鹽水推注入尾狀核，余下步驟參照上述ICH 模型制作過(guò)程進(jìn)行。造模后，LN 組給予腹腔注射忍冬苷10mg/kg，1 次/d[10]；SHAM 組和ICH組給予等體積磷酸鹽緩沖液腹腔注射，并于1d、3d、5d、7d 時(shí)分別從各組中選取6 只大鼠進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

①神經(jīng)功能缺損評(píng)分：1d、3d、5d、7d 時(shí)，采用Longa 評(píng)分法[11]對(duì)所有大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)估，無(wú)神經(jīng)功能缺陷：0 分；癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展：1 分；行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈：2 分；行走時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒：3 分；不能自動(dòng)行走，存在意識(shí)喪失現(xiàn)象：4 分。②腦組織病理情況：將各組大鼠斷頭處死，取術(shù)側(cè)大腦半球置于4%多聚甲醛中固定24h 后脫水、石蠟包埋切片，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，使用顯微鏡采集切片圖像。③蛋白質(zhì)表達(dá)水平：取各組大鼠血腫組織，加入蛋白裂解液，使用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白量。以蛋白量40μg 向各個(gè)孔上樣，用凝膠進(jìn)行電泳后，電轉(zhuǎn)至膜，封閉后，進(jìn)行抗體孵育，β-肌動(dòng)蛋白(1∶1000）、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體（1∶1000）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）p65 抗體（1∶1000）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體（1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶5000），室溫孵育2h，TBST 洗3 次，加入ELC 化學(xué)發(fā)光液，暗盒曝光顯影，統(tǒng)計(jì)測(cè)定蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白相對(duì)表達(dá)量作為最終的結(jié)果顯示。④腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factoralpha，TNF-α）含量：參照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行復(fù)溫、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物顯色，終止反應(yīng)后于酶標(biāo)儀450nm 的波長(zhǎng)下依次測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損Longa 評(píng)分比較

SHAM 組大鼠術(shù)后1d、3d、5d、7d 均無(wú)明顯神經(jīng)功能損害癥狀。ICH 組和LN 組在術(shù)后1d、3d、5d、7d 的Longa 評(píng)分均高于SHAM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與ICH 組比較，LN 組術(shù)后1d、3d、5d、7d 的Longa 評(píng)分均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損Longa 評(píng)分比較（，分）

表1 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損Longa 評(píng)分比較（，分）

注：與SHAM 組比較，*P<0.05；與ICH 組比較，#P<0.05

2.2 腦組織病理情況比較

HE 染色結(jié)果顯示，SHAM 組大鼠術(shù)后1d、3d、5d、7d 腦組織結(jié)構(gòu)完整清晰，神經(jīng)元形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯水腫或炎性滲出；ICH 組大鼠1d 時(shí)腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，膠質(zhì)細(xì)胞呈片狀壞死，壞死區(qū)組織水腫，染色變淺，并可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出；術(shù)后3d 時(shí)腦組織結(jié)構(gòu)較為模糊，膠質(zhì)細(xì)胞呈大片狀壞死，壞死區(qū)大量紅細(xì)胞滲出，組織水腫加重，細(xì)胞崩解，胞質(zhì)滲出，細(xì)胞核碎裂或溶解消失，且中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；5d 時(shí)腦組織結(jié)構(gòu)較模糊，部分膠質(zhì)細(xì)胞變性或壞死，壞死細(xì)胞周?chē)?jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞增生，炎性滲出及組織水腫較3d 時(shí)減輕；7d 時(shí)部分膠質(zhì)細(xì)胞空泡樣變性或壞死，可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或小膠質(zhì)細(xì)胞增生。LN 組在1d、3d、5d、7d腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、炎性滲出及組織水腫情況均較同時(shí)期ICH 組減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦組織病理比較

2.3 TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

術(shù)后1d、3d、5d、7d，ICH 組和LN 組的TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均高于SHAM 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組各時(shí)間點(diǎn)TLR4/MyD88/NF-κB 蛋白表達(dá)量

表2 3 組大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)TLR4/MyD88/NF-κB 蛋白水平比較（）

表2 3 組大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)TLR4/MyD88/NF-κB 蛋白水平比較（）

注：與SHAM 組比較，*P<0.05；與ICH 組比較，#P<0.05

2.4 TNF-α 水平比較

術(shù)后1d、3d、5d、7d，ICH 組和LN 組的TNF-α水平均高于與 SHAM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 3 組大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)TNF-α水平比較（，pg/ml）

表3 3 組大鼠腦組織各時(shí)間點(diǎn)TNF-α水平比較（，pg/ml）

注：與SHAM 組比較，*P<0.05；與ICH 組比較，#P<0.05

3 討論

本研究通過(guò)大鼠尾狀核注射膠原酶Ⅶ建立了較為穩(wěn)定的腦出血模型，很大程度上模擬了人類(lèi)腦出血的自然過(guò)程[12]。術(shù)后發(fā)現(xiàn)給予忍冬苷注射后大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于不給藥的大鼠，同時(shí)腦組織病理改變減輕，推斷忍冬苷對(duì)腦出血大鼠腦組織具有一定的保護(hù)作用。

現(xiàn)代研究表明，忍冬具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫等多種作用[13]，從忍冬中提取的水溶性多糖LJPB2 可通過(guò)清除自由基有效減輕局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)損害表現(xiàn)和減少腦梗死體積[14]。忍冬的黃酮類(lèi)活性成份木犀草素可通過(guò)調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)和抑制氧化損傷來(lái)改善阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶功能缺陷，提升海馬組織中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性，增加Bcl-2/Bax 比率，起到神經(jīng)保護(hù)作用[15]。研究顯示，忍冬甲醇提取物可抑制一氧化氮、活性氧和過(guò)氧化氫的過(guò)量產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受谷氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性[16]，還可調(diào)控NF-κB 相關(guān)的炎癥信號(hào)通路，顯著抑制由脂多糖刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、TNF-α、一氧化氮、前列腺素E2 表達(dá)[13]，表明忍冬提取物具有抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。

Toll 樣受體屬于模式識(shí)別受體的一個(gè)大家族，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，TLR4 廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[17]。當(dāng)機(jī)體受到病原體侵襲或組織發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞表面的TLR4 通過(guò)胞外域中富含亮氨酸的重復(fù)序列識(shí)別配體并與之結(jié)合，將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，募集具有銜接作用的MyD88，進(jìn)而激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associated kinases，IRAK）并使其形成磷酸化產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)一系列磷酸化、泛素化過(guò)程，將位于TLR4 信號(hào)通路下游樞紐位置的NF-κB 由靜止的抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)后轉(zhuǎn)入胞核中，上調(diào)TNF-α、IL-1β 等炎癥因子表達(dá)。已有研究證實(shí) TLR4 介導(dǎo)的信號(hào)通路，特別是TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路在參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到重要作用[18]。研究表明，ICH 大鼠腦組織中TLR4 與MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)在不同時(shí)間段（1d、3d、7d）均呈正相關(guān)，且主要在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包膜和胞質(zhì)表達(dá)，調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)于減輕ICH 后炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、減輕腦損傷具有重要意義，抑制通路相關(guān)蛋白表達(dá)可減輕腦出血后繼發(fā)炎癥反應(yīng)[19]。本研究中，ICH 組TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白在各時(shí)間點(diǎn)與相同時(shí)段SHAM 組比較呈現(xiàn)較高表達(dá)，經(jīng)過(guò)忍冬苷處理后大鼠腦組織中TLR4、MyD88、NF-κB 的表達(dá)均比相同時(shí)段ICH 組降低，表明忍冬苷可能通過(guò)下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)減輕腦出血后炎癥反應(yīng)，有效改善腦出血后神經(jīng)損傷。

TNF-α 是一種可在免疫炎癥反應(yīng)以及控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，當(dāng)腦出血后腦組織發(fā)生損傷效應(yīng)，釋放炎癥因子、血凝酶等促使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，激活NF-κB 蛋白轉(zhuǎn)錄，促使TNF-α 蛋白迅速上調(diào)，誘導(dǎo)一氧化氮產(chǎn)生損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，血腦屏障完整性遭到破壞，還引起局部腦細(xì)胞損傷壞死，促使腦水腫形成[20]。研究表明腦出血后抑制TNF-α 的過(guò)度表達(dá)有助于減輕腦出血后炎癥反應(yīng)，有效改善腦損傷[21]。本研究中忍冬苷處理大鼠4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α 均較相同時(shí)間段ICH 組低，與此前的研究結(jié)果一致。

綜上，忍冬苷可能通過(guò)下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及炎癥因子TNF-α 的過(guò)度表達(dá)起到腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用，為治療腦出血新藥的尋找提供了參考。但由于模型樣本受限，研究仍有待改進(jìn)之處，因此在未來(lái)的研究中還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行更深入的探究。