SALL4 表達(dá)水平與卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

唐佳雯，方來福，陳芳，叢玲華

寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院病理科，浙江寧波 315040

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是一組在組織病理學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子學(xué)上具有異質(zhì)性的腫瘤，是女性婦科惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由于卵巢癌癥狀的非特異性以及缺乏既定的篩查測(cè)試，導(dǎo)致75%的患者被診斷時(shí)已為晚期[2]。盡管EOC 是對(duì)化療最敏感的實(shí)體瘤之一，并且通常對(duì)順鉑/紫杉醇治療顯示出較高的初始反應(yīng)，但仍有60%晚期患者化療后5 年內(nèi)出現(xiàn)疾病進(jìn)展[3]。腫瘤進(jìn)展是由腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用協(xié)調(diào)的，闡明卵巢癌發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制，對(duì)早期診斷和治療，以改善患者的預(yù)后具有重要意義。

人類婆羅雙樹樣基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）是一種在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控發(fā)育、胚胎發(fā)生、器官發(fā)生及自我更新和多能性的保存中發(fā)揮重要作用。SALL4的表達(dá)在大多數(shù)成人組織中被沉默，而其表達(dá)在各種類型的癌癥中被重新激活，例如肺癌、胃癌等[4-5]。研究表明，SALL4 在卵巢癌細(xì)胞系和生殖細(xì)胞腫瘤中的mRNA 和蛋白質(zhì)水平高表達(dá)[6]，SALL4 的過表達(dá)可以通過靶向上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來增加癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[7]。此外，SALL4 的高表達(dá)與低生存率相關(guān)，并且已被視為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后因素[8]，這些結(jié)果均表明SALL4 與腫瘤預(yù)后相關(guān)。卵巢癌是異質(zhì)性疾病，化療獲益情況和預(yù)后也會(huì)不同，故深入了解SALL4 是否與卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)或可為該類患者的防治提供理論依據(jù)。因此，本研究通過探究SALL4 表達(dá)水平與卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確SALL4 對(duì)疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2021 年10 月于寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院進(jìn)行化療的94 例卵巢癌患者進(jìn)行隨訪，截至2022 年5 月1 日，最終89 例獲得隨訪，根據(jù)化療后是否出現(xiàn)疾病進(jìn)展分為進(jìn)展組（n=49）和無進(jìn)展組（n=40）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2018NCCN 卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實(shí)踐指南》[9]關(guān)于上皮性卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，均行根治性手術(shù)且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診；②原發(fā)性卵巢癌；③年齡18～65 歲；④未接受過其他治療；⑤未見其他部位腫瘤者；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并宮頸糜爛、宮頸炎等婦科疾病者；②合并凝血功能障礙等血液系統(tǒng)疾??；③合并免疫功能異常者；④嚴(yán)重的臟器功能障礙者；⑤預(yù)計(jì)生存期<12 個(gè)月者。本研究經(jīng)寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2021 年倫審科研第074 號(hào)），所有患者及家屬均簽訂知情同意書。

1.2 方法

收集患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、卵巢癌家族史、腫瘤位置、腫瘤直徑、FIGO分級(jí)、分化類型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、血管侵犯、周圍神經(jīng)侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、絕經(jīng)狀態(tài)等基線資料。所有患者均根據(jù)《2018 NCCN 卵巢癌包括輸卵管癌及原發(fā)性腹膜癌臨床實(shí)踐指南》[9]制定手術(shù)方案，術(shù)后根據(jù)患者病理分型予以化療，選擇紫杉醇/順鉑、紫杉醇/卡鉑、多烯紫杉醇/卡鉑、卡鉑/脂質(zhì)體阿霉素。所有患者均進(jìn)行6 個(gè)周期的化療治療。

本研究以患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展為觀察終點(diǎn)，若隨訪期間未發(fā)生終點(diǎn)事件，則以最終隨訪截止事件為觀察終點(diǎn)，為查閱住院、門診電子病歷系統(tǒng)病案記錄或電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2022 年5 月1 日。本研究嚴(yán)格參照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)選擇符合要求的患者，確保納入研究的患者資料真實(shí)可信，經(jīng)專門人員收集患者一般資料并核對(duì)是否與患者身份信息匹配，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平行雙錄入，保證數(shù)據(jù)輸入準(zhǔn)確無誤。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) ①血常規(guī)：所有患者均于化療前抽取靜脈血，記錄患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）；②腫瘤標(biāo)志物檢查：所有患者均于化療前抽取靜脈血，經(jīng)離心后取上清液，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）；③S ALL4和人附睪蛋白4（human epididymal protein 4，HE4）表達(dá)水平：腫瘤組織石蠟切片采用二甲苯進(jìn)行脫蠟至水，置于5%的雙氧水常溫孵育10min 后于磷酸鹽緩沖液孵育5min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），5%的山羊血清抗體封閉10min，滴加一抗（英國Abcam公司；批號(hào)：20 199304；濃度為1:500），4℃冰箱孵育，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），滴加二抗（北京康泰生物；批號(hào)：20 194856；濃度為1:1000），37℃孵育30min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），滴加第二代辣根酶標(biāo)記的工作液體，37℃孵育10min，蒸餾水沖洗3 次（5min/次），顯色后采用乙醇脫水、二甲苯透明、樹膠封片，鏡下觀察。染色強(qiáng)度評(píng)分如下：0 分（陰性）、1 分（弱）、2 分（中等）和3分（強(qiáng)）。染色程度根據(jù)陽性染色細(xì)胞的百分比評(píng)分：0 分（<5%）、1 分（5%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%)。最終的免疫組化染色得分=強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×數(shù)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 隨訪及化療后疾病進(jìn)展的評(píng)估 化療后隨訪觀察1 年，通過影像學(xué)檢查方法評(píng)估疾病是否進(jìn)展。完全緩解：所有可見病灶完全消失；部分緩解：病灶縮小≥30%，且無新發(fā)病灶；疾病穩(wěn)定：病灶無變化；疾病進(jìn)展：病灶增大≥20%，且出現(xiàn)新發(fā)病灶[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用R(4.0.5)和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；采用Logistic 回歸分析影響卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展的相關(guān)因素。通過受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線下面積評(píng)估SALL4、HE4、NLR 對(duì)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果

截止2022 年5 月1 日，最終89 例獲得隨訪，其中49 例（55.06%）患者疾病存在進(jìn)展，40 例（44.94%）未發(fā)生疾病進(jìn)展。

2.2 臨床資料比較

兩組CA125、SALL4、HE4、NLR 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），余下臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較

2.3 化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)單因素及多因素Logistic回歸分析

單因素 Logistic 分析顯示，SALL4、HE4、NLR 為影響卵巢癌化療后疾病進(jìn)展的相關(guān)因素，見表2。多因素Logistic 分析顯示，SALL4、HE4、NLR 為卵巢癌化療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表2 化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)單因素Logistic 回歸分析

表3 化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)多因素Logistic 回歸分析

2.4 對(duì)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線顯示，SALL4、HE4、NLR 能夠預(yù)測(cè)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。見表4、圖1。

表4 SALL4、HE4、NLR 預(yù)測(cè)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的曲線下面積比較

圖1 SALL4、HE4、NLR 對(duì)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC 曲線

3 結(jié)論

卵巢癌是婦科癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)晚期診斷和治療后復(fù)發(fā)癌癥是卵巢癌患者高死亡率的最重要原因[11]，揭示卵巢癌發(fā)病機(jī)制中涉及的分子機(jī)制可能有助于尋找卵巢癌的新生物標(biāo)志物。SALL4 是胚胎干細(xì)胞自我更新和維持多能性所必需的癌胚蛋白，在早期胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。研究顯示，恢復(fù)SALL4 表達(dá)可在各種腫瘤中檢測(cè)到并在癌癥發(fā)生中表現(xiàn)出致癌作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，SALL4 陽性與胃癌進(jìn)展相關(guān)的臨床病理參數(shù)相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后[13]。Di 等[14]發(fā)現(xiàn)SALL4高表達(dá)的早期宮頸癌患者的5 年生存率明顯低于SALL4 低表達(dá)的患者。以上研究均說明SALL4 與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。EOC 的不同組織學(xué)亞型在對(duì)治療和結(jié)果的反應(yīng)方面存在差異，術(shù)后輔助化療的預(yù)后也不同，分析卵巢癌組織內(nèi)SALL4 的水平或可有助于預(yù)測(cè)卵巢癌患者化療后疾病的進(jìn)展，為評(píng)估卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展提供一個(gè)新的生物學(xué)指標(biāo)。

最近研究表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都與腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞增殖和凋亡的失衡有關(guān)，當(dāng)細(xì)胞凋亡停止或增殖超過細(xì)胞凋亡時(shí)，腫瘤就會(huì)生長[15]，已有研究證明SALL4 對(duì)于調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[16]。Yang 等[17]發(fā)現(xiàn)SALL4 的沉默可導(dǎo)致慢性髓性白血病細(xì)胞中的細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Tan 等[18]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中的強(qiáng)制SALL4表達(dá)則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少G1 期細(xì)胞群。本研究結(jié)果顯示，SALL4 為卵巢癌化療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能是由于SALL4 的沉默抑制了細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)了G0/G1 期的細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而起到了調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞周期的作用，從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和腫瘤生長目的。另外，Sun 等[19]發(fā)現(xiàn)SALL4 可對(duì)Akt/GSK-3β 信號(hào)傳導(dǎo)和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的激活產(chǎn)生影響，起到修剪腫瘤血管并抑制腫瘤生長的作用，從而使接受化療的卵巢患者受益。此外，Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)SALL4 的沉默增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量，降低了Bcl-2 等抗凋亡因子的表達(dá)，并增加了Bax、cleaved Caspase-3 和cleaved-PARP 等促凋亡因子的表達(dá)，表明SALL4 可能在卵巢癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮抑制作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤生長，延緩疾病進(jìn)展。

HE4是一種高度敏感和特異性的卵巢癌標(biāo)志物，已通過基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)篩查確定，但其在卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的作用仍存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道HE4 可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[21]，但Kong 等[22]提出了相反的結(jié)論，表明HE4 可通過調(diào)節(jié)MAPK/PI3K/AKT 通路來抑制細(xì)胞增殖，在卵巢癌進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示HE4 為卵巢癌化療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能是由于卵巢癌組織內(nèi)HE4 可通過激活JAK/STAT3 通路促進(jìn) p-Smad3 和Snail 的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化生長因子-β 誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。另外，Li 等[23]發(fā)現(xiàn)HE4 可通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK 和基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶2 和組織蛋白酶B 的表達(dá)來影響細(xì)胞周期（G0/G1期），從而刺激卵巢癌的侵襲性細(xì)胞生長和惡性進(jìn)展。

NLR 可反映各種疾病的嚴(yán)重炎癥、危重疾病和死亡率。研究顯示，惡性腫瘤引起的全身性炎癥通常表現(xiàn)為外周血中性粒細(xì)胞增多、血小板增多和相對(duì)淋巴細(xì)胞減少，導(dǎo)致NLR 升高[24]。本研究結(jié)果與其相似，發(fā)現(xiàn)NLR 為卵巢癌化療后疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？赡苁怯捎谥行粤＜?xì)胞通過釋放一氧化氮合酶或精氨酸酶來抑制CD8+T 淋巴細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)，從而減弱免疫系統(tǒng)[25]。同時(shí)，較低的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)可能與原發(fā)性免疫缺陷的存在有關(guān)。淋巴細(xì)胞減少可能意味著淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)惡性腫瘤的免疫反應(yīng)差，因此疾病進(jìn)展的可能性增加。

為進(jìn)一步明確SALL4、HE4、NLR 與卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。本研究繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)SALL4、HE4、NLR 能夠預(yù)測(cè)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，證明SALL4、HE4、NLR 對(duì)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，本研究證實(shí)SALL4、HE4、NLR 對(duì)卵巢癌患者化療后疾病進(jìn)展過程中起重要作用，且對(duì)疾病進(jìn)展具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。但本研究仍存在不足之處，本研究的樣本量小，易出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差；另外，由于條件和時(shí)間限制，SALL4、HE4、NLR對(duì)化療后腫瘤組織的作用機(jī)制未進(jìn)行深入研究，后期需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。