慢性間歇性低氧對大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞的影響

侯光宇，溫雯，孫曉靖

1.新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院高血壓科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，新疆烏魯木齊 830028

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是由于患者在夜間睡眠過程中頻繁出現(xiàn)的上氣道完全或不完全阻塞而導致呼吸暫?；蛲饬繙p低的睡眠呼吸疾病。隨著對OSAHS 研究的深入，科學家們發(fā)現(xiàn)OSAHS 是一種被嚴重低估的慢性疾病。最近的流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，男性中重度OSAHS 的發(fā)病率為49.7%，女性為23.4%[1]。睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)（apnea-hypopnea index，AHI）是指平均每小時睡眠中的呼吸暫停及低通氣次數(shù)，目前診斷OSAHS 的金標準是多導睡眠監(jiān)測，根據(jù)監(jiān)測的AHI 值可明確診斷并對OSAHS 的嚴重程度進行分級，AHI≥30 次/h為重度，15 次/h≤AHI<30 次/h 為中度，5 次/h≤AHI<15 次/h 為輕度。

在OSAHS 引起的一系列病理變化中，以心血管系統(tǒng)病變最為嚴重，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、缺血性心肌病、心力衰竭、各種類型的心律失常[2-6]。研究顯示，睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)的慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是OSAHS 的重要特征之一，并在OSAHS 相關(guān)的并發(fā)癥中起重要作用[7-8]。CIH 的主要特點是低氧與正常氧交替出現(xiàn)，其炎癥損傷不是發(fā)生在去氧飽和階段，而是發(fā)生在再氧合階段，是OSAHS 重要的病理機制。本研究通過建立CIH 動物模型，觀察大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮的損傷情況，為OSAHS 的治療及預(yù)防并發(fā)癥提供一定的理論支持，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供10～12 周齡的雄性SD 大鼠12 只，采用抽簽法將其分為實驗組和對照組，每組各6 只。實驗動物許可證號：SCXK（新）2018-0002。在SPF 級飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)（溫度20～24℃，濕度40%～60%，12h 光-暗循環(huán)）。本實驗已通過新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院倫理委員會審批（倫理審批號：20220427-02）。

1.2 OSAHS 大鼠模型構(gòu)建

第1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)，第2 周開始每天10 點至18點將實驗組大鼠放在低氧艙內(nèi)行造模處理，低氧艙內(nèi)有氮氣和混合性空氣，氧氣濃度處于動態(tài)變化，氧氣濃度每個變化周期為4min，周期開始前90s，向艙內(nèi)充入氮氣，使氧濃度達到6%，90～120s 時將氧濃度維持在6%，120～180s 時將艙內(nèi)的混合氣體排出，使艙內(nèi)氧濃度由原來的6%恢復(fù)至21%，180～240s 時繼續(xù)保持艙內(nèi)氧濃度為21%，241s 時開始下一周期，如此循環(huán)。對照組大鼠不做低氧處理。低氧處理時間時兩組大鼠均在黑暗避光環(huán)境下，兩組大鼠的其他生活環(huán)境及飲食條件均相同。每天實驗組大鼠低氧處理時間為8h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，間歇性低氧處理4 周，共5 周[9-10]。

1.3 實驗標本取材

兩組大鼠均飼養(yǎng)5 周建模成功后取胸主動脈標本。取標本前，大鼠禁食8h，0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，將其固定于手術(shù)臺上，打開胸腔，取出胸主動脈，制作主動脈組織石蠟包埋切片，用于后期組織染色觀察。

1.4 蘇木精-伊紅染色實驗

將大鼠主動脈組織石蠟包埋切片蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）后在光鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞核及細胞排列情況，并計算病變細胞在視野中所占比例。所需實驗試劑有二甲苯、中性樹膠、無水乙醇、伊紅染液、蘇木素染液等。染色流程：將切片置于65℃恒溫箱中烘烤1h，二甲苯中浸泡脫蠟，無水酒精和蒸餾水中進行水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化后并在自來水中終止分化，在蒸餾水及無水乙醇中脫水，伊紅復(fù)染并用二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.5 原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法染色實驗

將大鼠主動脈組織石蠟包埋切片進行原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）染色后在光鏡下觀察凋亡細胞，并計算凋亡細胞在視野中所占比例。所需實驗試劑有TUNEL 凋亡檢測試劑盒-POD、DAB 顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液、3%H2O2、檸檬酸粉劑、無水乙醇、蘇木素染液、二甲苯、中性樹膠。染色流程：將切片在65℃恒溫箱中烘烤1h，二甲苯中浸泡脫蠟，無水酒精和蒸餾水中水化，磷酸鹽緩沖液中行抗原修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，切片加標記緩沖液，加入封閉液，抗體稀釋液稀釋生物素化抗地高辛抗體，DAB 顯色試劑盒顯色5～10min，自來水終止染色并用蘇木素染液復(fù)染，蒸餾水和酒精中脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。光鏡下所見病變細胞比例及細胞凋亡比例以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠主動脈組織HE 染色及TUNEL 染色結(jié)果

HE 染色后光鏡下觀察，實驗組視野中可見血管平滑肌細胞核腫脹，血管內(nèi)皮細胞肥大，排列不規(guī)則，細胞核、胞質(zhì)著色淡；對照組可見血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞排列規(guī)則、細胞核形態(tài)及染色正常，見圖1。TUNEL 染色后光鏡下觀察，實驗組視野中可見多個血管內(nèi)皮細胞核中有棕黃色顆粒（凋亡細胞）；對照組視野中偶見凋亡細胞，見圖1。

圖1 兩組大鼠主動脈組織染色結(jié)果

2.2 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較

實驗組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率均顯著高于對照組（P<0.01），見表1。

表1 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較（±s，%）

表1 兩組大鼠主動脈組織的細胞病變率及凋亡率比較（±s，%）

3 討論

臨床上根據(jù)OSAHS 患者夜間最低血氧飽和度（oxygen saturation，SaO2）水平將缺氧程度分為三度：輕度，SaO2≥85%；中度，80%≤SaO2<85%；重度，SaO2<80%。嚴重的OSAHS 呼吸暫停時間可長達1.5min，SaO2可降至50%以下。低氧艙內(nèi)氧濃度最低點（6%）時測得大鼠的SaO2在20.9%～29.7%，當氧濃度恢復(fù)至21%時，SaO2恢復(fù)至92.2%～97.4%，與OSAHS 患者的低氧情況相似，說明本實驗所采用的間歇性低氧艙可較好地模擬CIH 狀態(tài)，保證實驗的準確性。

OSAHS 患者反復(fù)發(fā)生低通氣和呼吸暫停，隨著時間積累，可導致多個器官和系統(tǒng)的病理改變。CIH引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)使體內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，可直接損傷血管內(nèi)皮，導致血管壁異常增生；CIH可反復(fù)刺激外周及中樞化學感受器，使交感神經(jīng)興奮性增高并激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，兒茶酚胺釋放增加，腎素及醛固酮分泌增加，水和鈉離子重吸收增強，血管緊張性、心輸出量增加，心肌收縮力增強；CIH 還可誘導釋放一系列炎癥因子，如內(nèi)皮素1，降低一氧化氮利用率，增加血管及組織損傷。此外，白細胞介素（interleukin）-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α 等也被證實與血管內(nèi)皮病變相關(guān)[11-12]。以上多種因素的共同作用，使動脈血壓升高，心臟后負荷增加、心輸出量減少，對心血管系統(tǒng)有負面影響[13]。患者夜間反復(fù)出現(xiàn)間歇性低氧可增加氧化應(yīng)激及激活炎癥系統(tǒng)，損傷內(nèi)皮修復(fù)功能，增加冠心病發(fā)生風險[14]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，參與OSAHS 的多種因素均可導致心血管系統(tǒng)并發(fā)癥，但CIH 導致的動脈內(nèi)皮細胞凋亡在其并發(fā)癥中起關(guān)鍵作用，CIH 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導主動脈內(nèi)皮細胞的凋亡[15]，但CIH 引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的具體機制尚不清楚。CIH 可引起氧化應(yīng)激和一系列的慢性炎癥反應(yīng)，導致血管內(nèi)皮功能受損，是動脈血管內(nèi)皮細胞病變的重要危險因素。

本實驗通過建立OSAHS 的慢性間歇性缺氧模型，模擬人體CIH 狀態(tài)，建模成功后通過HE 染色及TUNEL 染色在光鏡下觀察主動脈血管內(nèi)皮病變情況，結(jié)果實驗組大鼠的動脈血管內(nèi)皮細胞水腫明顯，細胞排列不規(guī)則，細胞核及胞質(zhì)染色淡且細胞凋亡明顯，說明實驗組血管病變較對照組嚴重。阻斷慢性間歇性缺氧狀態(tài)，對治療OSAHS 及預(yù)防OSAHS 并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。研究顯示，持續(xù)氣道正壓通氣對改善OSAHS 患者夜間間歇性缺氧狀態(tài)、預(yù)防心血管系統(tǒng)并發(fā)癥具有確切的療效[16]。由于動物模型并不能完全模擬人類OSAHS 的全部病理生理特征，實驗可能存在誤差，今后還需要結(jié)合大量的臨床病例研究，才能更好地闡明OSAHS 相關(guān)的病理生理機制，為OSAHS 患者的治療提供理論依據(jù)。

OSAHS 患者由于夜間反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停事件，使間歇性缺氧不斷發(fā)生，這種缺氧模式是OSAHS 的主要病理機制，也是與各種并發(fā)癥發(fā)生聯(lián)系的樞紐和中心環(huán)節(jié)，因此改善間歇性缺氧對控制OSAHS 病情、減少并發(fā)癥及改善預(yù)后具有十分重要的意義。