利佳膠囊干預(yù)對大鼠慢性運動疲勞產(chǎn)生的影響及其作用機制

王 碩，董 浩，劉 珊，姬衛(wèi)秀，趙云罡

慢性疲勞是一種常見生理狀態(tài)，全球大約10%～15%的人群都存在慢性疲勞。如果不對這一癥狀采取措施，將會嚴重影響人的正常生活質(zhì)量[1]。運動性疲勞是人體腦力和體力持續(xù)活動到一定階段時出現(xiàn)的一種正常生理現(xiàn)象。在體育比賽中，疲勞是影響運動員表現(xiàn)的重要因素[2]。適度的運動性疲勞對運動員運動能力的提高是有益的，但過度疲勞或疲勞恢復(fù)不及時不完全，就會造成疲勞累積，危害機體健康，導致運動能力下降。

運動性疲勞通常與現(xiàn)代生活方式引起的應(yīng)激相關(guān)，尤其是運動不足。關(guān)于運動疲勞產(chǎn)生機制的理論很多，如“內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性失調(diào)學說”、“耗竭學說”和“自由基學說”等[3]。運動時，體內(nèi)自由基生成增多，自由基可氧化蛋白質(zhì)，破壞其正常結(jié)構(gòu)，使得蛋白功能和活性受損；自由基還會氧化多不飽和游離脂肪酸，引起脂蛋白氧化，影響細胞膜流動性和通透性[4]。劇烈運動則會引起肌纖維損傷，使中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞在損傷肌肉位點聚集，引發(fā)氧化損傷[5]。通過補充營養(yǎng)物質(zhì)以降低疲勞相關(guān)生化指標變化水平、減輕疲勞程度和促進疲勞恢復(fù)、促進運動能力提高，是抗疲勞研究和應(yīng)用的重要手段。研究顯示，黃芪提取物可通過提高能量供應(yīng)和代謝物排除等途徑達到抗氧化和抗疲勞效果[6]，丹酚酸類化合物在心血管保護、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等方面具有良好效果，其中丹酚酸B抗氧化作用最強，具有良好的抗氧化損傷作用[7]。利佳膠囊是天津天士力制藥股份有限公司研發(fā)的一款抗氧化保健品，其主要成分便是丹參、黃芪、三七等。丹參成分復(fù)雜，除丹酚酸類，還包括丹參酮類、揮發(fā)油類化合物及無機元素等。研究表明，丹酚酸B還具有恢復(fù)肺氣腫大鼠運動能力，降低肺組織氧化損傷和凋亡水平的效果[8]。黃芪不僅能夠阻止機體自由基的生成，還能夠清除體內(nèi)過剩的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，并降低自由基對細胞的氧化程度，延長細胞壽命[9]。因此，我們認為，利佳膠囊可能通過降低運動引起的氧化損傷和炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生一定的抗疲勞效果，并結(jié)合研究實際，選取了血清尿素氮、游離脂肪酸濃度和血清肌酸激酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽活性等指標進行抗疲勞效果評價。

1 研究內(nèi)容與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性SD清潔級大鼠（北京維通利華，批號2016-0006）12只，體重（200±20）g，于12 h明-暗交替、室溫18～23℃、相對濕度40%～70%的動物房分籠飼養(yǎng)，喂食標準飼料，進食與飲水不作限制。

1.2 實驗分組與模型構(gòu)建

12只大鼠隨機分為對照組（Con）和利佳膠囊攝入組（L），參照Z.LIU等[10]大鼠遞增負荷運動訓練造模方案，構(gòu)建慢性運動疲勞模型。模型建立分為適應(yīng)性訓練與加強訓練兩部分，共60天。前30天，大鼠以10 m/min的速度在0坡度跑臺跑步，每三天間歇一天，使大鼠充分適應(yīng)跑步訓練。隨后進行加強訓練，具體方案如表1所示。訓練期間，利佳膠囊攝入組采用灌胃方式攝入利佳膠囊，根據(jù)廠家推薦使用劑量，以60 mg/kg體重/天（以大豆油溶解）進行灌胃，對照組給以等體積大豆油。最后一次訓練完成24 h后，大鼠以20 m/min的速度，在坡度為0的跑臺勻速跑，直至力竭，然后恢復(fù)24 h，取材檢測，評定大鼠慢性疲勞程度。力竭標準為運動末期動物不能堅持原跑速，刺激或驅(qū)趕無效，停跑后呼吸急促，神情倦怠，腹臥位，反應(yīng)遲鈍。取材時，大鼠麻醉后心尖取血，用于血清指標檢測；取肝臟和兩下肢腓腸肌，一側(cè)腓腸肌部分用于線粒體提取，另一部分經(jīng)液氮速凍后移入-80°超低溫冰箱凍存，另一側(cè)腓腸肌經(jīng)4%多聚甲醛固定后用于免疫組織學檢測。

表1 大鼠慢性運動疲勞模型訓練方案Table1 The Exercise Protocol of Chronic Fatigueon Rats

1.3 主要試劑

利佳膠囊是天津天士力制藥股份有限公司提供。氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、糖原含量檢測試劑盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）測定試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）測定試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自碧云天生物科技有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗體購自Abcam。其他相關(guān)試劑為分析純。

1.4 疲勞相關(guān)指標測定

全血離心取血清，檢測血清BUN、FFAs濃度和血清CK活性；取動物肝臟勻漿液上清檢測肝糖原含量，以評價大鼠疲勞狀態(tài)。

1.5 氧化、抗氧化相關(guān)指標測定

全血離心取血清，檢測血清CAT、GSH-Px、GSH、GSSG酶活性，并計算GSH/GSSG比值，以評價大鼠機體氧化、抗氧化水平。

1.6 線粒體指標測定

取腓腸肌，置于冰浴表面皿，加入適量線粒體提取介質(zhì)剪碎，移入勻漿管，冰浴環(huán)境下研磨數(shù)次，直至無明顯組織塊。勻漿液于4℃，離心10 min，取上清。再次于4℃，10 000 g離心10 min，取沉淀，用450 μL線粒體保存介質(zhì)重懸，即得粗制線粒體。以O(shè)xygraph-2K高分辨率細胞呼吸測量儀測定線粒體態(tài)Ⅲ呼吸（ST3）和態(tài)Ⅳ呼吸（ST4）的呼吸速率，計 算 呼 吸 控 制 率（respiratory control rate，RCR），RCR=ST3/ST4。以JC-1熒光法檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）變化。

1.7 免疫熒光檢測髓過氧化物酶表達

取腓腸肌組織以常規(guī)石蠟包埋后切片，厚度為5 μm，將含有完整組織的載玻片于37℃溫箱烘干后依次放入二甲苯2次、100%酒精2次、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精中進行脫蠟、水化處理；清水沖洗后于3%H2O2浸泡10 min，清水洗2次，檸檬酸緩沖液蒸煮3 min，冷卻至室溫，再次蒸煮冷卻后，水洗2次，PBS洗2次，血清封閉；于37℃溫箱中30 min，4℃條件一抗過夜孵育，PBS洗3次，每次5 min，37℃保溫箱30 min，37℃HRP標記二抗孵育30 min，清水沖洗后，DAPI復(fù)染0.5 min，再次清水沖洗后，依次置于70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精2次、二甲苯2次，浸泡2 min；中性樹膠封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差（M±SD）表示，采用GraphPadPrism7.0和SPSS22.0進行獨立樣本T檢驗分析，P＜0.05為統(tǒng)計學差異顯著，P＜0.01為統(tǒng)計學差異非常顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 利佳膠囊對大鼠慢性疲勞運動能力的影響

與Con組相比，L組大鼠經(jīng)過8周利佳膠囊干預(yù)后，力竭運動時間顯著延長（P＜0.05），（見圖1）。表明利佳膠囊可提高大鼠運動能力。大鼠血清和肝組織指標測試結(jié)果顯示，與Con組相比，L組慢性疲勞大鼠血清BUN水平顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)FAs和肝糖原含量均顯著增加（P＜0.01），血清CK活性無顯著性差異，表明利佳膠囊可有效減輕機體慢性疲勞的產(chǎn)生（見圖2）。

圖1 慢性疲勞大鼠力竭運動時間比較Figure1 The Exhaustive Exercise Time of Chronic Fatigue Rats

圖2 慢性疲勞大鼠力竭運動后抗疲勞指標結(jié)果Figure2 The Resultsof Anti-fatigue Indexes of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise

2.2 利佳膠囊對慢性疲勞大鼠抗氧化能力的影響

與Con組相比，L組慢性疲勞大鼠血清CAT活力、GSH-Px活力、GSH/GSSG比值均顯著升高（P＜0.01），表明利佳膠囊可有效促進慢性疲勞大鼠機體抗氧化能力（見圖3）。

圖3 慢性疲勞大鼠力竭運動后抗氧化指標結(jié)果Figure3 The Anti-oxidative Ca pacity of Chronic Fatigue Rats After Exhaust ive Exercise

2.3 利佳膠囊對慢性疲勞大鼠骨骼肌損傷的影響

與Con組相比，L組慢性疲勞大鼠骨骼肌的炎性標記物MPO熒光強度較弱，表明利佳膠囊可預(yù)防慢性運動損傷（見圖4）。

圖4 慢性疲勞大鼠力竭運動后骨骼肌MPO熒光染色結(jié)果Figure4 The Immun of luorescence Result of MPO in Gastrocnemius of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise

2.4 利佳膠囊干預(yù)組對慢性疲勞大鼠線粒體的影響

L組慢性疲勞大鼠線粒體RCR和MMP均顯著升高（P＜0.01），表明線粒體呼吸功能和膜結(jié)構(gòu)完整性得到有效保護（見圖5）。

圖5 慢性疲勞大鼠力竭運動后骨骼肌線粒體呼吸功能和線粒體膜電位結(jié)果Figure5 The Mitochondrial Respiratory and Membrane Potential Results of Chronic Fatigue Rats After Exhaustive Exercise

3 討 論

通過外源性補充抗氧化劑的方法，能起到良好的抗疲勞效果，越來越多的消費者也開始追求在飲食中添加天然抗氧化劑以達到減輕氧化損傷和抗疲勞的效果[11]。利佳膠囊在運動干預(yù)研究中還未見報道，本研究將其作為運動補劑，觀察其對大鼠慢性疲勞產(chǎn)生的影響及在抗疲勞、減輕運動損傷方面的效果，闡釋其在改善運動能力中的作用機制。

力竭運動引發(fā)的疲勞是一種極度的身體或精神疲倦、虛弱或耗竭感受[12]。力竭跑步時間是身體運動機能的綜合表現(xiàn)，不僅可以反應(yīng)機體的抗疲勞狀態(tài)，也可以反應(yīng)抗氧化應(yīng)激的能力[13]。本研究中，經(jīng)過8周利佳膠囊干預(yù)，慢性運動疲勞大鼠力竭運動時間顯著延長，表明利佳膠囊有效提高了慢性疲勞大鼠的抗疲勞水平，增強了運動能力。由此推測，利佳膠囊可能對長時間運動人員，如長跑人群，產(chǎn)生較好的提高運動能力效果。

運動疲勞的產(chǎn)生與血糖降低，能量供給不足密切相關(guān)。運動期間，血糖減少，糖原通過磷酸肌酸系統(tǒng)分解代謝為葡萄糖，葡萄糖進一步分解代謝滿足機體強烈的能量需求[14]。同時，能量代謝加強又會導致AMPK激活，以應(yīng)對AMP/ATP和ADP/ATP比率升高，促進有氧代謝和能源消耗[15-16]。在脂肪細胞中，運動誘導β腎上腺素能受體信號通路兒茶酚胺信號增強，促進糖酵解和脂類分解，以維持細胞ATP水平，并使甘油和游離脂肪酸代謝加強以保證運動機體能源需求[17]。因此，糖原儲量直接影響機體運動能力。另外，在長時間、大強度運動中，當糖脂代謝無法滿足機體需求時，骨骼肌中的蛋白質(zhì)和氨基酸開始分解參與供能，二者經(jīng)過脫氨基、轉(zhuǎn)氨基等一系列反應(yīng)，在肝臟中轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩兀瑢е卵築UN濃度升高[18]。在運動中，ADP磷酸化受限，不能快速合成ATP供能，轉(zhuǎn)化為AMP，而AMP容易發(fā)生脫氨基作用產(chǎn)生黃嘌呤核苷酸，也會使血液BUN含量增加[19]。因此，血液BUN水平與運動負荷、身體機能和疲勞程度密切相關(guān)。本研究中，經(jīng)過8周利佳膠囊干預(yù)，大鼠肝糖原和血清FFAs明顯增加，血清BUN含量顯著降低，表明利佳膠囊可能通過提高大鼠肝糖原儲備以延長糖代謝供能時間，同時可促進脂肪供能水平以減少糖原利用，起到抗疲勞和提高運動能力的作用。可見，利佳膠囊可能通過促進能量代謝，提高機體供能水平發(fā)揮抗疲勞效果，對于日常工作性身體疲勞緩解可能有較好的應(yīng)用效果。

正常生理狀態(tài)下，細胞的促氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間保持動態(tài)平衡，并調(diào)節(jié)各種信號反應(yīng)和代謝活動[20]。急性或大強度運動可通過呼吸、代謝、炎癥、免疫反應(yīng)等多種途徑誘導細胞內(nèi)活性氧水平升高，引發(fā)氧化應(yīng)激，而適當強度的運動則可以增強機體抗氧化能力，消除氧化損傷，提高身體素質(zhì)[4]。在抗氧化酶系中，CAT是過氧化物酶體的標志酶，可催化過氧化氫分解成氧和水，使機體免受過氧化氫損傷[21]。GSHPx是重要的過氧化物水解酶，能夠特異地催化GSH與活性氧反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，使有毒的過氧化物轉(zhuǎn)換為無毒的羥基化合物，保護細胞免受過氧化損傷[22]。而GSH/GSSG的比值則是體現(xiàn)機體的氧化應(yīng)激與抗氧化系統(tǒng)平衡狀態(tài)的重要指標[23]。在本研究中，利佳膠囊攝入組大鼠血清CAT、GSH-Px活性和GSH/GSSG比率均顯著升高，表明在慢性運動疲勞進程中，利佳膠囊可激活抗氧化酶體系，提高機體抗氧化能力，減輕慢性疲勞和急性運動引起的氧化應(yīng)激，起到抗疲勞效果。研究表明，丹參素在缺血再灌注損傷中能激活A(yù)kt/ERK1/2/Nrf2信號通路，清除活性氧，提高CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性，增強機體的抗氧化防御系統(tǒng)[24]。由此，利佳膠囊可能作為日常補劑，在抗氧化、抗衰老、慢病治療等方面有較好的應(yīng)用前景。

疲勞狀態(tài)下，機體運動能力下降，則容易引起運動損傷。肌酸激酶同工酶CK-MM是肌肉特異性酶，可催化磷酸肌酸和ADP之間的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)換，生成ATP和肌酸，在能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮和ATP再生中有重要作用[25]。MPO是由中性粒細胞、單核細胞和某些組織的巨噬細胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，是評價組織氧化損傷的重要指標[26]。本研究中，利佳膠囊攝入組大鼠血清CK活性較對照組無顯著性差異，但MPO免疫熒光結(jié)果顯示，利佳膠囊攝入組大鼠骨骼肌MPO熒光強度明顯較弱，因此，可以認為，利佳膠囊可在一定程度上減弱慢性運動疲勞致骨骼肌損傷程度，減輕炎癥反應(yīng)。

線粒體是細胞能量主要來源，在運動過程中調(diào)節(jié)細胞ATP供能、活性氧產(chǎn)生、鈣信號等多種生命活動，維持機體正常功能。鈣超載、線粒體膜電位下降、氧化應(yīng)激等刺激可促使線粒體膜電位開放，當線粒體膜通透性發(fā)生變化時，線粒體內(nèi)膜通透性增強，氫離子等可通過內(nèi)膜進入線粒體，消除質(zhì)子電化學梯度，抑制ATP的產(chǎn)生[27]。在本研究中，利佳膠囊攝入組大鼠骨骼肌線粒體RCR和MMP顯著高于對照組，說明經(jīng)過8周干預(yù)，利佳膠囊有效增強了慢性運動疲勞大鼠骨骼肌線粒體呼吸能力，保護了線粒體功能，保證了機體供能水平，提高運動能力。

在本研究中，我們關(guān)注的是慢性疲勞大鼠在力竭運動后的疲勞緩解狀態(tài)，在實驗分組上相對較為單一，后期將考慮增加單純慢性疲勞鼠的機體機能狀態(tài)變化和急性力竭運動后即刻機能變化，從而觀察多種運動狀態(tài)下的干預(yù)效果。在疲勞/抗疲勞研究中，肌肉力量下降程度是最為直觀的疲勞判定指標之一，而在研究過程中由于實驗條件有限，并未檢測大鼠下肢肌群及肌纖維收縮力量變化，在今后相關(guān)研究中將增加肌力指標的測試，以便提供更加全面的結(jié)果。另外，本研究在探討利佳膠囊緩解運動疲勞中的抗氧化效果時，未直接檢測骨骼肌活性氧變化情況，只檢測了氧化/抗氧化酶的變化，后期在相關(guān)研究中可以增加這一指標，獲得更為直觀的效果。

綜上，利佳膠囊可有效提高大鼠力竭運動能力，并可通過提高大鼠能量代謝水平和抗氧化、抗損傷水平起到抗疲勞效果。提示利佳膠囊可能作為運動補劑，提高長時間、大強度運動人員運動能力；也可能作為日常營養(yǎng)補充劑，在改善工作性疲勞、提高機體抗氧化、抗衰老水平及慢病治療中具有一定的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

利佳膠囊可以增強大鼠骨骼肌抗氧化能力，保護線粒體功能，降低大鼠骨骼肌損傷，從而對大鼠的慢性運動性疲勞產(chǎn)生良好的抵抗效果。