發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪秀麗隱桿線蟲的降脂及抗氧化作用

嚴(yán) 靜，薛秋艷，王 旸，陳汶意，謝詩(shī)晴，江津津，黎 攀，杜 冰,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.黃埔海關(guān)后勤管理中心，廣東廣州 510730；3.廣州城市職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510405）

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活品質(zhì)不斷提高。然而，肥胖和高血脂癥的患病率正在以驚人的速度增長(zhǎng)[1]。肥胖癥是體內(nèi)脂肪、甘油三酯等過(guò)量聚集而導(dǎo)致超重和肥胖的一種代謝性疾病，而脂質(zhì)的過(guò)度積累會(huì)誘導(dǎo)許多疾病的發(fā)生發(fā)展，如高脂血癥、2型糖尿病和心血管疾病[2]?，F(xiàn)今，如何有效地預(yù)防及改善肥胖和高血脂癥是科學(xué)研究的重大難題。以運(yùn)動(dòng)與健康飲食為先導(dǎo)，再結(jié)合藥物干預(yù)，是目前最有效的治療方式。雖然臨床上用于降脂的藥物種類很多，但長(zhǎng)期使用合成類藥物具有潛在的副作用及不良反應(yīng)[3]。因此，開(kāi)發(fā)副作用小、功效顯著的功能性食品具有一定的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，谷物一直被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)功能性食品的潛在理想候選，故尋找具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝功能的天然、無(wú)毒的谷物類產(chǎn)品是目前的研究熱點(diǎn)。

米蕎是蕎麥中的優(yōu)質(zhì)品種之一，屬于苦蕎類中一年生草本植物，全國(guó)范圍內(nèi)僅在云南省西盟縣有種植，故又稱為“西盟米蕎”。西盟米蕎營(yíng)養(yǎng)豐富，有“雜糧之王”的美譽(yù)。西盟米蕎富含豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、黃酮及酚類化合物等，具有抗氧化、減肥降脂和緩解心血管疾病等功效[4]。目前，雖然以西盟米蕎為原料已開(kāi)發(fā)了米蕎茶、米蕎面條、米蕎粉等產(chǎn)品[5]，但在精深加工方面仍需加強(qiáng)。近年來(lái)，相關(guān)研究表明經(jīng)發(fā)酵處理的糧食作物的功能活性得到提高[6]。程珂[7]利用植物乳桿菌發(fā)酵大麥提取物研究其對(duì)秀麗隱桿線蟲的降脂作用，結(jié)果表明經(jīng)發(fā)酵處理的大麥提取物中的總酚及有機(jī)酸含量顯著增加，并且能顯著抑制秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)積累。課題組前期研究表明[8]，經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵處理的米蕎的總酚、黃酮、γ-氨基丁酸等活性成分顯著增加，且體外抗氧化能力提升，但暫未見(jiàn)采用秀麗隱桿線蟲模型來(lái)研究發(fā)酵米蕎降脂及抗氧化作用的相關(guān)報(bào)道。

野生型N2秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans,C. elegans）是一種多細(xì)胞模式生物，具有體積小、成本低、易于培養(yǎng)、世代周期短和基因操作容易等優(yōu)點(diǎn)[9]。秀麗隱桿線蟲是抗衰老、抗氧化等功能評(píng)價(jià)最常用的模型之一。近年來(lái)，研究表明秀麗隱桿線蟲的脂肪代謝通路明確，且與人類的脂肪代謝通路相似，可作為研究脂質(zhì)代謝的重要模式生物[10]。目前，秀麗隱桿線蟲高脂肪模型的建立主要通過(guò)向線蟲培養(yǎng)基中添加高濃度的膽固醇或糖類，但添加高濃度的膽固醇會(huì)對(duì)線蟲的產(chǎn)卵量產(chǎn)生顯著的影響[7]。因此，本文利用復(fù)合益生菌發(fā)酵米蕎，以10 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲建立高脂肪模型，初步探討發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲生理生化、降脂和抗氧化作用的影響，以期為開(kāi)發(fā)以發(fā)酵米蕎為原料的功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)，也為秀麗隱桿線蟲這一模式生物在脂質(zhì)代謝和抗氧化等方面研究提供更多科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米蕎 云南省普洱市西盟縣；產(chǎn)乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 存放于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品及功能性原料評(píng)價(jià)中心，二者菌粉按12:1進(jìn)行復(fù)配[11]為本實(shí)驗(yàn)所用的菌粉；野生型N2秀麗隱桿線蟲（C.elegans）、缺陷型大腸桿菌（E. coliOP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；奧利司他膠囊 重慶植恩藥業(yè)有限公司；胡桃醌 上海源葉生物有限公司；甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（FFA）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等生化分析試劑盒 南京建成生物工程研究所。

體式顯微鏡 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Labserv K3型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州億通分析儀器制造有限公司；DHP-600型恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；JIDI-17R微量高速冷凍離心機(jī)廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 生米蕎粉[12]：挑選顆粒大小一致、成熟飽滿的米蕎，用清水洗凈后，低溫冷凍真空干燥，研磨，過(guò)80目篩。

生米蕎發(fā)酵粉[12]：稱取0.5 g復(fù)配菌粉，于50 mL 0.9%生理鹽水中活化。取60 g米蕎于錐形瓶中，料水比1:3（g/mL），糖添加量為2%。復(fù)合菌粉按2%接種，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵3 d，發(fā)酵結(jié)束后低溫冷凍真空干燥、研磨，過(guò)80目篩。

分別稱量0.5 g生米蕎粉和發(fā)酵米蕎粉，溶于10 mL 2%二甲基亞砜（DMSO）溶液中，并與活化后的大腸桿菌OP50菌液1:9混合，使DMSO的終濃度為0.2%，且生米蕎和發(fā)酵米蕎的樣品濃度均為0.5 mg/mL。取1粒奧利司他膠囊（0.12 g），溶解于100 mL 2% DMSO溶液中，得1.2 mg/mL奧利司他溶液，并與活化后的OP50菌液1:9混合，使DMSO的終濃度為0.2%，奧利司他濃度為120 μg/mL。

1.2.2 含糖培養(yǎng)基的配制

1.2.2.1 線蟲生長(zhǎng)培養(yǎng)基（Nematode Growth Medium，NGM）的配制 稱取1.2 g氯化鈉、8 g瓊脂粉、1 g胰蛋白胨、0.08 g鏈霉素硫酸鹽于錐形瓶中，加入390 mL蒸餾水混勻密封后于滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌30 min，待培養(yǎng)液溫度降至65℃時(shí)，依次加入400 μL 1 mol/L CaCl2溶液、400 μL 1 mol/L MgSO4溶液、400 μL 5 mg/mL的膽固醇以及10 mL 1 mol/L K3PO4緩沖液。混勻后，在無(wú)菌條件下，趁熱分裝至培養(yǎng)皿中。

1.2.2.2 含10 mmol/L葡萄糖的NGM培養(yǎng)基制備參考吉鑫[13]的研究方法，略作修改。稱量0.72 g葡萄糖溶于10 mL的無(wú)菌水中，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后加入NGM正常培養(yǎng)基內(nèi)。

1.2.3 線蟲同步化 參考Lin等[14]的研究方法，略作修改。用M9緩沖液將產(chǎn)卵期線蟲從NGM培養(yǎng)基洗進(jìn)無(wú)菌EP管中，待自然沉降后，棄部分上清，留500 μL，按體積比1:1加入裂解液，渦旋震動(dòng)3～4 min，4000 r/min離心1 min，棄上清，用M9清洗沉淀2～3遍。用移液槍吸取EP管底部蟲卵滴于含有OP50的NGM培養(yǎng)基中，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48～72 h即可得到實(shí)驗(yàn)所需的L4期線蟲。

1.2.4 壽命和移動(dòng)力試驗(yàn) 線蟲分為陰性對(duì)照組（含0.2% DMSO，正常培養(yǎng)基）、高脂肪模型組（含0.2%DMSO，高糖培養(yǎng)基）、奧利司他藥物組（120 μg/mL，高糖培養(yǎng)基）、生米蕎組（0.5 mg/mL，高糖培養(yǎng)基）、發(fā)酵米蕎組（0.5 mg/mL，高糖培養(yǎng)基）。隨機(jī)挑取同期化至L4期的線蟲到各組平板上（每組3個(gè)平板，每個(gè)平板30條線蟲）。從轉(zhuǎn)移時(shí)刻起記錄各組線蟲的存活天數(shù)，每24 h轉(zhuǎn)移線蟲至對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組新板中，產(chǎn)卵期結(jié)束后可每2 d轉(zhuǎn)一次。每天記錄線蟲存活和死亡數(shù)，當(dāng)所有組別中的線蟲均死亡時(shí)，則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

做壽命試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行線蟲的移動(dòng)力試驗(yàn)。在第0、5、10、15、20 d時(shí)觀察線蟲的移動(dòng)能力。移動(dòng)力可分為三個(gè)等級(jí)為A、B、C[15]。線蟲可自主運(yùn)動(dòng)，不需觸碰刺激，記為A；線蟲必須受到觸碰刺激才會(huì)運(yùn)動(dòng)，記為B；線蟲受到觸碰刺激后只擺動(dòng)頭或尾，記為C。

1.2.5 產(chǎn)卵量試驗(yàn) 參考王鳳等[16]的研究方法，略作修改。挑取L4期線蟲至各組平板上，每板2條，每組5個(gè)板。每24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的新板中，直至產(chǎn)卵期結(jié)束。所有含蟲卵的板置于20 ℃培養(yǎng)48 h后再計(jì)數(shù)，各板孵出的子代數(shù)目之和即為該線蟲總子代數(shù)。

1.2.6 活性氧（ROS）含量測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[17]的研究方法，略作修改。挑取L4期線蟲至各組平板上，干預(yù)3 d后，再用M9緩沖液將蟲體沖洗至無(wú)菌EP管中，加入研磨珠后冷凍研磨，4000 r/min離心1 min，取上清液。同時(shí)，吸取50 μL上清液和50 μL 100 μmol/L H2DCF-DA溶液于96孔板中混勻，以H2DCF-DA溶液為對(duì)照。將96孔板放置于酶標(biāo)儀中測(cè)定熒光強(qiáng)度，發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，反應(yīng)溫度為25 ℃，每隔10 min測(cè)定一次，總反應(yīng)時(shí)間為2 h。

1.2.7 胡桃醌氧化應(yīng)激試驗(yàn) 參考李玉英等[18]的實(shí)驗(yàn)方法，略作修改。挑取L4期線蟲至各組平板上，經(jīng)樣品干預(yù)3 d后，轉(zhuǎn)移至含有500 μmol/L胡桃醌的培養(yǎng)基中，每組30條，每1 h統(tǒng)計(jì)一次線蟲存活情況，直到線蟲全部死亡為止。

1.2.8 甘油三酯和游離脂肪酸含量的測(cè)定 挑選L4期的線蟲至各組平板上，干預(yù)3 d后，用M9沖洗蟲體至無(wú)菌EP管中，采用珠磨儀破碎蟲體，4 ℃、4000 r/min離心1 min，收集上清液。根據(jù)甘油三脂和游離脂肪酸試劑盒說(shuō)明書測(cè)定線蟲體內(nèi)甘油三酯和游離脂肪酸含量。

1.2.9 抗氧化酶的測(cè)定 挑選L4期的線蟲至各組平板上，干預(yù)3 d后，轉(zhuǎn)移至EP管中，將線蟲用M9冰浴勻漿后，4 ℃、4000 r/min離心1 min，收集上清液。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定線蟲體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px酶活力和MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，并通過(guò)GraphPad Prism 8.0軟件采用one-way ANOVA分析法進(jìn)行多組間顯著性分析，采用log-rank檢驗(yàn)對(duì)生存曲線進(jìn)行顯著性分析。P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲壽命的影響

相關(guān)研究表明，高糖飲食與線蟲壽命的縮短具有一定的相關(guān)性[19]。由圖1和表1可知，與對(duì)照組相比，10 mmol/L高糖誘導(dǎo)的高脂肪線蟲的生存曲線向左移，其中平均壽命13.69 d，縮短了19.14%（P<0.01）；最大壽命23.33 d，縮短了8.57%（P<0.01），與Lee等[20]和Elena等[21]的研究結(jié)果相一致。研究表明，高脂肪線蟲的壽命降低，可能是由于機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，引起氧化損傷加劇[22]。而與高脂肪模型組相比，藥物組、生米蕎組、發(fā)酵米蕎組線蟲的生存曲線右移，最大壽命分別為25.80、29.02、30.54 d，相對(duì)壽命延長(zhǎng)率分別達(dá)10.59%、24.39%和30.90%（P<0.01），說(shuō)明在高糖誘導(dǎo)脂肪積累的情況下，攝入奧利司他、生米蕎和發(fā)酵米蕎均能延長(zhǎng)線蟲的壽命。其中，發(fā)酵米蕎組線蟲的平均壽命和最長(zhǎng)壽命均最大，與高脂肪模型組相比分別增加6.84和7.21 d（P<0.01）。研究表明，天然活性成分在一定程度上可以延長(zhǎng)線蟲壽命[23]，發(fā)酵米蕎組線蟲的壽命增加最顯著，這可能與發(fā)酵米蕎中含有豐富的活性成分如蘆丁、多酚有關(guān)。除此之外，發(fā)酵米蕎能延長(zhǎng)線蟲壽命還可能與Insulin/IGF-1信號(hào)通路有關(guān)[24]，該通路是調(diào)節(jié)線蟲壽命最重要的信號(hào)通路之一，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

表1 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲平均壽命和最長(zhǎng)壽命的影響Table 1 Effects of fermented rice buckwheat on the average and maximum life of C. elegans

圖1 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of fermented rice buckwheat on the longevity of C. elegans

2.2 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲移動(dòng)力的影響

有研究表明，線蟲衰老過(guò)程中往往伴隨著相關(guān)生理功能的衰退，所以線蟲的移動(dòng)能力與壽命有直接相關(guān)性[18]。由圖2所示，在做壽命試驗(yàn)的同時(shí)，記錄了線蟲第5、10、15和20 d的移動(dòng)能力。當(dāng)線蟲處于生命早期階段時(shí)（第5 d），對(duì)照組、高脂肪模型組、藥物組和各樣品組均有大于80%的線蟲處于在A狀態(tài)；第10 d，相比于其他組，高脂肪模型組處于A狀態(tài)線蟲的比例最低，僅為70%；在線蟲壽命晚期階段（第20 d），高脂肪模型組線蟲可自發(fā)平穩(wěn)運(yùn)動(dòng)的比例為0。在線蟲壽命晚期階段，與模型組相比，藥物組、米蕎和發(fā)酵米蕎組可自主游動(dòng)的線蟲比例分別增加了20%、22.22%和28.57%（P<0.01），且發(fā)酵米蕎組可自主游動(dòng)的線蟲比例最高。相關(guān)研究表明，移動(dòng)力代表能量消耗情況，運(yùn)動(dòng)頻率越高，能量消耗越多，脂肪的積累程度越低[25]。因此，發(fā)酵米蕎不僅可以增加高脂肪線蟲的能力消耗，減少脂質(zhì)的積累，還可以緩解高脂肪線蟲的運(yùn)動(dòng)能力因年齡的增加而下降的情況。

圖2 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.2 Effects of fermented rice buckwheat on the locomotion ability of C. elegans

2.3 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲產(chǎn)卵量的影響

線蟲的產(chǎn)卵量受環(huán)境、傳代數(shù)等多種因素的影響，線蟲通常在產(chǎn)卵期的前4 d具有很強(qiáng)的繁殖能力。由圖3A可知，線蟲的生育高峰期處在第2 d和第3 d，并且第2 d的產(chǎn)卵量最多。隨著線蟲的衰老，第5 d時(shí)基本不產(chǎn)卵。由圖3B可得，與對(duì)照組相比，高脂肪模型組線蟲的總產(chǎn)卵量下降，由341個(gè)下降至288個(gè)，下降了15.54%（P>0.05），說(shuō)明高糖應(yīng)激會(huì)對(duì)線蟲的產(chǎn)卵量產(chǎn)生一定的影響。宗華[26]研究表明10～500 mmol/L的葡萄糖誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致線蟲的生殖能力下降，可能是通過(guò)調(diào)控蛋白質(zhì)糖基化和胰島素相關(guān)通路。而與高脂肪模型組相比，藥物組、米蕎組和發(fā)酵米蕎組的線蟲產(chǎn)卵量均有所增加（P>0.05），且與對(duì)照組相接近，說(shuō)明樣品對(duì)高脂肪線蟲的繁殖能力均無(wú)抑制作用。

圖3 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵量的影響Fig.3 Effects of fermented rice buckwheat on egg production in C. elegans

2.4 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲ROS積累的影響

當(dāng)機(jī)體受到氧化損傷時(shí)（如高糖應(yīng)激）會(huì)產(chǎn)生ROS自由基，ROS自由基的過(guò)度積累會(huì)引起氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[27]。氧化應(yīng)激會(huì)引起一系列生物大分子的氧化損傷，并且參與了許多代謝疾病的發(fā)生發(fā)展，如肥胖、高脂血癥等[28]。本實(shí)驗(yàn)用H2DCF-DA分子探針檢測(cè)各組線蟲體內(nèi)ROS積累的情況。由圖4可得，隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，分子探針檢測(cè)到的ROS含量逐漸增多。與對(duì)照組相比，高脂肪模型組線蟲的ROS水平明顯升高。而經(jīng)米蕎、發(fā)酵米蕎干預(yù)后，高脂肪線蟲的ROS相對(duì)含量明顯降低，并且給予高脂肪線蟲飼喂發(fā)酵米蕎，相比于米蕎，更顯著抑制了氧化應(yīng)激狀態(tài)下線蟲體內(nèi)的ROS積累。有研究表明脂質(zhì)積累與ROS水平具有強(qiáng)相關(guān)性，減少機(jī)體的ROS水平有助于抑制脂肪沉積[29]。由此可得，發(fā)酵米蕎可以清除高脂肪線蟲體內(nèi)的自由基，緩解氧化損傷，從而減少高脂肪線蟲體內(nèi)的脂質(zhì)積累。

圖4 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effects of fermented rice buckwheat on ROS in C.elegans

2.5 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲胡桃醌氧化應(yīng)激的影響

為研究發(fā)酵米蕎對(duì)線蟲抵抗氧化應(yīng)激能力的影響，用500 μmol/L胡桃醌創(chuàng)造一個(gè)急性氧化應(yīng)激的環(huán)境。胡桃醌是強(qiáng)氧化劑，在線蟲體內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，從而引起急性氧化損傷[30]。研究結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，高脂肪模型組線蟲的生存曲線向左移，壽命由12 h縮短至10 h，說(shuō)明高糖誘導(dǎo)加以胡桃醌應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致線蟲生存能力降低。而經(jīng)藥物、米蕎和發(fā)酵米蕎干預(yù)后，高脂肪線蟲的生存曲線明顯向右移，生存時(shí)間分別增加至14、13和16 h，且發(fā)酵米蕎組線蟲的生存時(shí)間長(zhǎng)于米蕎組，說(shuō)明發(fā)酵米蕎組線蟲抵抗氧化應(yīng)激能力強(qiáng)于生米蕎組，這可能與發(fā)酵米蕎有較強(qiáng)的抗氧化活性有關(guān)[8]。王力等[31]研究表明，線蟲抵抗氧化應(yīng)激能力與機(jī)體的抗氧化能力具有一定的相關(guān)性，故發(fā)酵米蕎可能通過(guò)發(fā)揮抗氧化功效以達(dá)到增強(qiáng)線蟲抵抗氧化應(yīng)激能力的作用。綜上所述，發(fā)酵米蕎顯著增強(qiáng)了高脂肪線蟲對(duì)氧化應(yīng)激的耐受力，特別是在胡桃醌誘導(dǎo)的氧化脅迫下。

圖5 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲應(yīng)激能力的影響Fig.5 Effects of fermented rice buckwheat on the stress capacity of C. elegans

2.6 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲甘油三酯含量的影響

甘油三酯是脂肪合成的重要原料，其含量常用于評(píng)價(jià)體內(nèi)脂質(zhì)水平。甘油三酯含量降低，將會(huì)導(dǎo)致線蟲體內(nèi)的脂肪合成減少，從而達(dá)到降脂的效果[32]。由圖6所示，與對(duì)照組相比，高脂肪模型組線蟲體內(nèi)甘油三酯含量顯著增加，為2.90 mmol/g prot，增加了46.27%（P<0.01），說(shuō)明高糖誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致線蟲體內(nèi)脂肪沉積。而給予高脂肪線蟲飼喂米蕎和發(fā)酵米蕎均可顯著降低甘油三酯含量，分別降低了34.77%和56.58%（P<0.01），并且在相同劑量下發(fā)酵米蕎抑制線蟲體內(nèi)脂肪沉積的效果優(yōu)于米蕎，抑制效果與藥物組相接近。黃壯等[33]研究表明，高濃度三七醇提物可以降低線蟲體內(nèi)甘油三酯水平達(dá)到降脂的目的，與我們研究結(jié)果相類似。Qin等[34]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁可以通過(guò)降低甘油三酯含量，從而減少高脂肪線蟲的脂質(zhì)積累。之前的研究發(fā)現(xiàn)，相比未發(fā)酵的米蕎，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵處理的米蕎的生物活性成分如黃酮、多酚類化合物含量顯著增加[8]，故發(fā)酵米蕎展現(xiàn)出較好的降脂活性可能是由于黃酮類和多酚類物質(zhì)的富集。

圖6 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)甘油三酯含量的影響Fig.6 Effects of fermented rice buckwheat on triglycerides in C. elegans

2.7 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲游離脂肪酸含量的影響

為了進(jìn)一步研究發(fā)酵米蕎對(duì)線蟲脂肪沉積的影響，對(duì)線蟲體內(nèi)的游離脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定。游離脂肪酸是中性脂肪分解后的產(chǎn)物之一，其水平的升高會(huì)導(dǎo)致自由基的過(guò)度產(chǎn)生，與脂質(zhì)雙分子層相互作用，最終產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物[35]。有研究者認(rèn)為，過(guò)多的游離脂肪酸會(huì)誘導(dǎo)肥胖、高血脂癥等代謝性疾病的發(fā)生[36]。由圖7所示，游離脂肪酸的測(cè)定結(jié)果與甘油三酯結(jié)果的趨勢(shì)相一致。與對(duì)照組相比，高脂肪線蟲體內(nèi)的游離脂肪酸含量極顯著增加了231.92%（P<0.01）。而給予高脂肪線蟲飼喂米蕎和發(fā)酵米蕎均可極顯著降低游離脂肪酸含量，相較于模型組分別降低了49.54%、130.54%（P<0.01），并且發(fā)酵米蕎抑制線蟲體內(nèi)脂肪沉積的效果優(yōu)于米蕎，這可能與發(fā)酵米蕎能顯著促進(jìn)脂肪水解、抑制脂肪酸合成有關(guān)[12]。由此可得，發(fā)酵米蕎可以顯著降低高脂肪線蟲體內(nèi)游離脂肪酸的含量，減少脂肪積累。

圖7 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)游離脂肪酸含量的影響Fig.7 Effects of fermented rice buckwheat on free fatty acids in C. elegans

2.8 發(fā)酵米蕎對(duì)高脂肪線蟲抗氧化酶的影響

一個(gè)復(fù)雜的酶或非酶抗氧化防御系統(tǒng)可以清除機(jī)體內(nèi)積累過(guò)多的自由基，以維持生理穩(wěn)態(tài)[37]?？寡趸烙到y(tǒng)涉及多種酶，包括SOD、CAT和GSHPx。由圖8A～圖8C可得，與對(duì)照組相比，高脂肪模型組線蟲的SOD、CAT和GSH-Px酶活性極顯著降低，分別降低了21.90%、19.25%和45.60%（P<0.01）。相關(guān)研究表明，高糖誘導(dǎo)會(huì)使線蟲處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，使得抗氧化酶活性降低[23]，與王慧等[27]的研究結(jié)果相一致。而給予高糖誘導(dǎo)的高脂肪線蟲飼喂藥物、米蕎和發(fā)酵米蕎均能不同程度提高抗氧化酶的活性，其中發(fā)酵米蕎組線蟲的SOD、CAT和GSH-Px活性最高，相比于模型組分別增加了37.49%、83.97%和185.83%（P<0.01）。由此可得，發(fā)酵米蕎可以通過(guò)提高線蟲體內(nèi)的抗氧化酶活性來(lái)清除自由基，從而抵抗高脂肪線蟲的損傷。

圖8 發(fā)酵米蕎對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化酶的影響Fig.8 Effects of fermented rice buckwheat on antioxidant enzymes in C. elegans in vivo

MDA作為細(xì)胞中多不飽和脂肪酸過(guò)氧化的游離產(chǎn)物之一，常用于評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度和氧化應(yīng)激程度[38]。MDA的含量越高，則說(shuō)明機(jī)體氧化損傷越嚴(yán)重。由圖8D可知，高脂肪模型組線蟲的MDA含量相比于對(duì)照組極顯著增加，由5.72 nmol/mg prot增加至7.89 nmol/mg prot（P<0.01），說(shuō)明高糖誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致線蟲抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力降低。與高脂肪模型組相比，飼喂米蕎和發(fā)酵米蕎能顯著降低高脂肪線蟲體內(nèi)的MDA含量，并且發(fā)酵米蕎組降低最顯著，由7.89 nmol/mg prot下降至3.47 nmol/mg prot，下降了56.02%（P<0.01）。這可能是由于經(jīng)益生菌發(fā)酵的米蕎中含有豐富的黃酮、多酚類化合物等抗氧化成分[8]，這些成分在高脂肪線蟲體內(nèi)顯示出抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，從而減輕了氧化應(yīng)激對(duì)線蟲的損傷。綜上所述，發(fā)酵米蕎通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力和減緩氧化損傷，發(fā)揮對(duì)高脂肪線蟲的降脂作用。

3 結(jié)論

本文以高脂肪秀麗隱桿線蟲為研究對(duì)象，探討發(fā)酵米蕎的降脂及抗氧化活性。結(jié)果表明，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的米蕎可以顯著降低高脂肪模型線蟲體內(nèi)的甘油三酯和游離脂肪酸含量，從而減少脂質(zhì)積累。此外，發(fā)酵米蕎能極顯著增強(qiáng)高脂肪線蟲體內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px 抗氧化酶活性、極顯著降低MDA含量和ROS積累（P<0.01），以增強(qiáng)線蟲的抗氧化能力；并且在500 μmol/L胡桃醌誘導(dǎo)氧化應(yīng)激條件下，發(fā)酵米蕎能夠極顯著提高線蟲的存活率（P<0.01），以提高線蟲的抗逆性。由此可推斷，發(fā)酵米蕎不僅具有降低高脂肪線蟲脂肪沉積的作用，還可以對(duì)機(jī)體脂肪代謝穩(wěn)態(tài)具有一定的調(diào)節(jié)作用。發(fā)酵米蕎展現(xiàn)較好的降脂活性，可能與其含有豐富的活性成分有關(guān)，但其具體降脂機(jī)制還需進(jìn)一步研究。今后將利用相關(guān)突變體線蟲進(jìn)一步研究發(fā)酵米蕎降脂作用的分子機(jī)制。