m6A修飾在膠質瘤中的研究進展

郭巖松 李思柔 李琳 曾昭穆 白澤通 溫稀超 鄭克彬

河北大學附屬醫(yī)院神經外科（河北保定 071000）

膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)腫瘤，主要來源于神經膠質細胞，約占所有原發(fā)性腦和中樞神經系統(tǒng)腫瘤的28%，占所有惡性腫瘤的80%［1］。膠質瘤分為1～4 級，1、2 級為低級別腦膠質瘤，3、4 級為高級別腦膠質瘤，其中膠質母細胞瘤惡性程度最高，患者5 年生存率極低，目前臨床上以手術切除輔以放療、化療、電場治療等綜合療法［2-3］，但其很難徹底切除，且很容易從原發(fā)腫瘤上脫離并穿過腦組織［4］，進展快、對放化療抵抗且有較高的復發(fā)率。為了更有效地治療膠質瘤，有必要了解膠質瘤的發(fā)病機制以及分子生物學特性。

近年來，隨著特異性抗體和高通量測序的快速發(fā)展，非編碼RNA 和RNA 的轉錄后修飾已成為當前研究的活躍領域［5-6］。N6-甲基腺嘌呤（m6A）基因修飾作為分布最廣泛的RNA 修飾，在哺乳動物中也很顯著，其通過甲基轉移酶（“編寫者”）安裝、去甲基酶（“擦除者”）消除和結合蛋白（“讀取者”）識別來協(xié)調其功能［7］。m6A 修飾在包括癌癥［8］在內的生理發(fā)育和病理過程中發(fā)揮著不同的作用，隨著研究的深入，其在膠質瘤中所發(fā)揮的生物學作用和應用不斷被發(fā)現(xiàn)，令我們對膠質瘤有更進一步的認識，并為膠質瘤的治療提供新方案。

1 m6A 修飾及作用機制

m6A 修飾主要發(fā)生在共有序列RRACH（R 表示鳥苷（G）或腺苷（A），H 表示A、胞苷（C）或尿苷（U））的腺嘌呤中［9］，廣泛分布于真核生物中。m6A 修飾主要由甲基轉移酶、去甲基酶和結合蛋白調節(jié)，作為一種調節(jié)系統(tǒng)，最重要的就是其可逆性［7］。作為一種表觀遺傳學修飾，m6A 修飾通過調控基因表達在細胞中發(fā)揮生物學功能。

1.1 甲基轉移酶（“編寫者”）甲基轉移酶起“編寫者”作用，使m6A 沉積在RNA 上。m6A 甲基轉移酶復合體是一個約1 000 kDa 的完整復合體，包含甲基轉移酶樣3、14 和16（METTL3/14/16）、E3泛素連接酶CBL1（HAKAI）、鋅指CCCH 結構域13（ZC3H13）、KIAA1429（又稱VIRMA）、RNA 結合基序蛋白15 及其類似物（RBM15/15B）和Wilms 腫瘤相關蛋白（WTAP）［10-11］。METTL3 是最早發(fā)現(xiàn)的甲基轉移酶和甲基轉移酶的核心亞基，另一個關鍵酶METTL14 可與METTL3 相互作用［12］，形成一個穩(wěn)定的異源二聚體，表現(xiàn)出比單獨的METTL3 更高的m6A 安裝活性。結構和生化研究表明，METTL3與SAM 結合，METTL14 通過提供RNA 結合支架在結構上支持METTL3，從而提高其甲基化效率［13］。METTL16 是U6 剪接體小核RNA 的甲基轉移酶，SAM 同源穩(wěn)定所必需的。WTAP 是甲基轉移酶復合體的第三亞單位，在哺乳動物中與Wilms 腫瘤1蛋白結合的剪接因子，在胚胎發(fā)育中起關鍵作用。雖然WTAP 對RNA 靶標沒有催化活性，但它可以幫助METTL3-METTL14 異源二聚體定位在核斑點中，并促進m6A 沉積［14］。在哺乳動物雌性發(fā)育過程中，RBM15/15B 的缺失導致了XIST 介導的X 染色體上的基因沉默，可作為m6A 甲基轉移酶復合體的輔助因子［10］。VIRMA 招募并引導催化（METTL3/METTL14/WTAP）到m6A 甲基化的特定RNA 區(qū)域，同時HAKAI 也是組成甲基轉移酶的一部分［11］。在果蠅和小鼠中，發(fā)現(xiàn)ZC3H13 與Fl（2）d相關復合體成分相互作用，作為甲基轉移酶復合體的輔助因子，控制果蠅性別決定中m6A 的總體水平［15］。

1.2 去甲基酶（“擦除者”）去甲基酶作為“擦除者”主要參與RNA 修飾的去甲基化過程，將RNA甲基化修飾信號“擦除”。α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶B 同源物5（ALKBH5）或脂肪質量和肥胖相關蛋白（FTO）可以使m6A 去甲基化是當前所知的兩種m6A 特異性去甲基酶［16］。FTO 和ALKBH5 通過酮戊二酸和位于細胞核和細胞質中的二價鐵離子發(fā)揮作用，先氧化m6A 生成N6-羥甲基腺苷，然后轉化為N6-甲酰腺苷（F6A）。當F6A 轉變?yōu)橄佘眨ˋ）時，便完成了去甲基化過程［17］。FTO 蛋白核心區(qū)與ALKB 蛋白家族相似，但它能夠使甲基化的單鏈DNA或RNA去甲基化，正是由于其C末端獨特的長環(huán)與ALKB 家族的其他蛋白不同［18］。ALKBH5和FTO 的表達水平有所不同，在小鼠中，ALKHB5主要在睪丸和雌性卵巢中表達，相比之下，F(xiàn)TO 主要表達于大腦中，這可能與它們參與的各種生化途徑有關［17-18］。

1.3 結合蛋白（“讀取者”）結合蛋白識別和結合RNA 上的m6A 或改變RNA 的結構發(fā)揮m6A 在轉錄后基因修飾中的作用，并激活調控通路，如mRNA 降解和miRNA 加工，從而影響靶mRNAs 的表達［19-20］。結合蛋白包括YTH蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2）、異質核核糖核蛋白（HNRNPs）和胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白（IGF2BP），它們特異性地識別和結合靶RNA 中的m6A 位點［21］。大多數情況下，m6A 讀取者影響RNA 加工的分子機制，而不涉及對m6A 水平變化的調節(jié)［22］。在YTH 蛋白家族中，YTHDF1 提高了m6A 相關mRNA 的翻譯效率，YTHDF2 增強了m6A 修飾轉錄本的降解，YTHDF3通過與YTHDF1 相互作用來調節(jié)其靶RNA 的翻譯效率，并通過與YTHDF2 的協(xié)同作用來誘導RNA衰退［23-24］。

2 m6A 修飾在膠質瘤中的生物學作用

m6A 對RNA 的內部修飾被認為是自然界中最普遍和最持續(xù)的RNA 改變，m6A 相關蛋白表達水平的高低在膠質瘤中發(fā)揮不同的生物學作用，深入了解m6A 修飾在膠質瘤中的作用機制，尋找關鍵的靶基因，有助于膠質瘤的基因靶向治療。

2.1 m6A 修飾參與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展m6A 修飾不僅促進膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，而且起到抑制作用。在膠質瘤中高表達的ALKBH5，作為m6A 擦除者使靶轉錄產物G6PD 去甲基化，加強其mRNA穩(wěn)定性，促進G6PD 的翻譯，從而激活磷酸戊糖途徑，促進膠質瘤的發(fā)展［25］。此外，METTL3 通過調節(jié)關鍵癌基因或抑癌基因轉錄本部位的m6A來影響腫瘤，如在GBM 中上調的METTL3 甲基化ADAR1 并增加其蛋白水平，然后ADAR1 通過結合CDK2 起到不依賴其脫氨酶活性的促癌作用［26］。m6A 修飾相關蛋白還發(fā)揮腫瘤抑制作用，如敲除FTO顯著促進pri-miR-10a的m6A修飾，并被HNRNPA2B1 識別，通過招募DGCR8 進一步促進miRNA-10a 的成熟，從而靶向腫瘤抑制蛋白MTMR3 促進GBM 細胞的惡性進展。同時發(fā)現(xiàn)FTO 的轉錄活性可被轉錄因子SPI1 抑制，而敲除SPI1 可恢復FTO的表達，并抑制GBM 的進展［27］?？梢妋6A 修飾在膠質瘤的進展中發(fā)揮著至關重要的作用。

2.2 m6A 修飾參與膠質瘤的侵襲轉移膠質瘤具有強大的侵襲轉移能力，可浸潤鄰近組織、器官，甚至向遠處轉移，m6A 修飾調控因子的異常表達可導致其侵襲和轉移能力的改變。上皮向間充質轉化（EMT）過程使細胞具有轉移和侵襲特性，并使細胞獲得啟動轉移的能力［28］。在EMT 過程中，E-鈣黏蛋白（E-Cad，CDH1）的丟失和N-鈣粘蛋白（N-Cad，CDh2）的上調被認為是影響細胞黏附的最關鍵一步，基質金屬蛋白酶（MMPs）表達上調導致的細胞外基質（ECM）蛋白減少也是腫瘤侵襲的重要原因。TAO 等［29］實驗表明在EMT 過程中，GBM 細胞的m6A RNA 水平較對照細胞顯著下降，ALKBH5 的上調和METTL3 的下調影響GBM 細胞MMP2、CDH1、CDH2 和FN1 的水平，促進EMT 的進程，促進細胞的遷移和侵襲。此外，ALKBH5 的過表達還可以在體內加劇GBM 的EMT 進展。通過調控m6A 修飾的表達可起到抑制膠質瘤侵襲轉移的能力，為GBM 的分子靶向治療提供新的參考。

2.3 m6A 修飾參與膠質瘤的血管生成在腫瘤組織中有許多滋養(yǎng)血管，豐富的血供為其增殖提供了有力的營養(yǎng)支持，這對于低級別腫瘤向高級別轉變尤為關鍵，而且，血管生成與腫瘤惡性程度存在顯著的相關性。m6A 修飾能夠參與膠質瘤的血管生成，如在膠質瘤中依賴于METTL3 的m6A修飾增強了HOTAIRM1 的穩(wěn)定性，HOTAIRM1 通過上調IGFBP2 的表達促進膠質瘤細胞血管生成擬態(tài)（Vasculative Mimicry，VM）的形成，VM 可促進惡性腫瘤的血管生成，進而促進膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［30］。此外，研究發(fā)現(xiàn)在顱內腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中，膠質瘤干細胞m6A 修飾主要分布在新生血管周圍，并與血管周圍病理生態(tài)協(xié)同作用，介導TIME 的免疫抑制表型，同時，聚類分析顯示，m6A 與血管生成對免疫抑制有協(xié)同促進作用［31］。血管生成是膠質瘤發(fā)生、發(fā)展以及增殖的關鍵，m6A 修飾和血管生成之間的協(xié)同效應，為膠質瘤的血管靶向治療帶來新的方向。

3 m6A 修飾在膠質瘤中的應用

m6A 修飾不僅在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同的生物學作用，而且在膠質瘤的臨床治療上中扮演著重要角色，其在膠質瘤的診療、預后評估等方面都有不俗的表現(xiàn)。

3.1 m6A 修飾參與膠質瘤的診斷近些年來，隨著表觀遺傳學的研究，m6A 修飾被認為是診斷GBM 有效的生物標志物，一些表觀遺傳狀態(tài)確實解釋了GBM 的結果。多項組學研究［32］表明，炎癥水平較高、腸道微生物多樣性減少的患者血清中FTO 水平顯著降低。另一項研究［33］發(fā)現(xiàn)，外周血RNA 中的m6A 是胃腺癌的潛在診斷生物標志物。YTHDF1 作為m6A 結合蛋白，能加速m6A修飾的mRNAs 在細胞質中的翻譯，在多種人類癌癥中高度表達，被證實與癌癥預后不良密切相關，也可作為臨床診斷和治療的分子標志物［34］。因此，對于中樞神經系統(tǒng)腫瘤來說，從外周血或腦脊液中鑒定m6A 修飾可能是診斷GBM 的一種有前途的方法。

3.2 m6A 修飾參與膠質瘤的治療當前臨床上對于膠質瘤多采用手術聯(lián)合放化療、電場治療等綜合療法，但其具有很強的侵襲、轉移特性，且很難從腦中完全切除，復發(fā)是難免的。研究表明將m6A 修飾作為靶點進行基因治療能有效地抑制膠質瘤的惡性行為，從而達到治療目的。FTO 的轉錄活性可被轉錄因子SPI1 抑制，而SPI1 的轉錄活性可被SPI1 抑制劑DB2313 特異性阻斷，用該抑制劑治療可恢復內源性FTO 的表達，降低GBM 的腫瘤負荷，提示FTO 可作為GBM 一種新的治療分子靶點［27］。TANG等［35］發(fā)現(xiàn)ALKBH5基因的缺失顯著抑制膠質瘤移植瘤的生長，挽救抗腫瘤免疫反應，增加腦脊液中細胞毒性淋巴細胞和促炎細胞因子，同時顯著抑制了程序性細胞死亡配體1（PD-L1）蛋白的表達。此外，RNA 免疫沉淀測序和RNA 測序證實ZDDHC3 是ALKBH5 的直接靶標，ALKBH5缺失會損害YTHDF2 介導的ZDHHC3mRNA 的穩(wěn)定性，從而通過加速PD-L1 在膠質瘤中的降解。因此將m6A 修飾作為靶點治療，有望成為抑制膠質瘤增殖、轉移、促進其凋亡的新型方案，同時聯(lián)合放化療、電場治療有可能會有意想不到的效果。

3.3 m6A 修飾參與膠質瘤的預后評估分子靶向治療與腫瘤電場治療以及放化療聯(lián)合應用，可以改善膠質瘤患者的預后［3］，近年來發(fā)現(xiàn)m6A 修飾在膠質瘤的預后評估中發(fā)揮重要作用。研究［27］表明FTO 的表達與GBM 的惡性程度有關，但與MGMT 啟動子甲基化、年齡或性別無明顯相關性，Kaplan-Meier 生存分析顯示，F(xiàn)TO 低表達的GBM 患者預后較差，生存期短于FTO 高表達者，提示FTO可作為GBM 患者的一個潛在的預后指標。另一項研究［36］發(fā)現(xiàn)ALKBH5 的mRNA 和蛋白在膠質瘤中表達上調，且ALKBH5 的表達與膠質瘤的分級、亞型和腫瘤類型有關，COX 回歸分析顯示ALKBH5是膠質瘤患者的獨立預后因素，同時，ALKBH5 高表達的患者總生存期明顯短于ALKBH5 低表達的患者。m6A 修飾異常表達的水平可能與膠質瘤的惡性程度、分級、亞型有關，可以作為臨床上指導診治的參考指標，但其可靠性及靈敏度有待進一步提升。

4 總結與展望

膠質瘤是嚴重危害患者身心健康的中樞神經系統(tǒng)腫瘤，盡管手術輔助放化療、電場治療在今天經常被使用，但大多數患者的預后仍然很差。因此，急切需要找到新的診療方法。近些年來，在RNA 表觀遺傳學領域對m6A 修飾的研究描繪出一幅m6A 甲基化受編寫者和擦除者的調控，并通過讀取者一起參與RNA 新陳代謝的全面圖景。甲基化過低或過高都有可能導致基因的異常表達，從而在疾病中發(fā)揮不同的作用。m6A 修飾不僅在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同的生物學作用，而且在膠質瘤的診療、預后評估等方面都有著不俗的表現(xiàn)。但當前階段，我們對于m6A 修飾的研究還不夠深入，還不能闡明m6A 調控基因表達的基本機制、不清楚m6A 作為調控系統(tǒng)的本質，以及m6A沉積與其他細胞過程相互的作用。相信隨著我們不斷的研究，作為表觀遺傳學領域的一顆冉冉升起的新星，m6A 修飾有望在膠質瘤的治療中得到廣泛應用。