基于RhoA/Rho信號(hào)通路探討產(chǎn)婦子宮平滑肌組織Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平與產(chǎn)后出血的關(guān)系

田 凌，呂曉蕊，閻艷彩

宮縮乏力是產(chǎn)后出血的重要原因，產(chǎn)后出血嚴(yán)重或者搶救不及時(shí)可增加孕產(chǎn)婦死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]。一般認(rèn)為宮縮乏力性產(chǎn)后出血與子宮肌細(xì)胞收縮功能異常密切相關(guān)，而調(diào)控子宮平滑肌收縮的相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)異常則是引起產(chǎn)后出血的關(guān)鍵因素[2]。RhoA/Rho信號(hào)通路屬于鈣敏化調(diào)節(jié)通路，大量研究已證實(shí)其在調(diào)控平滑肌收縮中發(fā)揮重要作用，可抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性，以及誘導(dǎo)肌球蛋白輕鏈的磷酸化，從而維持或者促進(jìn)平滑肌的收縮功能[3]。AKTAS等[4]研究發(fā)現(xiàn)抑制RhoA/Rho信號(hào)通路后，則可有效抑制縮宮素誘導(dǎo)的子宮平滑肌收縮力，表明RhoA/Rho信號(hào)通路參與了平滑肌的收縮調(diào)控。CPI-17(Thr38)、中電導(dǎo)鈣激活鉀通道(KCa3.1)、Krüppel樣因子4(Krüppel-likefactors,KLF4)均是維持平滑肌組織功能的重要蛋白，KLF4可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，增加其的增殖和遷移能力，以及促進(jìn)損傷修復(fù)，Thr38屬于鈣敏化調(diào)節(jié)因子，也可抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性等[5-7]。目前，關(guān)于Thr38、KCa3.1、KLF4與RhoA/Rho信號(hào)通路的關(guān)系，以及與宮縮乏力性產(chǎn)后出血的關(guān)系尚未完全明確，本研究將通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步探討，旨在研究宮縮乏力性產(chǎn)后出血的分子機(jī)制，從而為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年4月至2021年4于我院收治的80例宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦為觀察組，選擇同期80例無(wú)產(chǎn)后出血產(chǎn)婦為對(duì)照組。2組產(chǎn)婦的年齡、產(chǎn)次、孕周等一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

產(chǎn)后出血診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：參照樂(lè)杰主編的第7 版《婦產(chǎn)科學(xué)》。失血量采用稱(chēng)重法以及羊水壓積測(cè)定法測(cè)量。稱(chēng)重法：失血量(mL) =[胎兒娩出后接血敷料重(濕重) (g)-接血前敷料重(干重) (g)] /1.05(血液比重為g/mL) 。羊水壓積測(cè)定法：血羊水中血量(mL)=總羊水和血混合液量×羊水中血細(xì)胞比容/產(chǎn)前外周血中血細(xì)胞比容。

表1 2組產(chǎn)婦基線資料的比較

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)時(shí)，預(yù)防性使用縮宮素前，剪取子宮下段切口上緣的子宮平滑肌，大小為 0.15 cm×0.15 cm×1.0 cm，立即放入0 ℃克亨氏溶液(Kreb-Henseleit，K-H)，于4 h內(nèi)測(cè)定肌張力。另取0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小的標(biāo)本，采用蛋白質(zhì)印跡法以及實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)相關(guān)蛋白、mRNA表示水平。

1.2.2 肌條等長(zhǎng)張力測(cè)定 將剪取的標(biāo)本懸掛于37 ℃克亨氏液體浴槽中，通入95%O2、5% CO2的混合氣體，連接張力換能器(成都儀器廠)，置前負(fù)荷2 g，平衡60 min后，記錄子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力、頻率以及幅度，采集時(shí)間為20 min。待肌條收縮穩(wěn)定之后，加入終濃度為1 μmol/L的Rho激酶抑制劑Y-27632(美國(guó)Sigma公司)，觀察子宮平滑肌收縮情況。

1.2.3 RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)mRNA水平 采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)肌條中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表達(dá)水平。按RNAiso Plus 試劑盒(Thermo Fisher Scientific)說(shuō)明書(shū)提取標(biāo)本中的總RNA，分光光度計(jì)定量 RNA 濃度。采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄miRNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ、 mRNA以及內(nèi)參U6引物探針由大連寶生物工程有限公司提供，引物序列見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，共45個(gè)循環(huán)。采用ABI Prisme Step-one熒光定量PCR儀(Applied Biosystems AB)進(jìn)行檢測(cè)，以2-△△ct表示RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

表2 引物序列

1.2.4 蛋白檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平，研磨消化標(biāo)本組織，采用BCA法測(cè)定中蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，分別按1:1 000的比例加入對(duì)應(yīng)多克隆抗體(英國(guó) Abcam 公司)，孵育過(guò)夜，次日洗膜，加入二抗-HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(美國(guó) Santa Cruze 公司)。顯影，定影，攝片，以β-肌動(dòng)蛋白(β-Actin)為內(nèi)參蛋白，用凝膠定量分析軟件( Gel-Pro Analyzer 4) 讀取蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白/β-Actin的比值表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 2組產(chǎn)婦子宮平滑肌收縮活力情況比較 觀察組的子宮平滑肌收縮活動(dòng)力、收縮頻率以及收縮幅度均低于對(duì)照組(P<0.05～P<0.01) ，加入Y-27632 后，2組子宮平滑肌收縮活動(dòng)力均低于加入前(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 2組產(chǎn)婦子宮平滑肌收縮活力情況比較

2.2 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)mRNA以及蛋白表達(dá)水平比較 觀察組的RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)mRNA以及蛋白(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)表4、5)。

表4 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)mRNA水平比較

2.3 2組產(chǎn)婦Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平比較 觀察組Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.01)(見(jiàn)表6)。

2.4 RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白、收縮活動(dòng)力與Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，子宮平滑肌RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白、收縮活動(dòng)力分別與Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平呈正相關(guān)性(P<0.05)(見(jiàn)表7)。

表5 2組產(chǎn)婦RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平比較

表6 2組產(chǎn)婦Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平比較

表7 RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白、收縮活動(dòng)力與Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平的關(guān)系(r)

3 討論

既往認(rèn)為，產(chǎn)婦子宮平滑肌中縮宮素的受體數(shù)量減少可導(dǎo)致子宮收縮潛能、收縮活動(dòng)力下降，是引起產(chǎn)后出血的重要分子機(jī)制[9]。且研究也證實(shí)使用小劑量縮宮素可明顯增加產(chǎn)婦的子宮平滑肌收縮活動(dòng)力和頻率，而進(jìn)一步增加劑量或者提供縮宮素的濃度，刺激1 h后可導(dǎo)致縮宮素受體脫敏，進(jìn)而引起收縮抑制[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路參與了多種平滑肌收縮舒張功能障礙相關(guān)的疾病，Rho激酶屬于絲蘇氨酸蛋白激酶，存在ROCK Ⅰ、ROCKⅡ 2種異構(gòu)體，是RhoA下游的重要靶分子，RhoA與ROCK 特異性結(jié)合后，通過(guò)磷酸化ROCK多個(gè)位點(diǎn)而活化信號(hào)通路，抑制平滑肌中肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，進(jìn)而阻止肌球蛋白輕鏈的脫磷酸化，增強(qiáng)平滑肌收縮力[11]。本次研究結(jié)果顯示，觀察組的RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及mRNA(RhoA、ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ)表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.01)，且進(jìn)一步通過(guò)Pearson相關(guān)分析顯示通路蛋白表達(dá)水平與子宮平滑肌收縮活動(dòng)力呈正相關(guān)(P<0.05)，表明RhoA/Rho信號(hào)通路可能參與調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮功能，但宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的子宮平滑肌組織中RhoA/Rho信號(hào)通路處于低表達(dá)狀態(tài)，導(dǎo)致子宮平滑肌收縮力降低，進(jìn)而引起宮縮乏力性產(chǎn)后出血。有研究[12]認(rèn)為，正常妊娠孕婦于妊娠晚期以及產(chǎn)前時(shí)體內(nèi)縮宮素受體明顯增加，進(jìn)而誘導(dǎo)RhoA的表達(dá)，而產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的體內(nèi)縮宮素受體表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)而減少對(duì)RhoA的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致RhoA/Rho信號(hào)通路活化受阻。同時(shí)，也有研究[13]認(rèn)為正常妊娠孕婦臨產(chǎn)前子宮平滑肌組織內(nèi)的一氧化氮水平顯著降低，而一氧化氮可通過(guò)激活環(huán)鳥(niǎo)苷酸依賴(lài)性激酶，進(jìn)而抑制RhoA的膜轉(zhuǎn)位，阻止RhoA/Rho信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的一氧化氮變化不明顯，相對(duì)正常產(chǎn)婦為高水平狀態(tài)，故而使得RhoA/Rho信號(hào)通路抑制的增加，子宮平滑肌收縮活動(dòng)力減弱，最終引起產(chǎn)后出血。

Thr38是調(diào)節(jié)鈣敏感性的重要分子，作為肌球蛋白輕鏈磷酸酶的假底物，可與之結(jié)合而使得肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活，進(jìn)而抑制肌球蛋白輕鏈的去磷酸化，增加細(xì)胞質(zhì)中肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平，促進(jìn)肌動(dòng)-肌球蛋白交聯(lián)以及肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，最終誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞收縮[14-15]。KCa3.1是鈣激活鉀通道家族中的一員，細(xì)胞內(nèi)高鈣離子水平激活KCa3.1通道，從而促進(jìn)鉀外流，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)以及細(xì)胞膜電位，KCa3.1通道表達(dá)增加可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移等生理過(guò)程[16]。KLF4在多種平滑肌中具有調(diào)控作用，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和分化，介導(dǎo)調(diào)控血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換[17]。本次研究結(jié)果顯示，觀察組Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平均低于對(duì)照組，進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)分析顯示Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)水平與收縮活動(dòng)力呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，表明Thr38、KCa3.1、KLF4與子宮平滑肌收縮功能密切關(guān)聯(lián)，其在宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦的子宮平滑肌組織中低表達(dá)，使得子宮平滑肌收縮力降低，進(jìn)而導(dǎo)致宮縮乏力性產(chǎn)后出血。同時(shí)本次研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平與Thr38、KCa3.1、KLF4呈正相關(guān)性，提示平滑肌組織中RhoA/Rho信號(hào)通路可能參與Thr38、KCa3.1、KLF4的表達(dá)調(diào)控，以上因子在調(diào)控平滑肌收縮力方面存在整合，相互影響活化狀態(tài)，共同參與宮縮乏力性產(chǎn)后出血的發(fā)生。

綜上所述，宮縮乏力性產(chǎn)后出血產(chǎn)婦子宮平滑肌組織的子宮平滑肌組織RhoA/Rho信號(hào)通路以及Thr38、KCa3.1、KLF4表達(dá)下降，且與收縮能力降低呈正相關(guān)性，兩者相互調(diào)控共同參與產(chǎn)后出血的發(fā)生。