不同條件下兔骨骼肌肌球蛋白流變特性的研究

許 柯，吳 燁，徐幸蓮*，周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095)

不同條件下兔骨骼肌肌球蛋白流變特性的研究

許 柯，吳 燁，徐幸蓮*，周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江蘇 南京 210095)

研究不同蛋白質(zhì)量濃度、溫度、pH值、KCl濃度下兩種不同肌肉類型——腰大肌(白肌)(Pasoas major，PM)和半膜肌(紅肌)(Semimembranosus proprius，SMp)的肌球蛋白的流變學(xué)特性。借助于冪率定律， Arrhenius方程，計算出K(黏度系數(shù))、n(流變指數(shù))和Ea(流動活化能)。結(jié)果表明：不同條件下的肌球蛋白溶液均呈假塑性流體特征，τ(剪切應(yīng)力)和δ(剪切速率)的關(guān)系可以用冪函數(shù)表示；K和n受蛋白質(zhì)量濃度、溫度、pH值 、KCl濃度的影響，PM和SMp肌球蛋白變化一致。用多項式方程可以描述肌球蛋白的黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系，用Arrhenius 方程可以較好地描述溫度對肌球蛋白流變特性的影響。

肌球蛋白；流變特性；靜黏彈性

Abstract：An investigation of rheological properties of myosin from two rabbit muscle types (Pasoas major, PM andSemimembranosus proprius, SMp) was carried out under different levels of protein concentration, temperature, pH value and KCl concentration.K(viscosity coefficient),n(flow index) andEa (activation energy) were calculated following the power law or the Arrhenius equation, and from the results of calculation, it can be concluded that myosin is a pseudoplastic fluid under different conditions, and that the relationship between sheer stress (τ) and sheer rate (δ) is a power law function.Kandnwere influenced by protein concentration, temperature, pH and KCl concentration, and myosins from both rabbit muscle types had identical changes in the two parameters. The relationship between viscosity coefficient and protein concentration complied with a polynomial equation, and the Arrhenius equation could describe the influence of temperature on the flow behavior of rabbit skeletal myosin well.

Key words：myosin；rheological property；static viscoelsaticity

肌球蛋白是肌肉中含量最高也是最重要的蛋白質(zhì)，約占肌肉總蛋白質(zhì)的1/3，在肉品加工中具有重要的功能性質(zhì)(如持水性、黏合性、膠凝性、乳化性等)。肌球蛋白的功能特性直接影響肉制品的質(zhì)量，肌球蛋白的凝膠特性決定著肉糜制品的質(zhì)量，包括肉糜制品(如火腿腸等)的硬度、彈性、切片性和產(chǎn)率等[1]，pH值、鹽濃度、溫度等因素影響著肌球蛋白的凝膠特性[2]。流變學(xué)的基本內(nèi)容是彈性力學(xué)和黏性流體力學(xué)，是食品力學(xué)性質(zhì)方面的物性理論。黏性是表現(xiàn)流體流動性質(zhì)的指標(biāo)，黏性流動分為牛頓流動和非牛頓流動。流變特性指數(shù)n的大小反映了流體的類型，當(dāng)0＜n＜1時，流體為假塑性流體；當(dāng)n＞1時，流體為脹塑性流體[3]。目前對肌球蛋白溶液升溫過程中的貯能模量(G′)和損耗模量(G〞)這些動黏彈性參數(shù)研究比較多，曾憲明等[4]測定了兔肌球蛋白升溫過程中G′和相位角δ，劉海梅[5]測定了不同pH值和蛋白濃度下升溫過程中鰱魚肌球蛋白的G′，董永等[6]測定了不同季節(jié)草魚骨骼肌肌球蛋白升溫過程中的G′、G〞和tanδ。而對揭示流體本質(zhì)特性的靜黏彈性參數(shù)的研究較少，因此，本實驗對肌球蛋白的靜黏彈性參數(shù)及其變化規(guī)律進(jìn)行研究，揭示不同條件對肌球蛋白流變學(xué)特性的影響，為肉制品的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3月齡雄性新西蘭白兔(2～2.5kg)購于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

KCl、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、焦磷酸鈉、PIPES、(NH4)2SO4等所用試劑均不低于分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Physica MCR301旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利安東帕公司；Waring高速組織搗碎機 美國思伯明設(shè)備有限公司；UV-754分光光度計 上海第三儀器廠；Avanti J-E落地式高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提純

健康的雄性新西蘭白兔，宰前充分休息過夜，以減少應(yīng)激。機械擊昏后切斷頸部血管，充分放血，迅速剝皮，去頭、內(nèi)臟、爪，先后用自來水、蒸餾水沖洗以去除血跡。將腰大肌(Pasoas major， PM)肌球蛋白和半膜肌 (Semimembranosus proprius，SMp) 肌球蛋白剝離后置于－20℃冰箱0.5h，使其迅速冷卻，剔除可見脂肪和結(jié)締組織，切碎后稱質(zhì)量。用高速組織搗碎機攪打約30s，在0～4℃下提取肌球蛋白，方法參照Wang等[7]。純化的肌球蛋白溶解在溶液(0.6mol/L KCl，pH 6.0，20mmol/L 磷酸緩沖液)中，攪拌透析24h，中間換兩次透析液。透析后的肌球蛋白貯存于0～4℃，在1周內(nèi)使用完。

1.3.2 蛋白質(zhì)量濃度測定

采用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度，牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[8]。

1.3.3 不同蛋白質(zhì)量濃度、溫度、pH值、KCl濃度下肌球蛋白溶液的流變特性測定

將提取純化得到的肌球蛋白溶解在不同的透析液中，攪拌透析24h，中間換兩次透析液，以達(dá)到所需的不同蛋白質(zhì)量濃度(5、10、15、20mg/mL)、pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)、KCl濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L)。

不同蛋白質(zhì)量濃度下的肌球蛋白溶液KCl濃度為0.6mol/L，pH 6.0。不同溫度下的肌球蛋白溶液蛋白質(zhì)量濃度為15mg/mL，KCl濃度為0.6mol/L，pH值為6.0。不同pH值下的肌球蛋白溶液蛋白質(zhì)量濃度為10mg/mL，KCl濃度為0.6mol/L。不同KCl濃度下的肌球蛋白溶液蛋白質(zhì)量濃度為15mg/mL，pH值為6.0。

在4℃的條件下，測量板和載物臺間距為0.5mm。用不同的剪切速率(δ)(2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024s-1)測定相應(yīng)的τ(剪切應(yīng)力)，根據(jù)冪率定律求出不同蛋白質(zhì)量濃度、pH值、KCl濃度下的K和n[9]。

式中：τ為剪切應(yīng)力/Pa；δ為剪切速率/s-1；K為黏度系數(shù)/(Pa·sn)；n為流變指數(shù)。

研究溫度對肌球蛋白溶液流變學(xué)特性的影響時，實驗溫度分別設(shè)為4、10、15、20℃，并通過Arrhenius方程[10]描述溫度對肌球蛋白溶液K的影響。

式中：K代表黏度系數(shù)/(Pa·sn)；A為指前因子/(Pa·sn)，為常數(shù)；e為自然對數(shù)的底(e=2.718)；Ea指流動活化能/(J/mol)，反映了高分子流動的難易程度；t即溫度/℃；R指摩爾氣體常數(shù)，8.314J/(mol·K)。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各指標(biāo)重復(fù)測定3次，實驗數(shù)據(jù)均用Excel和SAS(Statistics Analysis System)8.2處理，差異顯著性建立在P＜0.05水平，用Matlab 2007a進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)量濃度對肌球蛋白溶液流變特性的影響

圖1 不同蛋白質(zhì)量濃度下肌球蛋白的流變曲線Fig.1 Rheological curves of PM and SMp myosins under different protein concentrations

由圖1可知，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大，并且隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大，PM和SMp肌球蛋白的變化一致。20mg/mL蛋白質(zhì)量濃度，1024s-1剪切速率條件下，PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力(67.48Pa)大于SMp肌球蛋白(61.5Pa)。

采用冪率定律(方程1)用Matlab進(jìn)行擬合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，結(jié)果見表1。

表1 蛋白質(zhì)量濃度對肌球蛋白流變參數(shù)的影響Table 1 Power law parameters of PM and SMp myosins under different protein concentrations

R2反映的是擬合精度，擬合得到PM肌球蛋白的流變參數(shù)的R2在0.9129以上，SMp肌球蛋白的流變參數(shù)的R2在0.9278以上，說明該蛋白質(zhì)量濃度下的肌球蛋白溶液對冪率定律具有極高的擬合精度。不同蛋白質(zhì)量濃度下的流變指數(shù)n均小于1，表明該條件下肌球蛋白溶液均為假塑性流體。隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大，黏度系數(shù)K也逐漸增大。PM肌球蛋白的K從0.503Pa·sn增大到了2.463Pa·sn，而SMp肌球蛋白的K從0.418Pa·sn增大到了1.873Pa·sn，說明PM肌球蛋白的黏度系數(shù)受蛋白質(zhì)量濃度影響更大，而相同蛋白質(zhì)量濃度下的K也是PM大于SMp肌球蛋白。

采用(3)、(4)、(5)三式[11]分別擬合K和蛋白質(zhì)量濃度C的關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2 肌球蛋白質(zhì)量濃度與黏度系數(shù)的數(shù)學(xué)模型Table 2 Mathematic models between protein concentration and viscosity coefficient for PM and SMp myosins

由表2可見，三個方程的R2都大于0.92，說明這些模型擬合精度很高，均能很好的說明描述黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系。對于PM肌球蛋白，方程5的R2最大，達(dá)到了0.9869，K=1.08×10-2C2－0.15C+1可以描述黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系。對SMp肌球蛋白，也是方程(5)的R2最大，達(dá)到了0.9819，K=9.86×10-3C2－0.15C+1可以描述黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系。

2.2 溫度對肌球蛋白溶液流變特性的影響

研究發(fā)現(xiàn)25℃下測定的肌球蛋白的剪切應(yīng)力已經(jīng)很小，在1024s-1條件下PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力只有5.2Pa，50℃時1024s-1條件下的剪切應(yīng)力只有3.1Pa。表明肌球蛋白已經(jīng)發(fā)生了微弱的聚集，所以實驗溫度范圍定為4～20℃。

圖2 不同溫度下肌球蛋白的流變曲線Fig.2 Rheological curves of PM and SMp myosins under different temperatures

從圖2可見，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大，并且隨著溫度的升高，剪切應(yīng)力隨之減小。4℃條件下的剪切應(yīng)力最大，在1024s-1條件下PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力達(dá)到了22.3Pa，SMp肌球蛋白的剪切應(yīng)力達(dá)到了33.6Pa。20℃條件下測定的剪切應(yīng)力最小，在1024s-1條件下的PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力只有8.6Pa，SMp肌球蛋白的剪切應(yīng)力只有10.9Pa。

采用冪率定律(方程1)用Matlab進(jìn)行擬合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，結(jié)果見表3。

表3 溫度對肌球蛋白流變參數(shù)的影響Table 3 Power law parameters of PM and SMp myosins under different temperatures

擬合得到的PM肌球蛋白的流變參數(shù)除了20mg/mL質(zhì)量濃度的R2為0.902外，其他都在0.960以上，擬合得到的SMp肌球蛋白的流變參數(shù)除了20mg/mL質(zhì)量濃度的R2為0.8852外，其他都在0.980以上，說明該溫度下的肌球蛋白溶液對冪率定律具有極高的擬合精度。不同溫度下的肌球蛋白溶液流變指數(shù)n均小于1 ，表明該條件下肌球蛋白溶液均為假塑性流體。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子運動加強，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)間發(fā)生相互作用[12]。在溫度小于40℃時，重酶解肌球蛋白或其亞基纖絲之間相互交聯(lián)，使溶液具有凝膠性[13]，所以K逐漸變大，PM和SMp肌球蛋白變化一致。

Arrhenius方程常用來描述流變學(xué)參數(shù)對溫度的依賴性[14]，采用Arrhenius方程對PM和SMp肌球蛋白溶液的黏度系數(shù)與溫度的關(guān)系進(jìn)一步擬合，結(jié)果見表4。

表4 肌球蛋白的黏度系數(shù)與溫度的數(shù)學(xué)模型Table 4 Mathematic models between protein concentration and viscosity coefficient for PM and SMp myosins

由表4可見，對于PM肌球蛋白，R2為0.9746，擬合精度很高，可以用方程2描述溫度對PM肌球蛋白溶液K的影響。對于SMp肌球蛋白，R2為0.8762，也可以用方程2描述溫度對SMp肌球蛋白溶液K的影響。方程2反映黏度系數(shù)對溫度敏感程度的量度，即Ea越大，黏度系數(shù)對溫度的變化越敏感。即流動活化能增大，流體的流動性變差，黏彈性變強[15-16]。 PM和SMp肌球蛋白的流動活化能分別為26250J/mol 和20090J/mol，PM的活化能較高。吸收的熱量越大，根據(jù)能量守恒定律，所以最終形成的熱凝膠強度越大。骨骼肌肌肉被分為紅肌(慢肌)和白肌(快肌)，紅肌與白肌不僅生物化學(xué)特性不同，而且化學(xué)組成也存在差異。Fretheim等[17]研究牛肉中紅肌和白肌肌球蛋白的凝膠特性發(fā)現(xiàn)，白肌肌球蛋白形成的凝膠強度比紅肌肌球蛋白的大，本結(jié)果和其相似，說明PM代表的白肌的凝膠強度大于SMp代表的紅肌。

2.3 pH值對肌球蛋白溶液流變特性的影響

圖3 不同pH值下肌球蛋白的流變曲線Fig.3 Rheological curves of PM and SMp myosins under different pH values

從圖3可見，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大。隨著pH值的增大，剪切應(yīng)力相應(yīng)減小，但當(dāng)pH值為7.5時，又開始變大。PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力在1024s-1、pH7.5條件下，達(dá)到了最大，為12.1Pa；而SMp肌球蛋白的最大剪切應(yīng)力在1024s-1、pH6.0條件下，達(dá)到了8.62Pa，相對應(yīng)的pH7.5條件下的剪切應(yīng)力為8.34Pa，僅增大了0.28Pa。

采用冪率定律(方程1)用Matlab進(jìn)行擬合，得到肌球蛋白溶液的K，n值，結(jié)果見表5。

表5 pH值對肌球蛋白流變參數(shù)的影響Table 5 Power law parameters of PM and SMp myosins under different pH values

擬合得到的PM肌球蛋白的流變參數(shù)的R2都在0.940以上，擬合得到的SMp肌球蛋白的流變參數(shù)的R2都在0.970以上，說明該pH值下的肌球蛋白溶液對冪率定律具有極高的擬合精度。不同pH值下的肌球蛋白溶液流變指數(shù)n均小于1，表明該條件下肌球蛋白溶液均為假塑性流體。隨著pH值的升高，K先變小后變大，n先變大后變小，PM和SMp肌球蛋白變化一致。肌球蛋白的等電點在5.3左右[18]，pH值接近等電點時，蛋白容易聚集。遠(yuǎn)離等電點時，分子間斥力占主導(dǎo)地位，互相排斥，導(dǎo)致黏度系數(shù)變小。而當(dāng)pH值為7.5時，可能是由于分子間的距離達(dá)到足夠大，分子之間的引力起主導(dǎo)作用，所以黏度系數(shù)又有所增大。

2.4 KCl濃度對肌球蛋白溶液流變特性的影響

由圖4可知，隨著剪切速率的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大，并且隨著KCl濃度的增大，剪切應(yīng)力也隨之增大。KCl濃度為1.0mol/L，1024s-1剪切速率條件下PM肌球蛋白的剪切應(yīng)力達(dá)到最大值24.5Pa，大于SMp肌球蛋白的最大值21.2Pa。

圖4 不同KCl濃度下肌球蛋白的流變曲線Fig.4 Rheological curves of PM and SMp myosins under different KCl concentrations

采用冪率定律(方程1)用Matlab進(jìn)行擬合，得到肌球蛋白溶液的K、n值，結(jié)果見表6。

表6 KCl濃度對肌球蛋白流變參數(shù)的影響Table 6 Power law parameters of PM and SMp myosins under different KCl concentrations

擬合得到PM肌球蛋白的流變參數(shù)的R2都在0.980以上，擬合得到SMp肌球蛋白的流變參數(shù)的R2都在0.960以上，說明該KCl濃度下肌球蛋白溶液對冪率定律具有極高的擬合精度。不同KCl濃度下的肌球蛋白溶液流變指數(shù)n均小于1，表明該條件下肌球蛋白溶液均為假塑性流體。隨著KCl濃度的增大，K先變大再變小后變大， PM和SMp肌球蛋白變化一致。肌球蛋白在低鹽濃度下不溶，在高鹽濃度下可溶，所以黏度系數(shù)隨著KCl濃度的增大而增大。而之后減小是由于鹽濃度的增大使肌球蛋白分子的單體數(shù)增多，導(dǎo)致了黏度系數(shù)的減小。

3 結(jié) 論

不同蛋白質(zhì)量濃度、溫度、pH值、KCl濃度下的肌球蛋白溶液為非牛頓流體，其剪切應(yīng)力τ和剪切速率δ的關(guān)系可以用冪函數(shù)τ=K·δn表示。不同條件下的肌球蛋白溶液流變指數(shù)n均小于1，表明其為假塑性流體。K和n受蛋白質(zhì)量濃度、溫度、p H值、K C l濃度的影響，兩種不同肌肉類型的肌球蛋白溶液變化一致。用多項式方程K=1.08×10-2C2－0.15C+1可以描述PM肌球蛋白溶液的黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系，K=9.86×10-3C2－0.15C+1可以描述SMp肌球蛋白溶液的黏度系數(shù)和蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系。25℃以上肌球蛋白已經(jīng)發(fā)生了聚集，溫度對黏度系數(shù)影響的數(shù)學(xué)模型為，由該方程二次擬合得到的PM肌球蛋白的流動活化能為26250J/mol，大于SMp肌球蛋白的流動活化能20090J/mol，反映了白肌形成凝膠的強度大于紅肌的原因。

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Rheological Properties of Rabbit Skeletal Myosin under Different Conditions

XU Ke，WU Ye，XU Xing-lian*，ZHOU Guang-hong
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

TS201.7

A

1002-6630(2010)21-0010-05

2010-06-01

國家自然科學(xué)基金項目(30771526)

許柯(1987—)，男，碩士研究生，研究方向為肉制品質(zhì)量控制。E-mail：tzxhxk_2004@163.com

*通信作者：徐幸蓮(1962—)，女，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：xlxu@njau.edu.cn