太子參葉斑病菌Phoma sp.FJZR01固體發(fā)酵代謝產物研究

倪建成，范永飛，2，王澤榕，3，阮少江，陳美霞，3，葉祖云*

(1.福建省特色藥用植物工程技術研究中心/寧德師范學院生命科學學院，福建寧德 352100；2.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；3.福建農林大學農學院，福建福州 350002)

太子參(Pseudostellariaheterophylla)為石竹科孩兒參屬草本藥用植物，以其肉質根入藥，富含多糖、環(huán)肽、生物堿和皂苷等功能成分，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1-3]。與人參相比，太子參藥性平緩，更加適合兒童、老人和體弱多病者，常用于健胃消食的制劑處方中，如“江中牌健胃消食片”和“太子參復方顆?！盵4]。福建省柘榮縣從20世紀60年代末開始引種太子參，種植面積逐年擴大，全縣90%的農戶都在從事太子參種植或與其相關聯(lián)的產業(yè)，太子參產業(yè)成為當地脫貧致富的支柱產業(yè)。

由于太子參主要通過種根繁殖，隨著種植年限增加，連作障礙凸顯，危害太子參的真菌病害頻發(fā)，其中葉斑病對太子參葉片危害尤為顯著，嚴重影響太子參的產量和品質，制約太子參產業(yè)發(fā)展。已報道的引起太子參葉斑病的病原菌主要有莖點霉屬(Phoma)真菌[5]、殼針孢屬(Septoria)真菌[6]、斑點葉點霉(Phyllostictacommonsii)[7]、殼二孢(Ascochytaversabilis)[8-9]等，這些研究主要集中在病原菌的發(fā)病規(guī)律、分類鑒定和藥劑防治方面，而關于病原菌代謝產生的真菌毒素鮮有報道。前期從福建柘榮的太子參葉斑病葉中分離篩選獲得的一株莖點霉菌Phomasp.FJZR01，該研究對其固體發(fā)酵物的次生代謝產物進行研究，結合生物活性確定該菌代謝產生的致病毒素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑超凈工作臺SW-CJ-2D(蘇州凈化設備有限公司)；高壓滅菌鍋GR60DA(美國致微Zealway)；光照培養(yǎng)箱MGC-100(上海一恒科學儀器有限公司)；多功能超純水系統(tǒng)Unique-S20(廈門銳思捷水純化技術有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀R-100(瑞士Buchi公司)；核磁共振儀Bruker 400 MHz(瑞士Bruker公司)；液相色譜串聯(lián)質譜儀Agilent 1290 infinity Ⅱ/6470(美國安捷倫科技公司)；顯微熔點儀SGW X-4B(上海儀電物理光學儀器有限公司)；RP-C18(50 μm，加拿大Silicycle公司)；Sephadex LH-20(50～150 μm，北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；硅膠H板、200 ～ 300目柱色譜硅膠、薄層層析硅膠(青島海洋化工有限公司)。正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、冰乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；顯色劑5% H2SO4-乙醇溶液(實驗室配制)。

1.2 試材太子參葉斑病病葉采自福建柘榮(標本編號TZS1705)。菌株從太子參病葉分離得到，經形態(tài)和ITS rDNA鑒定為莖點霉屬Phomasp.(菌株編號為FJZR01)，該菌株保藏于福建省特色藥用植物工程技術研究中心。

1.3 葉斑病菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)菌株FJZR01采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板發(fā)酵。培養(yǎng)基配制：馬鈴薯200 g，去皮、切成小塊，水煮開0.5 h后，用紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，用純水定容至1 000 mL，pH自然，共配制5 000 mL PDA培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min。倒平板：將加熱融化的培養(yǎng)基放置于超凈工作臺中，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右，將培養(yǎng)基倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每皿含培養(yǎng)基20～25 mL。接種：將預先活化好的致病菌用無菌打孔器制成直徑5 mm的菌餅接種于培養(yǎng)基中央，用封口膜包封培養(yǎng)皿，標記上菌株名稱和接種日期，并轉移至培養(yǎng)箱中，25 ℃倒置培養(yǎng)40 d。

1.4 發(fā)酵物提取與分離純化

1.4.1發(fā)酵物提取。挑選發(fā)酵好的平板約220皿，將發(fā)酵菌體連同培養(yǎng)基攪碎并用乙酸乙酯浸提，收集過濾后的浸提液，通過旋轉蒸發(fā)儀45 ℃減壓濃縮，并回收溶劑用于重復浸提，共提取4次，得到乙酸乙酯提取浸膏(11.9 g)，將該浸膏用甲醇溶解過濾，濾液經減壓濃縮，獲得甲醇提取浸膏(6.6 g)。

1.4.2發(fā)酵物分離純化。將甲醇提取浸膏(6.6 g)用甲醇溶解后經Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫，通過薄層色譜檢識合并相近組分，減壓濃縮得到5個組分(Fr.1～Fr.5)。組分Fr.2(2.9 g)經甲醇重結晶得到化合物6(100.0 mg)，母液經Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，薄層色譜檢測合并得到4個組分(Fr.2-1～Fr.2-4)。Fr.2-2(1.8 g)上RP-18柱，使用甲醇-水體系(體積比0∶100、15∶85、30∶70、45∶55、60∶40、80∶20、100∶0)洗脫得到8個亞組分(Fr.2-2-1～Fr.2-2-8)，F(xiàn)r.2-2-6(208.6 mg)經硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物5(160.6 mg)；Fr.2-4(18.1 mg)經硅膠柱層析，用正己烷-丙酮(9∶1)體系洗脫得到化合物2(8.0 mg)。組分Fr.4(535.6 mg)用純水溶解后經Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，通過薄層色譜檢識合并相近組分，獲得5個組分(Fr.4-1～Fr.4-5)，F(xiàn)r.4-5(7.2 mg)經硅膠柱層析，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物4(5.2 mg)。組分Fr.5(825.9 mg)用純水溶解后經RP-18柱層析，甲醇-水體系(體積比0∶100、15∶85、30∶70、45∶55、60∶40、80∶20、100∶0)洗脫得到11個組分(Fr.5-1～Fr.5-11)。Fr.5-8(46.5 mg)經Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，經檢測合并得到2個亞組分(Fr.5-8-1～Fr.5-8-2)，F(xiàn)r.5-8-1(28.2 mg)過硅膠柱，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物1(21.8 mg)；Fr.5-10(35.2 mg)經Sephadex LH-20柱層析，純水洗脫，再過硅膠柱，用乙酸乙酯-甲醇(9∶1)體系洗脫得到化合物3(13.9 mg)。

1.5 發(fā)酵產物對太子參葉片毒害作用測定參照文獻[10-11]中的葉片穿刺法?；衔镉蒙倭考状既芙?，并用蒸餾水分別配制0.125、0.250、0.500和1.000 mg/mL 4個樣品濃度待測液，甲醇的終濃度為5%(甲醇/水=5/95，v/v)；配制5%甲醇水溶液為對照溶液。選取健康的6～8葉齡太子參植株上方的嫩葉，用無菌注射器的針頭在葉片左半葉的表皮層刮刺一道約2 mm的傷口，確保沒有刺破葉片，用微量移液器吸取20 μL的樣品溶液滴加在傷口處，作為樣品處理組；用無菌注射器的針頭在葉片右半葉的表皮層刮刺一道約2 mm的傷口，用微量移液器吸取20 μL的5%甲醇水溶液滴加在傷口處，作為空白對照組。設置3個重復，在室內25 ℃室溫下培養(yǎng)觀察，記錄病斑產生情況。

2 結果與分析

從菌株FJZR01固體發(fā)酵代謝產物中分離得到6個化合物，采用現(xiàn)代波譜技術分析結合文獻數據比對確定這些化合物的結構(圖1)，分別為3-氯-4-羥基苯乙酸(1)、3-氯-4-羥基苯乙酰胺(2)、flemingipanic acid(3)、腺苷(4)、乙基α-D-吡喃葡萄糖苷(5)、甘露醇(6)，化合物1～6均是首次從太子參葉斑病菌中報道，化合物3系首次從微生物代謝產物中分離得到。

圖1 化合物1～6的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-6

2.1 結構鑒定

2.1.1化合物1。結晶性粉末，熔點108～110 ℃，ESI-MSm/z：185[M-H]-，分子式C8H7ClO3。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7)，6.99(1H，dd，J=8.3，2.2 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.46(2H，s，H-7)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：175.7(C-8)，153.2(C-4)，131.7(C-2)，129.9(C-6)，128.3(C-1)，121.4(C-3)，117.4(C-5)，40.7(C-7)。以上數據與文獻[12]的報道基本一致，故鑒定為3-氯-4-羥基苯乙酸(3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid)。

2.1.2化合物2。白色針尖，熔點160～162 ℃，ESI-MSm/z：186[M + H]+，分子式C8H8ClNO2。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.22(1H，d，J=2.2 Hz，H-7)，7.02(1H，dd，J=8.3，2.2 Hz，H-6)，6.83(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，3.37(2H，s，H-7)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：176.9(C-8)，153.3(C-4)，131.5(C-2)，129.7(C-6)，129.0(C-1)，121.5(C-3)，117.6(C-5)，42.1(C-7)。以上數據與文獻[12]的報道基本一致，故鑒定為3-氯-4-羥基苯乙酰胺(3-chloro-4-hydroxyphenylacetamide)。

2.1.3化合物3。棕色粉末，ESI-MSm/z：195 [M-H]-，分子式C10H12O4。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.17(1H，dd，J=8.2，7.5 Hz，H-4)，6.71(1H，dd，J=8.2，1.2 Hz，H-3)，6.66(1H，dd，J=7.5，1.2 Hz，H-5)，4.01(1H，m，H-2′)，3.37(1H，dd，J=12.6，7.5 Hz，H-1′a)，3.02(1H，dd，J=12.6，5.0 Hz，H-1′b)，1.20(3H，d，J=6.2 Hz，H-3′)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：178.8(COOH)，162.7(C-2)，143.3(C-6)，132.5(C-4)，123.7(C-5)，119.5(C-1)，115.9(C-3)，70.9(C-2′)，44.6(C-1′)，23.9(C-3′)。以上數據與文獻[13-14]的報道基本一致，故鑒定為flemingipanic acid。

2.1.4化合物4。白色粉末，熔點234～236 ℃。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.36(1H，s，H-2)，8.14(1H，s，H-8)，7.36(2H，s，NH2)，5.88(1H，d，J=6.2 Hz，H-1′)，5.46(1H，d，J=6.3 Hz，2′-OH)，5.45(1H，dd，J=7.3，4.5 Hz，5′-OH)，5.21(1H，d，J=4.5 Hz，3′-OH)，4.62(1H，td，J=6.2，4.9 Hz，H-2′)，4.15(1H，td，J=4.9，2.9 Hz，H-3′)，3.97(1H，q，J=3.4 Hz，H-4′)，3.68(1H，dt，J=12.2，4.5 Hz，H-5′a)，3.55(1H，ddd，J=12.2，7.3，3.4 Hz，H-5′b)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.2(C-6)，152.4(C-2)，149.1(C-4)，140.0(C-8)，119.4(C-5)，87.9(C-1′)，85.9(C-4′)，73.4(C-2′)，70.7(C-3′)，61.7(C-5′)。以上數據與文獻[15]的報道基本一致，故鑒定為腺苷(adenosine)。

2.1.5化合物5。無色黏稠，易吸濕。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：4.77(1H，d，J=3.8 Hz，H-1′)，3.78(2H，m，H-6′a，1a)，3.65(1H，dd，J=11.8，5.6 Hz，H-6′b)，3.63(1H，t，J=8.9 Hz，H-3′)，3.56(1H，ddd，J=10.0，5.6，2.3 Hz，H-5′)，3.49(1H，dq，J=9.8，7.1 Hz，H-1b)，3.37(1H，dd，J=9.7，3.8 Hz，H-2′)，3.27(1H，dd，J=10.0，8.9 Hz，H-4′)，1.23(3H，t，J=7.1 Hz，H3-2)。13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：99.8(C-1′)，75.1(C-3′)，73.6(C-2′)，73.5(C-5′)，71.8(C-4′)，64.4(C-1)，62.7(C-6′)，15.3(C-2)。以上數據與文獻[16]的報道基本一致，故鑒定為乙基α-D-吡喃葡萄糖苷(ethyl α-D-glucopyranoside)。

2.1.6化合物6。白色針尖，熔點166～168 ℃，ESI-MSm/z：181[M-H]-，分子式C6H14O6。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：4.42(2H，d，J=5.5 Hz，OH-2，5)，4.34(2H，t，J=5.7 Hz，OH-1，6)，4.14(2H，d，J=7.1 Hz，OH-3，4)，3.60(2H，ddd，J=10.7，5.8，3.3 Hz，H-2，5)，3.53(2H，t，J=7.2 Hz，H-3，4)，3.44(2H，dtd，J=8.6，5.7，3.3 Hz，H-1a，6a)，3.37(2H，m，H-1b，6b)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：71.3(C-2，5)，69.7(C-3，4)，63.9(C-1，6)。以上數據與文獻[17]的報道基本一致，故鑒定為甘露醇(mannitol)。

2.2 發(fā)酵產物致病活性測定采用葉片穿刺法測定化合物1～6對太子參葉片的毒害活性，測定結果見表1。由表1可知，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)在濃度高于0.250 mg/mL時，能使太子參葉片造成不同程度損傷，產生壞死性病斑；當濃度達到1.000 mg/mL時，病斑癥狀顯著，病斑直徑大于3 mm?；衔?(3-氯-4-羥基苯乙酰胺)只有在濃度達到1.000 mg/mL時才表現(xiàn)出較弱的致病癥狀，而化合物3～6在供試濃度下均未對太子參葉片產生毒害作用。

表1 化合物對太子參葉片毒害活性Table 1 Toxic activity of compounds on Pseudostellaria heterophylla leaves

從圖2A可觀察到，在田間種植的太子參，葉斑病發(fā)病中期的病斑呈灰白色壞死狀，病斑上有黑褐色的分生孢子器，散生，輪紋狀排布。3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片1 d時，在樣品處理部位周邊產生了明顯的半透明壞死的葉斑毒害癥狀(圖2B)，而空白對照處理未出現(xiàn)明顯毒害癥狀。隨著時間增加，7 d時，3-氯-4-羥基苯乙酸處理部位周邊呈組織壞死、干枯、發(fā)白、葉斑周圍皺縮等癥狀(圖2C)，該癥狀與田間葉斑病菌對太子參葉片毒害作用相似。綜上觀察分析可以確定3-氯-4-羥基苯乙酸是葉斑病菌Phomasp.FJZR01產生的主要致病毒素。

3 討論與結論

莖點霉屬真菌多數是植物病原真菌或內生真菌，所產生的致病毒素能造成農作物的莖腐、枝枯、葉片和果實壞死等病害，前人從該屬病原菌中報道過phomozin[18]、6-methylsalicylic acid[19]、herbarumins I～Ⅲ[20]、maculansin A[21]等不同結構類型的致病毒素。

該研究從一株太子參莖點霉葉斑病菌Phomasp.FJZR01的固體發(fā)酵產物中分離純化得到6個單體化合物，均是首次從該菌中分離得到。其中，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)在1.000 mg/mL劑量下對太子參葉片有明顯毒害作用，產生的葉斑與田間葉斑病菌活體致病癥狀相似，因而確定3-氯-4-羥基苯乙酸為菌株Phomasp.FJZR01的主要致病毒素。從結構上看，3-氯-4-羥基苯乙酸和化合物2(3-氯-4-羥基苯乙酰胺)結構相近，母核苯環(huán)3C位上連有氯原子，差異主要是支鏈8C位分別以羧基和酰胺基團存在，結合活性測定結果表明，8C位羧基對致病性起到關鍵作用。化合物1和化合物2早先從炭角菌Xylariasp.中分離報道[12]，Kumar等[22]以化合物1作為先導分子合成系列衍生物用于抗前列腺癌細胞和抗寄生活性篩選測試，但鮮見關于植物致病性相關報道，因此，化合物1(3-氯-4-羥基苯乙酸)是一種真菌代謝產生的新型真菌毒素。后續(xù)可開展該致病毒素對太子參葉片的細胞質膜、線粒體、葉綠體及防御酶體系和酚代謝體系等的影響，進一步闡明其致病機制。

注：B.1.000 mg/mL 3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片1 d時表現(xiàn)的癥狀；C.1.000 mg/mL 3-氯-4-羥基苯乙酸處理葉片7 d時表現(xiàn)的癥狀；“--→”表示空白對照；“”表示樣品處理。Note：B.Symptoms of leaves treated with 1.000 mg/mL 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid(1)for 1 d；C.Symptoms of leaves treated with 1.000 mg/mL 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid(1)for 7 d；“--→” means blank control；“”means sample processing.圖2 田間太子參葉斑病癥狀(A)及室內3-氯-4-羥基苯乙酸致病癥狀(B、C)Fig.2 Symptoms of leaf spot disease of Pseudostellaria heterophylla in the field(A)and pathogenic symptoms of 3-chloro-4-hydroxyphenylacetic acid indoors(B，C)