單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞的流式分布及抗菌活性研究

黃 棟，楊林彤，焦緒棟，秦 松，蒲 洋

(1.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東煙臺 264025；2.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺 264003；3.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005)

據(jù)推測，海洋無脊椎動(dòng)物占海洋中動(dòng)物總量的90%以上[1]，大部分種類動(dòng)物體內(nèi)的體腔液或血液細(xì)胞尚未明確功能。目前普遍認(rèn)為體腔液細(xì)胞是海洋無脊椎動(dòng)物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有清除感染[2]、吞噬異物[3-4]、分泌免疫因子(如C1q凝菌因子[5]、凝集素[6]、棘色素-A[7-8]等)、修復(fù)創(chuàng)傷組織[9]等功能。

海洋無脊椎動(dòng)物體腔液或血細(xì)胞尚缺乏統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)[10]。在部分貝類[11-13]、蝦類[14]、螃蟹[15-16]血液細(xì)胞的研究中，透明細(xì)胞(hyalinocyte)和顆粒細(xì)胞(granulocyte)被認(rèn)為是普遍存在的主要細(xì)胞類群。劉東武等[11]和許秀芹等[12]將中國蛤蜊、太平洋牡蠣等8種常見雙殼貝類的血淋巴細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞；李光友等[14]和Martin等[15]將中國對蝦和2種單肢蝦的血淋巴細(xì)胞分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞及透明細(xì)胞。Bodammer[16]和胡錦麗等[17]將藍(lán)蟹和中華絨螯蟹的血淋巴細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞、透明細(xì)胞及半顆粒細(xì)胞。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)是環(huán)渤海及北太平洋區(qū)域特有的一種海洋低等無脊椎動(dòng)物。作為一種新興的養(yǎng)殖品種，它具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[18-19]。單環(huán)刺螠無心臟、血管等循環(huán)系統(tǒng)分化，推測其體腔液及體腔液細(xì)胞具有營養(yǎng)物質(zhì)輸送、免疫防御等功能。目前對單環(huán)刺螠的研究較少。筆者利用密度梯度離心結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞進(jìn)行聚類分析，并對其體腔液細(xì)胞的抗菌/殺菌活性進(jìn)行測定，旨在為單環(huán)刺螠育苗養(yǎng)殖過程中的病害防控提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料購買市售活力較強(qiáng)、體表無明顯損傷的單環(huán)刺螠，平均體重(25.36±5.12)g；置于50 L海水暫養(yǎng)池暫養(yǎng)7 d，池底鋪設(shè)15～20 cm潔凈海沙，溫度18～20 ℃，適量曝氣，不飼喂。

1.2 體腔液細(xì)胞的流式分布隨機(jī)取單環(huán)刺螠3只，先用70%乙醇擦拭體表消毒，將含EDTA-2K(0.1 mg/mL)的無菌注射器沿身體縱向刺入，抽取1 mL紅色體腔液并混勻。用無菌PBS緩沖液按說明書配制Percoll工作液，在10 mL離心管中依次加入濃度40%、35%、26%、20%、16%的1 mL Percoll工作液，形成不連續(xù)密度梯度。在最上層加入1 mL體腔液，4 ℃、2 500 r/min離心30 min[20-21]。離心結(jié)束后小心將形成的細(xì)胞層分別吸出并收集備用。

取不同梯度離心層，使用流式細(xì)胞儀FACSAria(美國BD，Becton Dickinson)進(jìn)行檢測，檢測前向角散射光(forwardscatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射光(sidescatter，SSC)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用CELL Quest軟件處理。獲取細(xì)胞數(shù)為10 000個(gè)，分別以FSC和SSC為橫、縱坐標(biāo)繪圖，從門水平上圈出各個(gè)細(xì)胞亞群。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1細(xì)菌懸濁液的制備。從-80 ℃冰箱中取出實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌(ATCC W0825)、大腸桿菌(ATCC 25922)菌種，分別接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。將菌液5 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌，上述步驟重復(fù)3次，再用PBS重懸，并調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1×107CFU/mL，備用。

1.3.2體腔液細(xì)胞的制備。用0.1 mg/mL肝素鈉浸潤后的1.5 mL無菌注射器從海腸體腔中采集1 mL體腔液，將體腔液于4 ℃、1 500 r/min下離心30 min，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水(0.9 g NaCl，100 mL H2O)洗滌，上述步驟重復(fù)3次，再用L-15液體培養(yǎng)基重懸，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106CFU/mL，備用。

1.4 溶血試驗(yàn)參照秦真東[22]的方法測定枯草桿菌和大腸桿菌對體腔細(xì)胞的溶血情況。取0.5 mL的體腔細(xì)胞溶液，分別與0.5 mL枯草芽孢桿菌和大腸桿菌懸液混勻，室溫孵育，分別于孵育后不同時(shí)間點(diǎn)取樣，3 800 r/min 離心5 min后取200 μL上清液加到96孔酶標(biāo)板中，置于酶標(biāo)儀404 nm處檢測吸光值。

1.5 抗菌活性測定

1.5.1呼吸爆發(fā)水平測定。

1.5.1.1活性氧(ROS)水平的檢測。參照單環(huán)刺螠呼吸腸ROS檢測的方法[23]，取0.5 mL單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞懸液與0.5 mL終濃度1×105CFU/mL 的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌懸液混勻，28 ℃孵育 30 min。按1‰比例加入DCFH-DA探針，37 ℃、80 r/min下避光孵育60 min。4 ℃、3 400 r/min下離心10 min，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌3次，重懸后置于96孔熒光酶標(biāo)板。使用熒光酶標(biāo)儀(Fluoroskan Ascent FL，Thermo)設(shè)置激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，檢測吸光值。

取0.5 mL單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞懸液分別與0.5 mL不同濃度(1×105～3×105CFU/mL)的大腸桿菌懸濁液混合，按照同樣方法測定吸光值。

1.5.1.2一氧化氮水平的測定。參照張夢蘭等[24]對一氧化氮的檢測方法，將單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞懸液與枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(終濃度為1×107CFU/mL)按體積比1∶1加入96孔酶標(biāo)板中，各50 μL。28 ℃孵育30 min；加入100 μL gress A，37 ℃孵育10 min后再加入100 μL gress B，37 ℃孵育10 min后，使用酶標(biāo)儀檢測540 nm處的吸光值。

取50 μL單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞懸液分別與50 μL不同濃度(1×107～3×107CFU/mL)的大腸桿菌懸濁液混合，按上述同樣方法測定吸光值。

1.5.2抗菌活性測定。參照Du等[25]的方法將1 mL單環(huán)刺螠體腔細(xì)胞懸液分別與枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(1×105CFU/mL)28 ℃溫育60 min。先將處理后的混合液進(jìn)行10倍稀釋，再涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，28 ℃過夜培養(yǎng)后計(jì)算平皿上細(xì)菌菌落數(shù)量。以生理鹽水作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 體腔液細(xì)胞分布前期采用顯微觀察的方法分析單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞主要由紅色顆粒細(xì)胞、白色透明細(xì)胞等構(gòu)成。

利用Percoll不連續(xù)密度梯度離心可將單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞主要分為3層(圖1)：紅色顆粒細(xì)胞主要集中在20%～26%的Percoll工作液中；20%的Percoll工作液以近圓狀、細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒的紅色細(xì)胞為主，內(nèi)含少量無色透明細(xì)胞；26%的Percoll工作液以近圓狀、充滿顆粒的紅色細(xì)胞為主，含少量的透明細(xì)胞；白色透明細(xì)胞主要分布在16%和35%～40%的Percoll工作液。16%的Percoll工作液以小型近圓狀透明細(xì)胞為主，同時(shí)含有少量的紅色顆粒細(xì)胞；35%和40%的Percoll工作液多為近圓狀、大透明細(xì)胞及極少數(shù)紅色顆粒細(xì)胞。

各密度層細(xì)胞群體的流式細(xì)胞分析結(jié)果如圖2所示。通過與完整體腔液細(xì)胞對比，根據(jù)其FSC和SSC特性，將體腔液細(xì)胞分為3個(gè)亞群(圖3)：R1 亞群的SSC值最小，表明細(xì)胞的顆粒程度最低，主要為白色透明細(xì)胞；R3亞群的FSC 和 SSC 值均較大，表明細(xì)胞體積較大且含顆粒較多，主要為紅色顆粒細(xì)胞；R2 亞群細(xì)胞的體積和顆粒程度處于 R1 和 R3 亞群之間，主要為半顆粒細(xì)胞。

注：A.16%的Percoll工作液；B.20%的Percoll工作液；C.26%的Percoll工作液；D.35%的Percoll工作液；E.40%的Percoll工作液。Note：A.16% Percoll solution；B.20% Percoll solution；C.26% Percoll solution；D.35% Percoll solution；E.40% Percoll solution.圖1 體腔液細(xì)胞Percoll不連續(xù)密度梯度離心圖Fig.1 Percoll discontinuous density gradient centrifugation results of coelomocytes

2.2 溶血試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，測試菌對體腔液細(xì)胞有一定的溶血效果。其中大腸桿菌引起的溶血現(xiàn)象較為迅速，混合后10 min即可形成明顯的溶血現(xiàn)象，隨時(shí)間的延長，溶血現(xiàn)象受到抑制(圖4A)；枯草芽孢桿菌引起的體腔液細(xì)胞溶血現(xiàn)象較為遲緩，但隨時(shí)間的延長，溶血現(xiàn)象持續(xù)發(fā)生(圖4B)。由此推測，單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞對大腸桿菌有一定的耐受能力。

注：A1和A2分別為EDTA-2K溶液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； B1和B2分別為Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； C1和C2分別為體腔液細(xì)胞FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； D1和D2為16%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； E1和E2分別為20%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； F1和F2分別為26%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； G1和G2為35%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖； H1和H2分別為40%Percoll工作液FSC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖。Note:A1 and A2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of EDTA-2K respectively；B1 and B2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of Percoll origninal solution respectively；C1 and C2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of coelomic fluid cells respectively；D1 and D2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 16% Percoll solution respectively；E1 and E2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 20% Percoll solution respectively；F1 and F2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 26% Percoll solution respectively； G1 and G2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 35% Percoll solution respectively； H1 and H2 were FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of 40% Percoll solution respectively.圖2 不同Percoll工作液的流式細(xì)胞FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點(diǎn)圖和等高線圖Fig.2 FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of flow cytometry in different Percoll solution

2.3 抗菌活性

2.3.1呼吸爆發(fā)水平測定。分別測定了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌刺激后單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞呼吸爆發(fā)水平的變化，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，在與2種細(xì)菌共培養(yǎng)后，單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(ROS)水平均高于對照(圖5A)，一氧化氮(NO)水平亦有所提高(圖5B)。隨著大腸桿菌濃度的升高，體腔液細(xì)胞產(chǎn)生的ROS變化不明顯(圖5A)，但 NO 水平隨著大腸桿菌濃度的增加而明顯增加(圖5B)。

2.3.2抗菌活性分析。將待測菌與單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，利用平板計(jì)數(shù)法測定了2種細(xì)菌的菌落數(shù)量，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，體腔液細(xì)胞對大腸桿菌有一定的殺傷效果，抑菌率為22.36%；體腔液細(xì)胞對枯草芽孢桿菌沒有殺傷效果，反而促進(jìn)了其生長。體腔液細(xì)胞組大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的存活率分別為77.64%和179.35%。

3 討論與結(jié)論

該試驗(yàn)采用Percoll不連續(xù)密度梯度可將單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞初步可分為3層，但分離效果不明顯，推測各層體腔液細(xì)胞間比重差異較小，后期有必要選擇更好的分離方法或條件。流式細(xì)胞術(shù)用FSC反映細(xì)胞體積大小，SSC反映細(xì)胞的顆粒度[26-27]。該研究通過將不同濃度的Percoll細(xì)胞層與完整體腔液細(xì)胞流式分布圖對比，將單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞聚為紅色顆粒細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和白色透明細(xì)胞3個(gè)亞群，與貝類、蝦類、蟹類等物種分類結(jié)果類似[11-12，14-17]；海洋無脊椎動(dòng)物血細(xì)胞的種類及其細(xì)胞亞群隨季節(jié)和地點(diǎn)的不同而不同[28-29]，單環(huán)刺螠?zhǔn)欠褚泊嬖诖爽F(xiàn)象值得進(jìn)一步研究。

注：A.FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點(diǎn)圖；B.FSC 和 SSC 雙參數(shù)等高線圖。Note：A.FSC and SSC dual parameter scatter plot；B.FSC and SSC dual parameter contour map.圖3 單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞 FSC 和 SSC 雙參數(shù)散點(diǎn)圖及等高線圖Fig.3 FSC and SSC dual-parameter scatter plot and contour map of U.unicinctus coelomocytes

注：A.大腸桿菌對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞的溶血效果；B.枯草芽孢桿菌對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞的溶血效果。Note：A.Hemolytic effect of E. coli on U.unicinctus coelomocytes；B.Hemolytic effect of B.subtilis on U.unicinctus coelomocytes.圖4 細(xì)菌對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞的溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Hemolysis experiment results of bacteria on U.unicinctus coelomocytes

注：A.ROS水平；B.NO水平。Note：A.ROS level；B.NO level.圖5 2種細(xì)菌對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞呼吸爆發(fā)水平的影響Fig.5 The effects of two kinds of bacteria on the respiratory burst level of U.unicinctus coelomocytes

表1 2種細(xì)菌菌落數(shù)量的測定Table 1 Determination of the colonies of two kinds of bacteria 單位：CFU/mL

單環(huán)刺螠的體腔液存在一定的抑菌效果[30]。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌可快速導(dǎo)致體腔液細(xì)胞呈現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但溶血現(xiàn)象隨時(shí)間的延長趨于平穩(wěn)，推測單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞對大腸桿菌具有一定的耐受性；單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞對枯草芽孢桿菌的耐受性較差，其溶血現(xiàn)象隨時(shí)間的延長而持續(xù)增加。作為細(xì)胞非特異性免疫防御的機(jī)制之一，呼吸爆發(fā)的過程可產(chǎn)生ROS、NO等對細(xì)菌、病毒或其他外來物的刺激，產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[31-32]。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，體腔液細(xì)胞可通過呼吸爆發(fā)對細(xì)菌進(jìn)行殺滅，但殺菌效果隨細(xì)菌濃度的增加而增大有限，而平板計(jì)數(shù)結(jié)果表明單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞對大腸桿菌具有明顯的抑制作用，而對枯草芽孢桿菌的抑制效果不明顯。

該研究結(jié)合不連續(xù)密度梯度離心和流式細(xì)胞術(shù)對單環(huán)刺螠體腔液細(xì)胞進(jìn)行了聚類分析，并初步測試了其體腔液細(xì)胞對不同類型細(xì)菌的抑菌/殺菌效果。后續(xù)仍要對單環(huán)刺螠生活周期、時(shí)空變化下的體腔液細(xì)胞差異進(jìn)行深入研究，并逐步明確不同類型體腔液細(xì)胞的生理功能，以期為單環(huán)刺螠的育苗、養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)理論支撐。