結(jié)核分枝桿菌Rv3737抑制巨噬細(xì)胞自噬促進(jìn)恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活

付雪峰 婁思玉 彭章麗

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科結(jié)核病區(qū)（貴州遵義 563000）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是目前十大致死性疾病之一，據(jù)2021年WHO 最新報(bào)告顯示：2020年約有987 萬結(jié)核病患者，其中以印度（26%）、中國（8.5%）和印度尼西亞（8.4%）占比較高，128 萬人左右死于結(jié)核?。?］。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染所致的慢性傳染病。

Mtb 感染宿主后，宿主會啟動(dòng)一系列免疫防御反應(yīng)，如自噬、凋亡和炎癥等，通過清除入侵病原體而增強(qiáng)宿主防御功能［2-3］，同時(shí)，Mtb 通過一系列的機(jī)制逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊［4-6］，其中自噬扮演著重要的角色。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Mtb 的相關(guān)蛋白通過抑制巨噬細(xì)胞自噬來促進(jìn)Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。如Eis（N-乙酰轉(zhuǎn)移酶）［7］、PE＿PGRS47［8］、CpsA［9］等分子通過不同的信號通路抑制巨噬細(xì)胞自噬來促進(jìn)Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。然而僅部分蛋白發(fā)現(xiàn)與巨噬細(xì)胞自噬有關(guān)，是否還存在其他Mtb 相關(guān)蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬，需進(jìn)一步研究。

Rv3737 是Mtb 第3737 位編碼的蛋白，據(jù)預(yù)測，其可能的作用是一個(gè)跨膜蛋白調(diào)節(jié)蘇氨酸的代謝。有研究提出與Rv3737 高度同源的Thr 主要涉及蘇氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，而蘇氨酸的缺乏抑制了炎癥細(xì)胞因子的釋放及棒狀桿菌的生長，同時(shí)促進(jìn)雷帕霉素的釋放，調(diào)控自噬的mTOR 信號通路［10-11］，但在Mtb 感染宿主過程中，Rv3737 具體發(fā)揮的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本課題組前期研究結(jié)果表明Mtb 跨膜蛋白Rv3737 在臨床菌株中高表達(dá)，且與肺部病變嚴(yán)重程度及Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制存在一定的相關(guān)性，提示Rv3737 可能作為Mtb 的一種毒力因子而發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚不清楚。由于Mtb 是毒力菌株，需在生物級別P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，且Mtb生長緩慢，給研究Mtb 相關(guān)毒力分子在巨噬細(xì)胞內(nèi)的作用帶來一定的影響。隨著1998年Mtb 基因組測序成功，許多研究致力于研究Mtb 相關(guān)基因的作用及其機(jī)制。與Mtb 高度同源的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS），因無致病性、繁殖速度快，故常作為研究慢速分枝桿菌、致病性常用及等菌株的模式菌［12-13］。本研究主要通過構(gòu)建過表達(dá)Mtb Rv3737 的恥垢分枝桿菌，探討Mtb Rv3737 對于恥垢分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的影響及具體機(jī)制，為結(jié)核病的治療提供潛在的藥物靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑DMEM 培養(yǎng)基購自gibco 公司，TritonX-100、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、Western Blot 制膠液和4×蛋白上樣緩沖液購自Solarbio公司，DNA marker 和質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司，7H9 培養(yǎng)基和7H10 培養(yǎng)基購自BD 公司，TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Beta tubulin rabbit poly-Ab、Coralite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IgG二抗均購自Proteintech 公司，LC3B（D11）XP（R）購自Cell signaling 公司，4%多聚甲醛通用型組織固定液購自biosharp 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建pMV261-Rv3737 融合表達(dá)質(zhì)粒采用酚-氯仿（CTAB）法提取Mtb H37Rv 全基因組DNA，并通過設(shè)計(jì)合成含有pFlag 標(biāo)簽的Rv3737 相關(guān)引物pMV261-Rv3737-ECORI-F（CCGGAATTCCGGATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGGATCAAGATCGATCGGACAACAC）和pMV261-Rv3737-HindIIIR（CCCAAGCTTGGGCTAGCGCACCTCGGTCGCG）擴(kuò)增Mtb Rv3737 基因。將質(zhì)粒pMV261 和目的基因Rv3737 經(jīng)過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌，在含Kana（25 μg/mL）抗性的LB 固體平板上挑取單克隆點(diǎn)，擴(kuò)大培養(yǎng)16 ～18 h 后提取菌液的DNA，并經(jīng)雙酶切及測序驗(yàn)證pMV261-Rv3737 融合表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2 構(gòu)建過表達(dá)MSRv3737 的恥垢分枝桿菌（MS：：pMV261-Rv3737）培養(yǎng)恥垢分枝桿菌至生長對數(shù)期，即OD6000.6 ～1.0，并制備恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒pMV261-Rv3737 和空載質(zhì)粒pMV261 通過電轉(zhuǎn)化技術(shù)電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞中，在無抗性的7H9 液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇細(xì)菌2 ～3 d，再轉(zhuǎn)至含Kana 抗性的7H10 固體平板中培養(yǎng)1 周后提取單克隆生長菌落，并將單隆菌落在7H9 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過PCR 和Western blot 技術(shù)驗(yàn)證恥垢分枝桿菌中Rv3737 的表達(dá)，PCR 引物為（F：CTCAGTATCCTGCTGACCG；R-CCAGCCTCGCCAGCGCCGAC）。

1.2.3 MS：：Rv3737 及MS：：pMV261 的存活試驗(yàn)MS：：Rv3737 過表達(dá)菌株和MS：：pMV261 的胞外存活試驗(yàn)：將MS：：Rv3737 過表達(dá)菌株和MS：：pMV261 在含有卡那霉素的7H9 液體培養(yǎng)基中生長，通過OD600檢測恥垢分枝桿菌生長處于對數(shù)生長期，取適量菌液加入到100 mL 的7H9 培養(yǎng)基中，將菌液的初始OD值調(diào)至0.02，于37 ℃250 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每間隔6 h 測定1 次OD值，并記錄。MS：：pMV261pMV261Rv3737 過表達(dá)菌株和MS：：pMV261 的胞內(nèi)存活試驗(yàn)：準(zhǔn)備RAW264.7 細(xì)胞鋪板于六孔板中（5 × 105/孔），10 %DMEM 37 ℃培養(yǎng)12 ～18 h，將MS：：Rv3737 及MS：：pMV261菌株以MOI＝10 感染RAW264.7 細(xì)胞4 h，用1×PBS清洗2～3 遍，用阿米卡星（1∶2 000）藥殺0 、6、12、24、48、72 h 等不同時(shí)間，在不同時(shí)間點(diǎn)棄細(xì)胞上清，并用1×PBS 清洗細(xì)胞2 ～3 遍，用1 mL 0.1%Triton X-100 裂解巨噬細(xì)胞，將裂解液稀釋至10-5和10-7倍數(shù)，并取25 μL 涂板于7H10 固體平板中，1 ～2 周后觀察細(xì)菌生長情況并計(jì)數(shù)。

1.2.4 Western blotMS：：pMV261-Rv3737及MS：：pMV261 感染RAW264.7 細(xì)胞8 h 后，用1xPBS 洗滌細(xì)胞2 ～3 遍，每孔中加入150 μL 的RIPA 組織裂解液及PMSF（1∶100），置于冰上裂解30 min 后，加入4×loading 蛋白上樣緩沖液，在100 ℃沸水中處理15 min 使蛋白變性。用12%SDS-PAGE 分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行電泳（電泳條件：80 V、30 min 出孔，100 V，2 h 蛋白分離），將分離的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（電轉(zhuǎn)條件：150 V、0.4 A、2 h），再用5%脫脂奶粉于室溫下封閉90 min，用5%脫脂奶粉將一抗LC3Ⅱ（cell signaling technology）稀釋2 000倍后于4 ℃條件下孵育PVDF 膜過夜，0.1%的PBST洗滌3 遍，再以抗兔IgG 二抗（1∶5 000）于室溫下孵育2 h，0.1%的PBST 洗滌3 遍后，加入適量的ECL發(fā)光液，在Amersham Imager600曝光機(jī)下曝光，Image J 進(jìn)行灰度掃描分析結(jié)果。

1.2.5 激光共聚焦培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，并將細(xì)胞鋪板于八孔皿中（3 × 104/孔）后過夜處理；將MS：：pMV261-Rv3737 及MS：：pMV261 感染巨噬細(xì)胞4 h；棄掉培養(yǎng)上清，用1 × PBS 清洗3 遍后，每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，放置于37 ℃孵箱中固定30 min；吸掉4%多聚甲醛，用1 × PBS 清洗3 遍，加入200 μL的0.1%TritonX-100于室溫下穿膜5 min；棄掉0.1 %TritonX-100，用1 × PBS 清洗3 遍，并加入200 μL 的3 %BSA 封閉液于室溫下封閉1 h；封閉完成后，再用1 × PBS 清洗3 遍，按1∶200 的比例加入一抗（anti-LC3B）（注意避光條件下操作），于4 ℃條件下過夜處理；用1 × PBS 清洗3 遍后，用1 %BSA 溶液按1∶500 比例稀釋二抗（Dylight 488-labeledAntibody To Rabbit IgG），并加入100 μL 二抗于室溫條件下孵育1 h（避光操作）；孵育結(jié)束后，用1 × PBS 避光迅速清洗3 遍，加入Hoechst 33342，室溫條件下染色15 min（避光操作）；染核結(jié)束后，用1 × PBS 避光清洗5 次，并加入300 μL 的1×PBS，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照并記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均采用3 個(gè)及以上獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)的均值進(jìn)行比較，使用GraphpadPrism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間行t檢驗(yàn)確定組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，3 組及3 組以上采取Two-Way ANOVA 進(jìn)行比較，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建過表達(dá)Mtb Rv3737 的恥垢分枝桿菌菌株為研究Rv3737 在Mtb 感染巨噬細(xì)胞過程中的作用，通過PCR 擴(kuò)增Mtb Rv3737 全基因組序列，并與穿梭質(zhì)粒pMV261 構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pMV261-Rv3737，并將pMV261-Rv3737 融合表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至MS 感受態(tài)細(xì)胞中，以建立過表達(dá)Mtb Rv3737 的MS，即MS：：pMV261-Rv3737，并通過PCR（圖1A）及Western blot（圖1B）鑒定目的基因Rv3737 及pFlag 的表達(dá)，結(jié)果表明成功構(gòu)建過表達(dá)Mtb Rv3737 的MS 菌株。

圖1 PCR 和Western blot 驗(yàn)證過表達(dá)Rv3737 的恥垢分枝桿菌菌株Fig.1 Verified the over-expressed Rv3737 in the Mycobacterium smegmis through PCR and Western blot

2.2 Rv3737 不影響MS 的胞外生長，但能促進(jìn)MS在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活由于Mtb 與宿主細(xì)胞長期共存的過程中，Mtb 通過一系列機(jī)制逃逸宿主免疫系統(tǒng)的攻擊從而促進(jìn)Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)Rv3737 可能作為毒力因子參與Mtb 菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。因此，本研究MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 通過檢測OD600及菌落計(jì)數(shù)的方法進(jìn)一步探討Rv3737對MS 在體外及巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的影響。首先，MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 在含有卡那霉素的7H9 液體培養(yǎng)基中生長，檢測OD600，繪制生長曲線圖，結(jié)果（圖2A）表明過表達(dá)Mtb Rv3737 不影響MS 的體外生長。其次，將MS：：Rv3737 和MS：：pMV261 以MOI=10 感染RAW264.7 細(xì)胞后，通過菌落計(jì)數(shù)檢測菌落數(shù)的改變，結(jié)果（圖2B）顯示Rv3737 促進(jìn)了MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。

圖2 Rv3737 對于Ms 的體外生長及巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活的影響Fig.2 The survival of Rv3737 in vitro and Mycobacterium smegmis-infected macrophages

2.3 Rv3737 抑制MS 感染巨噬細(xì)胞的自噬越來越多的研究認(rèn)為，Mtb 相關(guān)毒力基因通過抑制巨噬細(xì)胞自噬從而促進(jìn)Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，且既往研究認(rèn)為與Rv3737 高度同源的ThrE 可能通過影響mTOR 信號通路調(diào)控棒狀桿菌的存活［10］，為進(jìn)一步探討Rv3737 是否通過影響巨噬細(xì)胞自噬從而促進(jìn)Ms 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。將MS：：pMV261-Rv3737 和MS：：pMV261 菌株感染巨噬細(xì)胞8 h，通過Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白LC3II的變化及激光共聚焦檢測LC3 自噬點(diǎn)的改變，結(jié)果（圖3A、B）表明MS：：pMV261-Rv3737 組與MS：：pMV261 組相比，MS：：pMV261-Rv3737 感染巨噬細(xì)胞組LC3II 表達(dá)量明顯降低；激光共聚焦結(jié)果表明過表達(dá)Rv3737 組感染巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞內(nèi)綠色熒光標(biāo)記的自噬點(diǎn)明顯減少，表明Rv3737 抑制了MS 感染巨噬細(xì)胞自噬點(diǎn)的產(chǎn)生。綜上所述，Rv3737 抑制了MS 感染巨噬細(xì)胞的自噬信號通路。

圖3 Rv3737 抑制恥垢分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的自噬Fig.3 Rv3737 inhibited the autophagy of Mycobacterium smegmis-infected macrophages

3 討論

Mtb 的不斷蔓延，尤其是耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)，給結(jié)核病的治療帶來了嚴(yán)重的威脅。Mtb 與巨噬細(xì)胞長期共存的過程中，Mtb 在宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的生存能力，這主要是由于Mtb 產(chǎn)生了許多毒力因子，從而抵抗宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，作為Mtb 跨膜蛋白的Rv3737 在臨床菌株中呈高表達(dá)趨勢，且與肺部嚴(yán)重程度及Mtb 的復(fù)制存在一定的相關(guān)性，表明Rv3737 可能是Mtb 的重要毒力因子。且既往研究認(rèn)為，與Rv3737 高度同源的ThrE 涉及蘇氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)［10］，而自噬信號通路中的主要因子mTOR（雷帕霉素）作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶來影響細(xì)胞的生存和繁殖［14］。由于目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Mtb跨膜蛋白Rv3737 的功能及其機(jī)制，因此本研究旨在探索Rv3737 對Ms 與宿主之間相互作用的影響。

Ms 具有無致病性、繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，常作為研究Mtb 功能及其作用機(jī)制的模式菌［12-13］。本研究主要通過將Mtb 的Rv3737 轉(zhuǎn)入MS 中，構(gòu)建過表達(dá)Rv3737 的菌株模型，以探索Rv3737 對MS 與巨噬細(xì)胞之間相互作用的影響。本研究通過MS感染刺激巨噬細(xì)胞后檢測其胞內(nèi)MS 的存活情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Rv3737 可促進(jìn)MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，通過胞外生長實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rv3737 對MS 體外生長并無明顯影響，表明Rv3737 的表達(dá)確實(shí)促進(jìn)了MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。YANG 等［15］發(fā)現(xiàn)Mtb 表面相關(guān)蛋白Rv1515c 在MS 中過表達(dá)促進(jìn)了MS 在胞內(nèi)的存活，且GONG 等［16］報(bào)道的Rv3717 蛋白也可通過靶向凋亡通路以促進(jìn)MS 在胞內(nèi)的存活，而ALI 等［17］的研究發(fā)現(xiàn)Rv1523 可能通過干預(yù)細(xì)胞壁脂質(zhì)的組成而促進(jìn)Mtb 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存。

自噬是一種復(fù)雜的胞內(nèi)降解過程，其主要通過吞噬降解外來入侵的病原體，增強(qiáng)宿主細(xì)胞的免疫防御功能，自噬在Mtb 的發(fā)病機(jī)制中扮演者重要角色［18］。然而，Mtb 在被巨噬細(xì)胞吞噬后，長期暴露在缺氧、酸性及營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中，逐漸形成了抵抗宿主殺傷的免疫逃避機(jī)制［19］。為進(jìn)一步探討Rv3737 促進(jìn)MS 內(nèi)存活是否通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬發(fā)揮效應(yīng)，本研究將過表達(dá)Rv3737 的MS感染刺激巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明Rv3737 明顯抑制了巨噬細(xì)胞的自噬。因此，我們初步推測，跨膜蛋白Rv3737 可能通過抑制巨噬細(xì)胞自噬而促進(jìn)MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活。PADHI 等［20］的研究發(fā)現(xiàn)Mtb的毒力蛋白LprE 也可通過抑制自噬通路來促進(jìn)分枝桿菌的存活，其具體機(jī)制在于干擾了自噬通路中自噬體-溶酶體的融合階段。此外，Eis［21-22］、ESAT6［23］、PE＿PGRS41［24］、pknG［25］及PPE51［26］等Mtb 相關(guān)蛋白也可通過調(diào)控自噬途徑而有利于Mtb 的持續(xù)存在。但就Rv3737 抑制巨噬細(xì)胞自噬的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究將Rv3737 轉(zhuǎn)入MS 中以構(gòu)建Rv3737 過表達(dá)菌株，發(fā)現(xiàn)Rv3737 并不影響MS的體外生長，但能促進(jìn)MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，且Rv3737 抑制了巨噬細(xì)胞的自噬，由此推測Mtb Rv3737 可能通過抑制巨噬細(xì)胞的自噬從而促進(jìn)MS 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，為結(jié)核病的治療提供潛在的靶點(diǎn)［27］。

【Author contributions】FU Xuefeng performed the experiments andwrote the article. LOU Siyu performed the experiments. FU Xuefeng and PENG Zhangli revised the article. PENG Zhangli designed the study and reviewed the article. All authors read and aplproved the final manuscript as sub-mitted.