胰高血糖素樣肽1受體基因遺傳變異對(duì)利拉魯肽治療2型糖尿病患者療效的影響

任麗君 高紅紅 宋瑞捧

河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（鄭州 450002）

2 型糖尿?。═2DM）作為一種以慢性高血糖為特征的慢性多因素代謝紊亂癥，有研究預(yù)測(cè)到2030年全球大約有3.66 億人患有糖尿病，其中90%以上為T2DM［1］。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生率出現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，給臨床治療帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)，也對(duì)患者的生活質(zhì)量和心理健康等多方面的改善提出了更高的要求［2］。

胰高血糖素樣肽1 受體（GLP1R）是GLP-1 與胰腺β 細(xì)胞上的特異性受體［3］。既往研究結(jié)果表明GLP1R 中最常見(jiàn)的變異是G168S（rs6923761）和A131P（rs3765467）［4］，這些遺傳變異與糖尿病的發(fā)病機(jī)制、肥胖以及對(duì)不同糖尿病藥物的反應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)［5］。此外，該基因的遺傳變異的臨床意義可能具有種族差異，比如日本人群中的研究表明GLP1R 基因多態(tài)性可能是糖尿病發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)促進(jìn)因素，然而高加索人群的研究中GPL1R 的遺傳變異與脂質(zhì)代謝和T2DM 沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)［5］。利拉魯肽作為一種GLP-1 類似物，特異性和GLP1R結(jié)合從而發(fā)揮促進(jìn)胰島素分泌等一系列的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)。然而，利拉魯肽的臨床治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了不同患者的療效會(huì)表現(xiàn)出較大的個(gè)體差異［6］。因此，很有必要從遺傳變異角度探討影響利拉魯肽療效的生物標(biāo)記物。

目前在中國(guó)的T2DM 患者中尚無(wú)大樣本的關(guān)于GLP1R 基因遺傳變異和利拉魯肽治療T2DM 療效的關(guān)聯(lián)研究。因此本研究旨在探討真實(shí)世界中GLP1R 基因遺傳變異對(duì)利拉魯肽單藥治療T2DM患者的療效的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)及入排標(biāo)準(zhǔn)由于利拉魯肽在中國(guó)上市多年，已經(jīng)有較多的T2DM 患者在臨床上接受了利拉魯肽的治療。因此，本研究設(shè)計(jì)為回顧性臨床研究，納入從2018年1月至2022年3月在河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科接受利拉魯肽單藥治療的T2DM 患者。本研究的具體納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）患者為早期T2DM，既往未使用過(guò)GLP-1類似物進(jìn)行治療；（2）年齡≥18 歲；（3）體質(zhì)指數(shù)（BMI）＞24 kg/m2；（4）患者的空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，或餐后2 h血糖（2h PG）≥11.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%；（5）研究前的3 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行減肥節(jié)食；（6）患者接受利拉魯肽單藥治療超過(guò)12 周。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)臨床診斷的其他類型的糖尿??；（2）有甲狀腺髓樣癌既往史或家族史的患者以及2 型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征的患者；（3）在使用利拉魯肽進(jìn)行治療的同時(shí)合并其他降血糖的藥物治療的患者。本研究的研究流程圖如圖1 所示，最終共計(jì)219 例的患者符合研究目的并納入本研究進(jìn)行分析。

圖1 本回顧性臨床研究的流程圖Fig.1 Flow chart of the retrospective study

本研究得到河南省直第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有納入研究的患者均知曉本研究方案并簽署知情同意書。

1.2 治療方案及觀察指標(biāo)所有患者均進(jìn)行皮下注射利拉魯肽［諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司分包裝，國(guó)藥準(zhǔn)字J20160037，規(guī)格：3 mL：18 mg］進(jìn)行治療，初始劑量0.6 mg/d，1 周后調(diào)整劑量為1.2 mg/d，治療期間可根據(jù)不同患者的血糖水平變化進(jìn)行劑量調(diào)整，最大劑量為1.8 mg/d［7］。

患者在接受利拉魯肽治療前和接受利拉魯肽12 周治療后檢查患者的FPG、HbA1c、體質(zhì)量、BMI和腰臀比（WHR）。此外，12 周后根據(jù)HbA1c 的情況評(píng)估HbA1c 的達(dá)標(biāo)率（HbA1c ＜7.0% 的患者比例）［8］。

1.3 DNA 提取及基因分型在患者檢查FPG 等相關(guān)指標(biāo)時(shí)留取患者外周靜脈血大約5 mL，采用MiniBEST 全血DNA 提取試劑盒（貨號(hào)：9781；Takara）從全血中提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。在Applied Biosystems 7900 Fast Real-Time PCR 系統(tǒng)中，按照說(shuō)明書，使用TaqMan?試劑盒C_1340370_10（貨號(hào)：4351379；Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行基因分型。

根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中GLP1R基因的在中國(guó)人群中的多態(tài)性位點(diǎn)，本研究選取GLP1R基因的兩個(gè)遺傳變異位點(diǎn)A131P（rs3765467）和G168S（rs6923761）進(jìn)行多態(tài)性分析。后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析只發(fā)現(xiàn)了A131P 位點(diǎn)和療效的顯著關(guān)聯(lián)性，因此本研究只展示了A131P 位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果。

1.4 GLP-1R基因mRNA表達(dá)分析收集部分患者的新鮮外周血標(biāo)本提取外周血單核細(xì)胞（PBMC）。最終收集82 例新鮮外周血標(biāo)本用淋巴細(xì)胞分離液Histopaque-1077 對(duì)樣本進(jìn)行PBMC 的提取。用Trizol 試劑提取PBMC 當(dāng)中的RNA，real-time PCR儀器進(jìn)行GLP-1R 基因的mRNA 表達(dá)分析，引物序列的上游引物：5′-ACGGTGTCCCTCTCAGAGAC-3′，下游引物5′-ATCAAAGGTCCGGTTGCAGAA-3′。用GAPDH 的mRNA 表達(dá)作為內(nèi)部參照［9］。分析中4 例患者的PBMC 標(biāo)本中的RNA 提取失敗，2 例患者提取的RNA 標(biāo)本不合格。因此只有76 例患者納入了GLP1R 基因的mRNA 表達(dá)分析。mRNA 用相對(duì)定量法采用2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析。離散型的變量和rs2297136 位點(diǎn)不同基因型的分布采用χ2檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的連續(xù)型的變量和rs2297136位點(diǎn)不同基因型的分析用（）表示，組間均值比較采用t檢驗(yàn)，治療前后的指標(biāo)使用配對(duì)t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量和rs2297136 位點(diǎn)不同基因型的分析用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 219 例患者中GLP1R 基因A131P 位點(diǎn)不同基因型患者的基線臨床資料本研究入組的219 例T2DM 患者的基線臨床資料如表1 所示，既往接受其他降糖藥物治療的患者一共186 例（84.9%）。既往降糖藥物中接受二甲雙胍方案患者114 例（61.3%），接受胰島素方案患者39 例（21.0%），接受其他降糖藥物方案患者33 例（17.7%）。

表1 219 例患者中A131P 位點(diǎn)不同基因型患者的基線臨床資料對(duì)比Tab.1 Comparison of the baseline characteristics of 219 patients according to genotype status of A131P polymorphism ±s

表1 219 例患者中A131P 位點(diǎn)不同基因型患者的基線臨床資料對(duì)比Tab.1 Comparison of the baseline characteristics of 219 patients according to genotype status of A131P polymorphism ±s

指標(biāo)總計(jì)（n = 219）χ2/t/U 值P 值年齡［M（P25，P75），歲］性別［例（%）］46（21，68）GLP1R A131P GG（n = 158）45（21，67）GA/AA（n = 61）46（23，68）-0.485 0.618 0.486男女121（55.3）98（44.7）85（53.8）73（46.2）36（59.0）25（41.0）既往降糖藥物治療史［例（%）］0.581 0.446有無(wú)糖尿病病程（年）FPG（mmol/L）HbA1c（%）體質(zhì)量（kg）BMI（kg/m2）WHR 186（84.9）33（15.1）2.2 ± 1.9 11.3 ± 1.1 8.2 ± 0.7 78.2 ± 5.3 28.3 ± 3.5 0.98 ± 0.06 136（86.1）22（13.9）2.2 ± 2.3 11.2 ± 1.2 8.2 ± 0.9 78.1 ± 4.1 28.3 ± 4.4 0.98 ± 0.09 50（81.9）11（18.1）2.3 ± 1.4 11.4 ± 0.9 8.1 ± 1.0 78.2 ± 6.7 28.2 ± 3.9 0.97 ± 0.07-0.317-1.179 0.765-0.134 0.155 0.781 0.376 0.240 0.445 0.447 0.438 0.436

A131P 位點(diǎn)的基因分型結(jié)果為：GG 型158 例（72.1%），GA 型56 例（25.6%），AA 型5 例（2.3%），最小等位基因頻率為0.15，基因型患者例數(shù)符合哈迪溫伯格平衡（P=0.988）。后期分析中將GA 和AA 基因型患者合并?；€臨床資料對(duì)比結(jié)果如表1 所示，該位點(diǎn)不同基因型患者在基線臨床資料中的分布基本均衡（P＞0.05）。

2.2 利拉魯肽在T2DM患者中的降糖和減重療效如表2 所示，納入研究的患者在接受利拉魯肽12 周后治療后，血糖和肥胖相關(guān)指標(biāo)均有明顯的改善，與治療前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

表2 219 例T2DM 患者接受利拉魯肽治療前后的療效對(duì)比Tab.2 Comparison of the efficacy in the 219 patients with T2DM before and after liraglutide treatment ±s

表2 219 例T2DM 患者接受利拉魯肽治療前后的療效對(duì)比Tab.2 Comparison of the efficacy in the 219 patients with T2DM before and after liraglutide treatment ±s

療效指標(biāo)FPG（mmol/L）HbA1c（%）體質(zhì)量（kg）BMI（kg/m2）WHR治療前（n = 219）11.3 ± 1.1 8.2 ± 0.7 78.2 ± 5.3 28.3 ± 3.5 0.98 ± 0.06治療后（n = 219）5.7 ± 1.4 6.5 ± 1.2 74.4 ± 6.5 26.9 ± 4.8 0.90 ± 0.11 t 值46.546 18.109 11.024 3.488 9.449 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 GLP1R 基因A131P 多態(tài)性對(duì)利拉魯肽降糖和減肥療效的影響降糖指標(biāo)如表3所示，158例GG型患者和61 例GA/AA 基因型患者接受利拉魯肽治療后FPG分別為（5.5±1.7）mmol/L和（6.2±1.3）mmol/L（t= -2.903，P= 0.002）。GG 基因型和GA/AA 基因型的FPG 變化值分別為（-6.1 ± 1.6）mmol/Lvs.（-4.3±1.1）mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.075，P＜0.001）。兩組基因型患者的HbA1c 分別為（6.3 ± 1.8）%和（7.1 ± 1.1）%，差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -3.243，P＜0.001）。此外，接受12 周的利拉魯肽治療后共計(jì)129 例HbA1c 達(dá)標(biāo)（58.9%）。不同基因型患者的HbA1c 達(dá)標(biāo)情況如圖2 所示，GG 型和GA/AA 基因型患者的HbA1c 達(dá)標(biāo)率分別為64.6%（95%CI：56.6%～72.0%）和44.3%（95%CI：31.5% ～57.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 7.488，P= 0.006）。

圖2 接受12 周利拉魯肽治療后不同基因型患者的HbA1c 達(dá)標(biāo)率對(duì)比Fig.2 Comparison of target HbA1c achievement rate of patients after 12 weeks liraglutide treatment according to A131P genotype status

接受利拉魯肽治療后的減重指標(biāo)結(jié)果如表3所示，158 例GG 型患者和61 例GA/AA 基因型患者12 周后的體質(zhì)量分別為（73.5 ± 7.1）kg 和（76.7 ±6.9）kg（t=-3.013，P=0.001）。GG 基因型和GA/AA基因型的體質(zhì)量變化值分別為（-4.5 ± 3.1）kgvs.（-1.5 ± 1.1）kg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -7.372，P＜0.001）。兩組基因型患者12 周后的BMI 分別為（26.6±3.1）kg/m2和（27.7±2.7）kg/m2（t=-2.437，P= 0.008）。GG 基因型和GA/AA 基因型的BMI 變化值分別為（-1.7±1.5）kg/m2vs.（-0.5±0.9）kg/m2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.850，P＜0.001）。兩組基因型患者12 周后的WHR 分別為0.89±0.09 和0.93±0.11，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -2.766，P= 0.003）。

表3 A131P 多態(tài)性不同基因型患者接受利拉魯肽治療12 周后的療效對(duì)比Tab.3 Comparison of the efficacy in the patients after 12 weeks liraglutide treatment according to A131P genotype status ±s

表3 A131P 多態(tài)性不同基因型患者接受利拉魯肽治療12 周后的療效對(duì)比Tab.3 Comparison of the efficacy in the patients after 12 weeks liraglutide treatment according to A131P genotype status ±s

療效指標(biāo)FPG（mmol/L）HbA1c（%）體質(zhì)量（kg）BMI（kg/m2）WHR GG（n = 158）5.5 ± 1.7 6.3 ± 1.8 73.5 ± 7.1 26.6 ± 3.1 0.89 ± 0.09 GA/AA（n = 61）6.2 ± 1.3 7.1 ± 1.1 76.7 ± 6.9 27.7 ± 2.7 0.93 ± 0.11 t 值-2.903-3.243-3.013-2.437-2.766 P 值0.002＜0.001 0.001 0.008 0.003

2.4 GLP1R基因A131P位點(diǎn)對(duì)GLP1R基因mRNA表達(dá)的影響76 例T2DM 患者納入GLP1R 基因mRNA 表達(dá)分析，A131P 位點(diǎn)的基因型分布情況為55 例患者是GG 基因型（72.4%），19 例患者是GA基因型（25.0%），2 例患者是AA 基因型（2.6%）。因此，MAF 值同樣為0.15。三種基因型的分布頻率和219 例T2DM 患者中的基因型分布基本一致（P＞0.05）。A131P 位點(diǎn)不同基因型患者的GLP1R基因mRNA 表達(dá)如圖3 所示，GG 基因型和GA/AA基因型患者的GLP1R 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為2.38 ± 0.50 和1.88 ± 0.43，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 4.081，P＜0.001）。

圖3 A131P 位點(diǎn)不同基因型的GLP1R 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)情況Fig.3 Relative expression level of GLP1R gene mRNA according to GLP1R A131P genotype status

3 討論

GLP1 是由回腸/結(jié)腸黏膜中的L 細(xì)胞合成，研究發(fā)現(xiàn)GLP1 作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在維持血糖水平、飲食攝入和其他代謝活動(dòng)中起著重要的生理作用，GLP1R 為GLP1 的主要受體，在血糖穩(wěn)態(tài)和T2DM 治療中發(fā)揮重要作用，該受體長(zhǎng)463 個(gè)氨基酸，包含7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員［10］。GLP1 在體內(nèi)的主要作用過(guò)程為食物攝入后，GLP-1 從回腸細(xì)胞分泌到血液循環(huán)中，作用于不同組織（腦、胰島、心臟、腎臟和胃腸道），以減輕攝入富含碳水化合物食物后血糖水平的升高?？刂蒲撬降臋C(jī)制主要通過(guò)改善葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌、刺激胰島素分泌β 細(xì)胞生長(zhǎng)、延緩胃排空（從而減少餐后血糖偏移）以及降低食欲［11］。利拉魯肽作為一種GLP-1 激動(dòng)劑，目前已經(jīng)在臨床上大范圍應(yīng)用于T2DM 的血糖和體質(zhì)量控制。然而，由于人體內(nèi)的遺傳變異的影響，利拉魯肽臨床應(yīng)用過(guò)程中療效出現(xiàn)相對(duì)較大的個(gè)體差異。需要進(jìn)一步探索可以影響利拉魯肽療效的生物標(biāo)記物［12］。

考慮到合并用藥可能會(huì)影響患者療效的判斷，因此本研究納入了219 例接受利拉魯肽單藥治療的T2DM 患者，從而可以更明確地判斷GLP1R基因多態(tài)性和利拉魯肽療效的關(guān)聯(lián)［13］。研究納入的219 例患者為臨床常見(jiàn)的T2DM 患者，其中186 例患者既往曾接受過(guò)其他降糖藥物的治療，且219 例患者納入研究時(shí)的平均HbA1c 為9.2%，平均BMI（28.3 kg/m2）也提示這些患者為輕度肥胖的T2DM 患者，因此這些患者接受利拉魯肽單藥的治療也是符合臨床治療規(guī)范的［14］。219 例患者在接受利拉魯肽治療12 周后FPG、HbA1c 以及HbA1c 達(dá)標(biāo)率（＜7%）等血糖指標(biāo)和體質(zhì)量，BMI 以及WHR等肥胖指標(biāo)均有顯著的下降，研究結(jié)果和既往利拉魯肽在真實(shí)世界中對(duì)T2DM 伴輕度肥胖患者的療效基本一致［15］。然而，需要注意的是，本研究中FPG 指標(biāo)和HbA1c 的平均下降幅度較其他研究相對(duì)較多，原因可能是本研究納入的是相對(duì)早期的T2DM 患者，既往接受的降糖藥物治療相對(duì)不多，可能對(duì)利拉魯肽更為敏感，所以降糖效果更為明顯［16］?；蚨鄳B(tài)性分析結(jié)果A131P 位點(diǎn)在研究患者中的MAF 為0.15，這和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)患者的該位點(diǎn)分布頻率基本一致，也和既往的研究結(jié)果相符［17］。本研究結(jié)果表明接受12 周的利拉魯肽治療后，與GG 基因組相比，A 等位基因攜帶患者的FPG、HbA1c、體質(zhì)量、BMI 和WHR 下降幅度均較低。而且GG 基因型患者的HbA1c 達(dá)標(biāo)率顯著高于GA/AA 基因型患者（64.6%vs.44.3%，P=0.006）。研究結(jié)果和既往GUAN 團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果保持一致。他們的研究納入了176 例接受GLP1 激動(dòng)劑（艾塞那肽和利拉魯肽）治療的T2DM 患者，分析了GLP1R 多態(tài)性rs10305420 和rs3765467 兩個(gè)位點(diǎn)和療效的關(guān)聯(lián)［18］。結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了rs3765467 基因型的GG 型患者HbA1c 下降幅度更大，且HbA1c 達(dá)標(biāo)率更高（50.9%vs.23.8%）。然而，由于GUAN 團(tuán)隊(duì)納入的患者接受的治療不均一，除了利拉魯肽外還有別的降糖藥物，這可能會(huì)影響多態(tài)性和療效結(jié)果的判斷。本研究納入的患者均接受了利拉魯肽單藥的治療，且進(jìn)一步探討了該位點(diǎn)和體質(zhì)量、BMI 以及WHR 的關(guān)聯(lián)，結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了該位點(diǎn)可能成為預(yù)測(cè)利拉魯肽療效的生物標(biāo)記物。同樣，既往DE 團(tuán)隊(duì)在西班牙的糖尿病患者中分析了GLP1R 基因多態(tài)性的臨床意義［19］。研究納入了90例接受利拉魯肽治療的糖尿病患者分析了GLP1R基因的多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs6923761 位點(diǎn)和利拉魯肽的減肥指標(biāo)（體質(zhì)量和BMI）顯著相關(guān)。然而，在中國(guó)人群中rs6923761 位點(diǎn)非常保守，幾乎不存在遺傳變異。因此，以上的多態(tài)性研究結(jié)果也都提示了GLP1R 基因遺傳變異可能會(huì)在一定程度上影響該受體的功能從而干擾了利拉魯肽的臨床治療效果。

為了進(jìn)一步探討A131P 位點(diǎn)影響利拉魯肽療效的可能原因，本研究在76 例患者中進(jìn)行了GLP1R 基因mRNA 表達(dá)分析，結(jié)果提示GA/AA 基因型患者伴隨了相對(duì)較低的GLP1R 基因mRNA表達(dá)。結(jié)果提示了A131P 位點(diǎn)可能在體內(nèi)通過(guò)改了該基因的mRNA 表達(dá)可能一定程度上影響了該受體的功能。既往LI 團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果提示rs3765467 位點(diǎn)可能因?yàn)榛蛐偷母淖冇绊懥甩?細(xì)胞胰島素的分泌從而降低了GLP1 激動(dòng)劑的療效［20］。這在一定程度上也和本研究中的結(jié)果基本一致。然而，在體內(nèi)A131P 位點(diǎn)具體通過(guò)什么途徑影響利拉魯肽的療效尚需要機(jī)制研究進(jìn)一步探討。

當(dāng)然，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究只納入了本院接受治療的患者，大部分患者是當(dāng)?shù)鼐用瘢z傳學(xué)特征相對(duì)較為單一，多態(tài)性分析尚需要在遺傳學(xué)更豐富的人群中進(jìn)一步探討。此外，研究的樣本量偏小，后期未進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪，試驗(yàn)結(jié)果可能存在一定的偏倚。然而，本研究通過(guò)相對(duì)豐富的數(shù)據(jù)確定了GLP1R 基因多態(tài)性位點(diǎn)A131P 對(duì)利拉魯肽治療T2DM 的療效具有潛在的影響。研究結(jié)果也初步表明GLP1R 基因A131P位點(diǎn)可能可以用作預(yù)測(cè)利拉魯肽降糖和減重療效的潛在的生物標(biāo)記物。未來(lái)尚需要進(jìn)一步開(kāi)展機(jī)制研究去探索A131P 位點(diǎn)影響利拉魯肽臨床療效的潛在機(jī)制。

【Author contributions】REN Lijun performed the experiments and wrote the article. GAO Honghong performed the experiments. REN Lijun and SONG Ruipeng revised the article. SONG Ruipeng designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.