宣白承氣湯對(duì)急性呼吸窘迫綜合征大鼠BTLA/HVEM通路及肺功能的影響

張軼強(qiáng) 李詠紅 向丹 張玉沛

(荊門市中醫(yī)醫(yī)院肺病科，湖北 荊門 448002)

2019年新型冠狀病毒疾病已在中國(guó)和世界各地發(fā)生，感染的重癥肺炎患者會(huì)迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，并因多器官衰竭而死亡。盡管支持治療方法有所進(jìn)步，ARDS仍與高死亡率和高發(fā)病率有關(guān)〔1,2〕。ARDS是一種復(fù)雜的臨床綜合征，各種創(chuàng)傷、藥物攝入、細(xì)菌性或病毒性肺炎、敗血癥等引起的急性肺損傷(ALI)均可導(dǎo)致ARDS的發(fā)生〔3〕，其特征在于急性炎癥、呼吸急促、低氧血癥、彌漫性肺泡浸潤(rùn)及肺血管和上皮通透性增加〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)ARDS的發(fā)病與高炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)〔5〕，涉及先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的多種免疫細(xì)胞，如肺泡巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞介導(dǎo)肺損傷的發(fā)生發(fā)展〔6,7〕。近年來(lái)中醫(yī)藥在治療ALI/ARDS中取得顯著療效，宣白承氣湯就是其中一種，而且其在臨床上的使用頻次最多〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯在新型冠狀病毒肺炎的治療上效果顯著〔9〕，可降低ARDS的病死率〔10〕。但具體作用機(jī)制尚不明確。宣白承氣湯對(duì)ALI/ARDS的治療是否與機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān)尚未可知。本研究旨在探討其對(duì)ARDS肺損傷的影響及可能的作用機(jī)制，為ARDS治療和宣白承氣湯臨床更廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 從北京維通利華動(dòng)物中心購(gòu)入SPF級(jí)Wistar大鼠72只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011，大鼠飼養(yǎng)在可控的環(huán)境中保持12 h明/暗循環(huán)，自由獲取食物和水。

1.2藥品及試劑 宣白承氣湯〔生石膏15 g，大黃(后下)10 g，苦杏仁15 g，瓜蔞皮15 g〕，以上藥材均購(gòu)自河南張仲景大藥房；上述藥材加入8倍量的水分充分浸泡30 min，煎煮40 min，過(guò)濾藥液，藥渣再加入6倍量的水繼續(xù)煎煮40 min后過(guò)濾藥液，合并藥液并濃縮至1 ml相當(dāng)于生藥2.5 g。

脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：RA20035、RA20020-S、RA20132、RA20090；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記小鼠抗大鼠CD3單抗(554832)、別藻藍(lán)蛋白(APC)小鼠抗大鼠CD4(550057)、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記小鼠抗大鼠CD8a單抗(554857)均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；FITC標(biāo)記抗大鼠BTLA單抗、FITC標(biāo)記抗大鼠HVEM單抗購(gòu)自上海微蒙生物技術(shù)有限公司；血?dú)夥治鰞x(型號(hào)：ABL90 FLEX，丹麥Radiometer)；多功能酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀(型號(hào)：iMark680、BD FACSCanto Ⅱ，美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(型號(hào)：IX73，日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取12只大鼠為空白組，大鼠用3%戊巴比妥鈉以50 mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉，除空白組外，其余大鼠參考文獻(xiàn)〔11〕通過(guò)氣管內(nèi)滴入100 μl的LPS溶液(生理鹽水稀釋至5 mg/kg)造模；空白組氣管內(nèi)滴入等量生理鹽水。24 h后，若大鼠出現(xiàn)精神萎靡，倦怠，活動(dòng)減少，食欲減退，便秘等癥狀，呼吸頻數(shù)增加，出現(xiàn)呼吸窘迫，氧合指數(shù)<300 mmHg〔12〕，說(shuō)明ARDS構(gòu)建成功。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、宣白承氣湯高、中、低劑量組(22.8、11.4、5.7 g/kg)，每組12只。開始給藥，宣白承氣湯各劑量組灌胃相應(yīng)劑量的藥物，空白組和模型組灌胃等量生理鹽水，1次/d，給藥7 d。計(jì)量換算：給藥劑量按成人平均體質(zhì)量60 kg體表面積換算，對(duì)應(yīng)給藥劑量為成人的6.25倍，宣白承氣湯成人每日給藥劑量相當(dāng)于生藥55 g，則大鼠每日給藥劑量為5.7 g/kg，因此設(shè)置低、中、高劑量藥物劑量為5.7、11.4、22.8 g/kg。

1.3.2形態(tài)學(xué)觀察 給藥期間，觀察各組大鼠的精神狀況、毛色、飲食、活動(dòng)等一般狀態(tài)，并記錄。

1.3.3動(dòng)脈血?dú)夥治?大鼠稱重后，麻醉并記錄體重，從頸動(dòng)脈抽取大鼠動(dòng)脈血，立即使用血?dú)夥治鰞x測(cè)定動(dòng)脈血中的氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)；計(jì)算氧合指數(shù)(P/F)和肺泡-動(dòng)脈血氧分壓差P(A-a)O2。本實(shí)驗(yàn)大鼠吸入空氣(氧氣濃度21%)，故吸入氧氣濃度(FiO2)為0.21。

肺泡-動(dòng)脈血氧分壓差〔P(A-a)O2，mmHg〕=(PIO2-PaCO2×1/R)-PaO2〔PAO2為肺泡氣氧分壓；PIO2為吸入氣氧分壓=FiO2×(大氣壓-47)；R為呼吸商，等于0.8〕。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群 大鼠抽取動(dòng)脈血后，用毛細(xì)管從眼眶取外周血樣品置于15 ml離心管(含1 ml抗凝劑)中，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行離心，分離并棄去上清液。加入3 ml溶血素后，冰上放置4～5 min，離心，棄上清液，然后加入PBS，獲得外周血細(xì)胞懸液。將100 μl的外周血細(xì)胞懸液放入2 ml離心管中，然后與FITC標(biāo)記抗大鼠CD3單抗、APC標(biāo)記抗大鼠CD4單抗和PE標(biāo)記抗大鼠CD8a單抗混合。在離心管中加入PBS，4℃的冰箱中避光孵育30 min。然后，添加1 ml PBS，300 r/min離心5 min。除去上清液后，加入0.5 ml PBS重懸并用流式細(xì)胞儀分析。

1.3.5肺濕/干比(W/D)評(píng)估 處死大鼠后，取出肺組織，將大鼠的左側(cè)肺組織稱重，獲得肺濕重；然后將其在60℃下烘烤72 h后稱量，獲得每個(gè)樣品的干重。W/D=濕重/干重。

1.3.6肺組織病理學(xué)改變 每只大鼠固定于右肺相同位置切取部分組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺部病理學(xué)變化。

1.3.7肺組織炎性因子檢測(cè) 剩余的右肺組織，按照1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，研磨后離心，制備10%的肺組織勻漿，ELISA檢測(cè)勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10水平。

1.3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá) 取1.3.4獲得的外周血細(xì)胞懸液100 μl加入流式管中；加入FITC標(biāo)記抗大鼠BTLA單抗或HVEM單抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞，離心去上清，加入羊抗鼠PE二抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，再次洗滌細(xì)胞，去上清，然后分別加入APC標(biāo)記抗大鼠CD4單抗和PE標(biāo)記抗大鼠CD8a單抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞2次后用0.5 ml懸浮細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色標(biāo)記的方案檢測(cè)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠一般狀態(tài)的影響 空白組精神狀態(tài)良好，毛色光滑有光澤，較活躍；模型組精神萎靡，倦怠，毛色暗淡無(wú)光澤，活動(dòng)減少，食欲減退，出現(xiàn)便秘，呼吸困難等現(xiàn)象；宣白承氣湯高、中、低劑量組狀態(tài)較模型組發(fā)生不同程度的改善，活動(dòng)、飲食量增加，無(wú)明顯呼吸困難現(xiàn)象。

2.2宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2的影響 與空白組相比，模型組PaO2、P/F顯著降低，P(A-a)O2顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組大鼠PaO2、P/F明顯升高，P(A-a)O2明顯降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表1。

2.3宣白承氣湯對(duì)W/D的影響 與空白組相比，模型組W/D顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組W/D明顯降低(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表1。

表1 宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2、W/D的影響

2.4宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠肺組織病理變化的影響 空白組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見明顯異常；模型組肺體積增大，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肺泡、肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡間隔增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有出血，部分有透明膜形成；宣白承氣湯高、中劑量組肺組織損傷程度明顯減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯透明膜形成；宣白承氣湯低劑量組肺組織上述損傷較模型組有所改善，但改善程度低于宣白承氣湯高、中劑量組。見圖1。

圖1 宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠肺組織病理變化的影響(HE染色，×200)

2.5宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠肺組織炎性因子的影響 與空白組相比，模型組肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-10水平顯著升高，IL-2水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β水平明顯降低，IL-2、IL-10水平明顯升高(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表2。

表2 宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠肺組織炎性因子的影響

2.6宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 與空白組相比，模型組外周血中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例及CD4+/CD8+比值均顯著降低，CD8+T值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中、低劑量組外周血中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例及CD4+/CD8+比值明顯升高，CD8+T值明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；見表3。

2.7BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá) 與空白組相比，模型組外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面BTLA、HVEM表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，宣白承氣湯高、中劑量組外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面BTLA、HVEM表達(dá)明顯降低(P<0.05)，呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。見表4。

表3 宣白承氣湯對(duì)ARDS大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

表4 BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)

3 討 論

有證據(jù)表明不同類型的免疫細(xì)胞參與了ARDS的發(fā)病機(jī)制，包括肺泡巨噬細(xì)胞(AMs)的極化，嗜中性粒細(xì)胞性中毒，輔助性T細(xì)胞亞群的促炎反應(yīng)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的抗炎和再生作用〔13〕。內(nèi)毒素是ARDS最重要的危險(xiǎn)因素，LPS誘導(dǎo)的大鼠模型模擬了由革蘭陰性桿菌感染或敗血性休克引起的一種ARDS，其病因和生理病理與人類患者非常相似，因此LPS誘導(dǎo)的模型具有重要的現(xiàn)實(shí)意義〔14〕。故本研究也采用了LPS進(jìn)行造模，結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的ARDS大鼠出現(xiàn)明顯的便秘，呼吸困難等現(xiàn)象，P/F顯著降低，且肺體積增大，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，肺泡、肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；說(shuō)明模型制備成功。

中醫(yī)認(rèn)為肺與大腸相表里，宣白承氣湯出自《溫病條辨》，由大黃、(生)石膏、苦杏仁、瓜蔞皮組成，具有清肺定喘，瀉熱通便的功效。其中(生)石膏為君藥，可瀉熱通便、攻積導(dǎo)滯；杏仁宣肺止咳，合用瓜蔞皮同走肺腸，可清肺化痰；且中醫(yī)藥治療ALI/ARDS的核心方藥組成中就有大黃、苦杏仁、石膏〔8〕。宣白承氣湯臨床上被廣泛應(yīng)用于ALI/ARDS、重癥肺炎(痰熱壅肺證)的治療，可改善P/F，降低內(nèi)毒素和炎癥因子水平〔15,16〕；還可增加重癥肺炎患者血清CD4+、CD4+/CD8+水平，降低CD8+水平，增強(qiáng)免疫〔17〕；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，宣白承氣湯可影響慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠外周血T淋巴細(xì)胞的亞群分布，調(diào)節(jié)輔助性T淋巴細(xì)胞比例〔18〕。有研究發(fā)現(xiàn)ALI患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范圍，CD8+高于正常范圍，出現(xiàn)了免疫抑制，升高患者外周血CD4+/CD8+值，糾正細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，能降低肺部及全身的炎癥反應(yīng)，明顯改善肺組織損傷〔19,20〕。IL-2是T細(xì)胞增殖所必需的細(xì)胞因子，IL-10是重要的炎癥抑制因子，LPS誘導(dǎo)IL-10的分泌增加，可能是由于急性炎癥引起的反饋?zhàn)饔盟隆?1〕；且外周血中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值顯著降低，CD8+T值顯著升高，說(shuō)明ARDS大鼠T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力受到抑制；宣白承氣湯可改善ARDS大鼠上述指標(biāo)的變化；提示宣白承氣湯可增強(qiáng)ARDS大鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能。

BTLA也稱為CD272，是一種免疫調(diào)節(jié)受體，主要在B、T和所有成熟淋巴細(xì)胞上表達(dá)，BTLA抑制T細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞因子產(chǎn)生〔22〕。HVEM為BTLA的特異性配體，BTLA對(duì)T細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于HVEM對(duì)T細(xì)胞的積極刺激作用，并防止了T細(xì)胞的過(guò)度活化〔23〕。BTLA/HVEM信號(hào)通路在各種炎癥，自身免疫和感染免疫反應(yīng)中起著雙向調(diào)節(jié)作用〔24〕。Zhang等〔25〕發(fā)現(xiàn)在腎移植患者中，急性排斥反應(yīng)接受者的外周CD3+T淋巴細(xì)胞中的BTLA表達(dá)明顯低于穩(wěn)定腎移植的對(duì)照患者，BTLA過(guò)表達(dá)可抑制IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生并增加IL-4和IL-10的產(chǎn)生，抑制急性排斥反應(yīng)并調(diào)節(jié)腎臟移植的同種異體反應(yīng)。通過(guò)阻斷BTLA與HVEM的結(jié)合，可激活衰老的CD8+T細(xì)胞對(duì)流感病毒的應(yīng)答〔26〕。本研究結(jié)果提示宣白承氣湯可下調(diào)BTLA/HVEM的表達(dá)，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。

綜上所述，宣白承氣湯可增強(qiáng)ARDS大鼠T淋巴細(xì)胞免疫功能，改善肺損傷；其機(jī)制可能與BTLA/HVEM的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。但是BTLA/HVEM在CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的調(diào)控因素及其對(duì)T細(xì)胞的抑制效應(yīng)和作用機(jī)制有待進(jìn)一步分析。