丁基苯酞對腦出血模型大鼠海馬區(qū)細胞凋亡的影響及相關機制

譚明萬 黃艷 胡亮 黃方舟

(長沙市第四醫(yī)院急診急救中心，湖南 長沙 410013)

腦出血是一種非外傷性腦組織內(nèi)血管破裂而引起的神經(jīng)內(nèi)科疾病，其病理發(fā)生機制主要為出血后血腫、局部腦血流改變、周邊水腫帶的形成、炎癥因子及腦組織血管活性物質(zhì)過度釋放等，導致腦內(nèi)神經(jīng)細胞的自由基受損和過度凋亡等問題，引起神經(jīng)功能受損〔1,2〕。丁基苯酞是在芹菜籽中提取的化學成分之一，相關研究發(fā)現(xiàn)，其具有增加缺血區(qū)腦灌注〔3〕、清除自由基、抑制神經(jīng)細胞凋亡〔4〕、減輕腦水腫〔5〕、減少氧化反應及炎癥反應〔6〕等作用。因丁基苯酞治療腦出血的研究減少，鑒于此，本文研究丁基苯酞對腦出血模型大鼠海馬區(qū)細胞凋亡的影響及相關機制，為臨床治療腦出血提供有效數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取50只健康雄性SD大鼠，6～10月齡，體重330～480 g，購自北京科奧力飼料有限公司，合格證號為京動(2000)第015號。50只大鼠分籠飼養(yǎng)，按時更換墊料并給予飼料、飲水，溫度保持21～25℃，濕度保持在40%～50%。

1.2方法

1.2.1腦出血模型大鼠的建立 從50只大鼠中任意選取10只大鼠為正常組，其余40只大鼠參考鄭希院等〔7〕文獻中腦出血模型建立，使用400 mg/kg 10%的水合氯醛麻醉注射于大鼠腹部，將大鼠于立體儀上固定，剃除大鼠頭部體毛并于頭部正中做縱行切口，將骨膜剝離，充分顯露冠狀縫和前囟，鉆直徑>1.0 mm小孔于前囟前中線右側(cè)2 mm、中線右側(cè)3 mm處，抽取股動脈50 μl血液在鉆孔處垂直進針5 mm左右，注入抽取的股動脈血，留針10 min后退出，使用消毒針縫合切口。大鼠腦橫斷面可見明顯血腫，血液沒有出現(xiàn)針道反流的情況，蛛網(wǎng)膜下腔無出血為建模成功，成功36只。

1.2.2分組和用藥 于建模成功6 h后將36只大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，各9只。低、中、高劑量組分別給予10、20、30 mg/kg的丁基苯酞，將其溶于大豆油中，每天進行2次灌胃。正常組和模型組(9只)給予等體積的大豆油代替灌胃。

1.2.3大鼠腦組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 于最后一次給藥后5 h進行麻醉，斷頭處死取其腦組織置于4℃冰箱中固定2 d；取出固定的組織，使用手術(shù)刀將其切成2 μm厚的樣品；將樣品經(jīng)乙醇梯度脫蠟至水，隨后放入Harris蘇木素染4～10 min，用純凈水清洗；迅速用1%的鹽酸乙醇進行分色，置于純凈水10～20 min；放入伊紅染液中染色3 min；常規(guī)脫水后封片，于顯微鏡下進行觀察。

1.2.4大鼠海馬區(qū)細胞凋亡率的檢測 采用流式細胞儀(北京德利卡生物科技有限公司)檢測大鼠海馬區(qū)細胞凋亡率，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細胞傳代至5孔板，將0.25%胰蛋白酶加入進行消化，1 500 r/min的離心機處理10 min海馬區(qū)細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，于避光常溫處將離心的海馬區(qū)細胞收取，加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，60 min后用特異熒光標記，用鞘液包裹，嚴格按照流式細胞儀操作說明進行檢測。

1.2.5腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分的測定 (1)使用干濕質(zhì)量法檢測腦組織含水量：分別測量(精度0.1 mg的電子天平)各組大鼠腦組織濕重，隨后放置于100℃的恒溫干燥箱進行1 d的烘焙，腦組織不再減輕后暫停，測量大鼠腦組織質(zhì)量。(腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕重×100%=腦組織含水量。(2)參考彭璇等〔8〕文獻中介紹的方法，采用Morris水迷宮實驗裝置，記錄大鼠學習記憶能力評分。大鼠在Morris水迷宮中的訓練6 d后，于第7天將時間均值記錄下來，為最終測定效果。(3)采用Longa評分方法評定大鼠神經(jīng)功能，無任何體征為0分；大鼠前肢不能全部伸直為1分；大鼠一側(cè)肢體癱瘓且有追尾現(xiàn)象為2分；大鼠不能站立、不能打滾為3分；有意識障礙且無自發(fā)性活動為4分。

1.2.6大鼠海馬區(qū)細胞凋亡相關蛋白的檢測 應用Western印跡法測定高遷移率族蛋白(HMGB)1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、半胱天冬酶(Caspase)3、B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關的X基因(Bax)表達。RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，配置12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE,恒壓80 V,2 h)，將蛋白質(zhì)分離后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，密封于5%脫脂奶粉中,并在4℃下與一抗孵育過夜。用緩沖液洗膜，作用15 min，重復3次。孵育膜與二抗，于5℃中作用120 min，然后涂上發(fā)光劑，曝光并掃描。采用Image J 軟件進行灰度分析，參照蛋白為β-actin。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行方差齊性比較、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠腦組織HE觀察 如圖1所示，正常組神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞均正常；模型組腦出血組織細胞間隙增加、神經(jīng)細胞固縮及膠質(zhì)細胞數(shù)目增加、體積擴大；低、中、高劑量組腦組織的膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞體積增大，炎性細胞浸潤、細胞體積增大等情況有所緩解；高劑量組較低、中劑量組腦組織排列規(guī)范，膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞體積增大等情況明顯減退。

2.2大鼠海馬區(qū)細胞凋亡情況 正常組細胞低強度熒光呈現(xiàn)均勻，細胞核橢圓形或圓形，邊緣清晰；模型組凋亡細胞顯著增多，表現(xiàn)為亮藍色熒光核濃染致密，呈固縮形態(tài)，部分出現(xiàn)顆粒熒光、核小體破裂；流式細胞儀檢測結(jié)果表明，經(jīng)丁基苯酞干預后凋亡細胞減少，且隨著丁基苯酞的劑量增大，其抑制細胞凋亡的效果增強。見圖2。

圖1 各組腦組織(HE染色，×400)

圖2 各組海馬區(qū)細胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.3各組腦組織HMGB1、VEGF蛋白表達的比較 如圖3、表1所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達升高，VEGF蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達顯著降低，VEGF蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達顯著降低，VEGF蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組腦組織HMGB1蛋白表達降低，VEGF蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4各組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分的比較 如表1所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

1～5:模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、正常組；圖4同圖3 各組HMGB1、VEGF蛋白表達

表1 各組腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分、HMGB1及VEGF蛋白表達比較

2.5各組海馬區(qū)細胞凋亡相關蛋白的比較 如表2、圖4所示，與正常組相比，模型組、低、中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達均顯著降低，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達均顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達均顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達均升高，Bax蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組海馬區(qū)細胞凋亡相關蛋白的比較

圖4 各組Caspase3、Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討 論

腦出血是一種臨床比較常見的神經(jīng)內(nèi)科疾病，在全部腦卒中患者中，腦出血患者占20%～30%〔9〕。有報道稱，腦出血發(fā)生的主要原因與糖尿病、高脂血癥、高血壓、血管老化等密切相關〔10〕。據(jù)相關報道〔11〕，中老年人群和高血壓患者發(fā)生腦出血概率較高，且隨著我國日常生活質(zhì)量及人口老齡化現(xiàn)象的不斷升高，腦出血發(fā)病率、病死率、致殘率呈上升趨勢。腦出血病情嚴重、進展快，常因情緒激動、費力用盡時突然發(fā)病，其發(fā)病后主要臨床表現(xiàn)為頭暈、頭痛及認知、運動、言語障礙等〔12〕。腦出血早期死亡率較高，幸存者中大多數(shù)患者均留有一系列后遺癥，嚴重影響身心健康及生活質(zhì)量〔13〕。

丁基苯酞具有多種藥理作用，其可通過降低花生四烯酸含量，升高腦血管內(nèi)皮一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)的水平，使細胞內(nèi)鈣濃度降低，抑制氧自由基，減少谷氨酸釋放和改善抗氧化活性等機制達到抗腦缺血、減輕腦水腫、抗腦血栓形成和抗血小板聚集等作用〔14,15〕。動物學研究表明〔16〕，采用Longa改良縫線閉塞法建立永久性大腦中動脈鼻塞模型小鼠，觀察到丁基苯酞可升高VEGF表達，使血腦屏障通透性降低，改善腦梗死小鼠神經(jīng)功能缺損及腦水腫。在本文研究中，丁基苯酞可降低腦出血模型大鼠腦組織含水量、學習記憶能力評分、Bederson神經(jīng)功能評分，改善大鼠記憶功能及神經(jīng)功能，減少腦含水量。

HMGB1是目前為止僅有的能夠在細胞外誘導細胞因子活化及分泌炎癥細胞的核內(nèi)蛋白，在修復組織損傷等多種生理病理過程中具有重要作用。研究表明〔17〕，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、γ-干擾素(IFN-γ)等炎性細胞因子可刺激下單核-巨噬細胞釋放HMGB1，HMGB1也可刺激下單核-巨噬細胞分泌TNF-α、IL-10、IL-6等炎癥介質(zhì)，參與調(diào)解遠期的誘導炎癥反應及免疫細胞應答近期的損傷，加重局部水腫和滲出。VEGF是一種促血管生長因子，其通過與VEGF受體(VEGFR)-1、VEGFR-2等結(jié)合激活絡氨酸激酶，增加血管內(nèi)皮細胞通透性，介導內(nèi)皮細胞分化、增殖、形成臨時基質(zhì)等一系列生物效應，達到促進血管生成的作用〔18〕。涂鄂文等〔19〕研究結(jié)果中，腦出血大鼠經(jīng)丁基苯酞干預后VEGF、血管生成素(Ang)-2蛋白表達上調(diào)，且丁基苯酞并未增加大鼠顱內(nèi)出血的風險。本文研究結(jié)果顯示，丁基苯酞可升高腦出血模型大鼠腦組織VEGF蛋白表達，降低HMGB1蛋白表達，減輕神經(jīng)功能缺損，增加大鼠出血周圍新生血管密度。

在臨床檢測細胞凋亡情況的蛋白中，Caspase3、Bcl-2、Bax較為常見，檢測Caspase3、Bcl-2、Bax表達能夠比較準確地評價細胞的凋亡情況〔20〕。在Caspase家族中，Caspase3是誘發(fā)細胞凋亡的關鍵。Bcl-2、Bax屬于線粒體凋亡通路上的重要組成蛋白，吳曉光等〔21〕指出，干預腦出血大鼠可通過調(diào)控Bcl-2、Bax表達，達到抑制腦組織神經(jīng)死亡、起到腦保護的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，丁基苯酞可升高腦出血模型大鼠海馬區(qū)Caspase3、Bcl-2蛋白表達，降低Bax蛋白表達，提示丁基苯酞可能通過調(diào)控Caspase3、Bcl-2、Bax的表達達到抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的作用。

綜上所述，丁基苯酞改善腦出血模型大鼠記憶功能及神經(jīng)功能，減少腦含水量，減輕神經(jīng)功能缺損，增加大鼠血腫部位新生血管密度，通過調(diào)控Caspase3、Bcl-2、Bax的表達達到抑制大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的作用。