不同濃度羅英化濁解毒方對(duì)胃癌大鼠病理改變、細(xì)胞凋亡及RegⅠ蛋白的影響

陳貴婧 張紈 孫建慧 王彩云 張亞麗 沙丹丹 董興娟

(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

胃癌由多種因素導(dǎo)致，最初癌細(xì)胞來源于胃黏膜上皮病變，常見的類型為腺癌。常見的誘發(fā)因素為癌前病變、環(huán)境、飲食等，早期胃癌患者無特異性癥狀，致使疾病的產(chǎn)生綠增加〔1〕。相關(guān)報(bào)道顯示，飲食不規(guī)律所引起的胃癌發(fā)病率逐年增加，確診時(shí)多為晚期，治療困難，因此，對(duì)于胃癌的治療至關(guān)重要。該病常見的治療胃手術(shù)治療，但手術(shù)易產(chǎn)生并發(fā)癥等，不利于患者的預(yù)后。根據(jù)近年來的研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)在治療胃癌方面效果顯著，中醫(yī)認(rèn)為胃癌的病因在于濕濁和熱毒,羅英化濁解毒方是化解濁毒的一味中藥,已有研究表明其對(duì)胃癌前病變患者體內(nèi)的濁毒具有一定的治療作用，但其對(duì)于治療胃癌的相關(guān)文獻(xiàn)較少，作用尚未完全掌握〔2〕。胃癌細(xì)胞的異常增加及向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等可加快胃癌的發(fā)展。RegⅠ是Reg再生基因家族的一員，相關(guān)研究證實(shí)，RegⅠ在胃癌中水平較高,RegⅠ蛋白可作為促生長和抑凋亡因子，目前，已有相關(guān)學(xué)者證實(shí)其可抑制胃癌細(xì)胞的凋亡〔3〕。本研究不同濃度羅英化濁解毒方對(duì)胃癌大鼠病理改變、細(xì)胞凋亡及RegⅠ蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康A(chǔ)CL雄性大鼠80只，2～4月齡，體重210～225 g，平均(213.25±12.37)g，購自億鳴復(fù)興(北京)公司，7 d后開始實(shí)驗(yàn)，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，室溫維持在23.3～27.2℃，相對(duì)濕度在51%～62%，保持0.5 d光照，正常飲食飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 羅英化濁解毒方用水浸泡0.5 h，煎煮3次后取汁(200 ml)，離心，取上清，濃縮至1.5 kg/L，殺菌備用。詳細(xì)藥材及劑量：莪術(shù)4 g，茵陳6 g，郁金9 g，砂仁10 g，冬凌草、石菖蒲、元胡、葉下珠、羅勒、紅景天各12 g，白英、蒲公英、藤梨根、八月札、隔山消各15 g。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 胃癌SGC-7901細(xì)胞株(上海和元公司)、羅英化濁解毒方中中草藥材(亳州恒義公司)、阿糖胞苷(北京華邁科公司)、戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆公司)、TUNEL(邢臺(tái)潤聯(lián)公司)、酶標(biāo)儀(山東恒美公司)、RegⅠ、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)一抗(廣州瑞博奧公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(河北翰林公司)。

1.4模型建立 取64只大鼠于腹部注射阿糖胞苷(200 mg/kg)，2 d后全身照射 60℃至吸收10 Gy。照射后2 d，胰酶消化胃癌細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸(1×1010/L)，將細(xì)胞懸液(0.8 ml)注射大鼠右腋皮下位置。1 w后，腋下長出1 cm腫塊，建模成功64只。

1.5分組及給藥 剩余16只大鼠為正常組，無處理。建立模型的64只大鼠分為模型組16只無任何處理，低劑量組16只給予20 mg/kg羅英化濁解毒煎劑灌胃，1次/d，高劑量組16只給予40 mg/kg羅英化濁解毒煎劑灌胃1次/d，對(duì)照組(藥物對(duì)照組)給予225 mg/kg希羅達(dá)灌胃，2次/d，共12 w。

1.6檢測指標(biāo)

1.6.1蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡觀察法檢測各組大鼠胃黏膜組織形態(tài) 取各組大鼠，戊巴比妥鈉麻醉后處死，取胃黏膜組織，置于4%甲醛緩沖液中固定，石蠟切片，脫蠟，乙醇水合處理，洗滌后進(jìn)行染色，光鏡下觀察。

1.6.2TUNEL檢測各組大鼠胃黏膜組織中細(xì)胞凋亡 取大鼠胃黏膜組織，滴加蛋白酶 K工作液常溫反應(yīng) 20 min，PBS 清洗，加入50 μl TUNEL工作液，常溫?zé)o光孵育60 min，清洗，加 50 μl convertr-POD，上述條件孵育。PBS洗滌，4次，5 min/次，加圖 DAB液顯色10 min后，沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡率。

1.6.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平 取各組大鼠頸部動(dòng)脈血2 ml，離心5 min，1 250 r/min，取上清，采用ELISA檢測各組大鼠血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平。

1.6.4RT-PCR檢測胃黏膜組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、自噬蛋白(Beclin1)水平 取各組大鼠胃黏膜組織，裂解液裂解，0.25%胰蛋白酶消化，提高組織RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，分離后采用Trizol法提取總RNA，無核酸酶溶解。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后將cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參為β-actin，反應(yīng)條件：5 min 94℃,變性30 s 94℃；55 s 64℃；50 s 72℃。共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析。引物序列：VEGF：上游引物：5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′；下游：5′-TCACGCCACAGTTTCCCG-3′；Beclin1上游引物：5′-AATGAATGAGGGCGACAG-3′，下游：5′-TCAGGGACTCCAGATACGA-3′；β-actin上游引物：5′-ACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游5′-CAGGATTCCATACCCAAG-3′。

1.6.5Western印跡檢測胃黏膜組織中RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取各組大鼠胃黏膜組織，600 μl裂解液裂解并提取蛋白,測量蛋白濃度,分裝,-20℃保存。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液按4∶1比例混均,將蛋白溶液煮沸，變性。將電泳后的50 μm蛋白樣品轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入1抗(1∶500)RegⅠ、Bcl-2、Bax后，清洗3次，間隔10 min/次,最后加入辣根過氧化物酶2抗對(duì)溶液稀釋,封閉1 h。取出PVDF膜,漂洗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后照相。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1各組胃黏膜組織形態(tài)檢測結(jié)果 與正常組相比，模型組與低劑量組胃黏膜組織有炎性細(xì)胞浸潤產(chǎn)生，排列雜亂無章、胃壁增厚，高劑量組與對(duì)照組胃黏膜組織炎性細(xì)胞浸潤減少，排列較為有序。見圖1。

圖1 各組胃黏膜病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.2各組胃癌細(xì)胞凋亡情況檢測結(jié)果 模型組胃癌細(xì)胞凋亡率〔(4.11±0.42)%〕明顯高于正常組〔(0.00±0.00)%；t=23.97，P<0.001〕。模型組明顯低于低劑量組〔(26.31±2.13)%；t=25.05，P<0.001〕。低劑量組明顯低于高劑量組〔(47.31±4.31)%；t=10.70，P<0.001〕。高劑量組明顯高于對(duì)照組〔(34.32±3.11)%；t=5.99，P<0.001〕。見圖2。

2.3各組血清中胃動(dòng)素、胃泌素水平檢測結(jié)果 正常組胃動(dòng)素、胃泌素水平明顯低于模型組(P<0.05)，模型組上述指標(biāo)水平明顯高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組上述指標(biāo)水平明顯高于高劑量組(P<0.05)，高劑量組上述指標(biāo)水平與對(duì)照組無差異(P<0.05)，見表1。

2.4各組VEGF、Beclin1 mRNA水平檢測結(jié)果 與正常組相比，模型組VEGF mRNA水平明顯提升、Beclin1 mRNA水平明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組VEGF mRNA表達(dá)明顯降低、Beclin1 mRNA表達(dá)明顯提升(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組與對(duì)照組VEGF mRNA表達(dá)明顯降低、Beclin1 mRNA表達(dá)明顯提升(P<0.05)。高劑量組與對(duì)照組VEGF mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.5各組RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平檢測結(jié)果 與正常組相比，模型組RegⅠ、Bcl-2水平明顯升高，Bax水平明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組RegⅠ、Bcl-2水平明顯下降，Bax水平明顯提升(P<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組與對(duì)照組RegⅠ、Bcl-2水平明顯下降，Bax水平明顯提升(P<0.05)。與高劑量組相比，對(duì)照組RegⅠ、Bcl-2水平明顯升高，Bax水平明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

圖2 各組胃癌細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×200)

表1 各組胃動(dòng)素、胃泌素水平、VEGF、Beclin1 mRNA水平、RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白水平對(duì)比

圖3 各組RegⅠ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3 討 論

胃癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)位居第5，死亡率居于第3〔4〕。在我國，該病的發(fā)病率和死亡率分別位于第2、3位，高于世界平均水平。

胃腸激素可調(diào)節(jié)胃腸功能，胃動(dòng)素與胃泌素是其中兩種，胃動(dòng)素主要定位于小腸，具有促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)的作用，胃泌素是一種肽類物質(zhì)，可刺進(jìn)胃腸功能的運(yùn)動(dòng)及分泌，可調(diào)節(jié)機(jī)體的消化道并維持其功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)〔5〕。中醫(yī)認(rèn)為胃癌基本病機(jī)是濕濁和熱毒，羅英化濁解毒方中白英具有清熱解毒、消腫利濕、抗癌的功效；砂仁具有健脾化濕、溫脾止瀉的作用。本研究顯示胃泌素與胃動(dòng)素水平較健康大鼠高，在經(jīng)過藥物干預(yù)后水平有所降低且呈現(xiàn)劑量依賴性，目前研究表明希羅達(dá)治療胃癌效果較高，因此，本文選用希羅達(dá)作為藥物對(duì)照組，羅英化濁解毒方水平對(duì)胃癌具有一定的治療作用。在黎玉容等〔6〕對(duì)胃癌大鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中提出，胃動(dòng)素與胃泌素水平在胃癌大鼠中為高表達(dá)，降低其水平后，大鼠的胃腸功能得到一定的改善。砂仁是羅英化濁解毒方中的一味中藥材，在陶彥谷等〔7〕對(duì)胃潰瘍的實(shí)驗(yàn)研究中提出，砂仁具有降低胃泌素及胃動(dòng)素水平的作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，且本文HE染色結(jié)果也表明在經(jīng)過藥物干預(yù)后胃癌大鼠胃黏膜組織形態(tài)有所改善。

新血管的形成是腫瘤發(fā)展的基礎(chǔ)，VEGF具有促進(jìn)血管新生的作用，是血管形成的關(guān)鍵因子，新生雪管的增加促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，加重病情〔8〕。羅英化濁解毒方中冬凌草具有清熱解毒、活血止痛、抗腫瘤等作用；郁金具有活血止痛、行氣解郁等作用；石菖蒲理氣活血祛濕的作用。肖麟等〔9〕對(duì)胃癌大鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提出，高水平的VEGF會(huì)增加腫瘤血管新生，促進(jìn)胃癌發(fā)展，經(jīng)過藥物干預(yù)后，其水平降低，病情有所改善。石菖蒲與郁金是羅英化濁解毒方中的兩味中藥材，田軍彪等〔10〕在實(shí)驗(yàn)中提出石菖蒲、郁金可降低VEGF水平，改對(duì)腦缺血再灌注大鼠的病情嚴(yán)重程度。本文與上述研究結(jié)果相似。

Reg再生基因家族具有促有絲分裂、抗凋亡、抗炎癥等作用。已有研究證實(shí)其在結(jié)腸癌〔11〕、胃癌〔12〕等消化道腫瘤中均為高表達(dá)。RegⅠ是再生基因家族的成員之一，主要參與組織損傷與腫瘤的產(chǎn)生，相關(guān)研究表明〔13〕，RegⅠ表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤性生長及預(yù)后具有一定的相關(guān)性。RegⅠ在胃癌中具有抗凋亡的作用。Beclin1是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因，對(duì)自噬具有正性調(diào)節(jié)作用，自噬誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展〔14〕。已有學(xué)者證實(shí)〔15〕Bcl-2、Bax與細(xì)胞凋亡聯(lián)系密切，Bcl-2是抗凋亡因子之一，低表達(dá)的Bcl-2 可提高Bax 水平加快細(xì)胞凋亡。羅英化濁解毒方中藤梨根具有抗腫的功效；冬凌草與莪術(shù)具有清熱解毒、活血止痛、行氣破血、抗腫瘤的功效。徐平平等〔16〕對(duì)胃癌大鼠的實(shí)驗(yàn)提出，通過提高胃動(dòng)素與胃泌素的水平，改善了大鼠的胃功能，通過降低Bcl-2、提高水平加快癌細(xì)胞凋亡。朱飛葉等〔17〕對(duì)胃癌大鼠的實(shí)驗(yàn)提出，與健康大鼠相比，胃癌大鼠Beclin1水平較低，在經(jīng)過藥物干預(yù)后水平有所升高。張蕾等〔18〕在對(duì)胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中提出，通過降低Bcl-2、提高Beclin1、BAX水平可促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。冬凌草與藤梨根是羅英化濁解毒方中的兩味中草藥，程珊等〔19〕對(duì)胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)提出，高表達(dá)的RegⅠ促進(jìn)癌細(xì)胞的生長，通過降低RegⅠ、提高胃泌素水平可減少癌細(xì)胞增殖。王志坤等〔20〕對(duì)胃癌前病變大鼠的研究提出，冬凌草與藤梨根通過降低RegⅠ、PCNA水平抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相似，羅英化濁解毒方通過降低RegⅠ水平抑制了Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了Bax、Beclin1表達(dá)，降低了胃動(dòng)素與胃泌素水平，從而增加胃癌細(xì)胞的凋亡，改善腸胃功能。且本文TUNEL檢測癌細(xì)胞凋亡的結(jié)果也可證實(shí)在經(jīng)過羅英化濁解毒方治療后癌細(xì)胞凋亡增加，且具有劑量依賴性。

綜上所述，羅英化濁解毒方通過降低RegⅠ水平，改善了胃癌大鼠病理組織形態(tài)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，且呈現(xiàn)明顯的藥物劑量依賴性。