舒洛地特對糖尿病足潰瘍大鼠HIF-1α/GPER/VEGF通路及創(chuàng)面愈合的影響

韋積華 羅富強 謝康麒 李載永 余電柏 麻華德 丁科 羅群強

(右江民族醫(yī)學院 1附屬醫(yī)院手足外科，廣西 百色 533000；2臨床醫(yī)學院)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，近年來發(fā)病人數(shù)急劇增加，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟調(diào)查顯示，全球20～79歲成人群體中糖尿病患者高達4.630億例，預計2045年可能增長至7.002億例，其中，我國糖尿病患者例數(shù)居全球首位〔1〕。糖尿病患者體內(nèi)長期的高糖環(huán)境會引發(fā)大量并發(fā)癥，糖尿病足潰瘍(DFU)是其嚴重并發(fā)癥之一〔2〕。研究表明，糖尿病患者長期高血糖會出現(xiàn)不同程度的微血管病變，約15%會引起下肢肢體潰瘍，且潰瘍難以愈合，15%～20%的DFU患者會發(fā)展至截肢，嚴重影響患者生活質(zhì)量〔3，4〕。G蛋白耦聯(lián)雌激素受體(GPER)是近年來發(fā)現(xiàn)的膜雌激素受體，可調(diào)節(jié)多個信號轉導通路，在腫瘤中可調(diào)控低氧誘導因子(HIF)-1α/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通路，誘導微血管環(huán)境形成〔5，6〕。有研究發(fā)現(xiàn)，定向激活HIF-1對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復具有促進作用，可能與調(diào)控VEGF水平升高有關〔7〕。舒洛地特屬于葡糖胺聚糖，主要由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮膚素組成，具有抗感染、降血脂、抗心血管疾病等作用，在糖尿病腎病中能保護并重建損傷的血管內(nèi)皮〔8，9〕。本研究建立DFU大鼠模型，探討舒洛地特對HIF-1α/GPER/VEGF通路及創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑和儀器 雄性SD大鼠，體重200～250 g，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0010。主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)、RIPA裂解液(貨號：S27190-1g、AR0010-100 ml)購自上海吉至生化科技有限公司；舒洛地特(批準文號：H20140120)購自ALFA WASSERMANN S.p.A.，大鼠白細胞介素(IL)-6、IL-8酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：ZN2880-GPK、ARB12173)購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(貨號：ER1393)購自武漢菲恩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號：DH0006)購自北京雷根生物技術有限公司；HIF-1α抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(貨號：ab179483、ab186930、ab6721)購自Abcam公司；GPER抗體(貨號：NLS4271)購自Novus Biologicals；VEGF抗體(貨號：19003-1-AP)購自Proteintech。主要儀器:離心機(型號：5427R)購自德國Eppendorf公司；酶標儀(型號：SynergyH1)購自美國BioTek公司；顯微鏡(型號：CKX41SF)購自日本Olympus公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號：Alpha View)購自美國Protein Simple公司。

1.2動物分組及造?！?0〕大鼠適應性喂養(yǎng)1 w，隨機選取8只作為對照組，其余大鼠建立DFU模型。建模大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)。4 w后，建模大鼠按30 mg/kg給予1% STZ溶液(用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制)腹腔注射1次，對照組大鼠給予等體積0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔注射1次。3 d后，測量空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。此后，建模大鼠改用普通飼料喂養(yǎng)。造模成功的大鼠及對照組大鼠給予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，制備潰瘍創(chuàng)面：在大鼠雙后足背部，用磁鐵壓出3 mm×7 mm的矩形全層皮膚缺損，達到實驗動物創(chuàng)面潰瘍的慢性損傷程度即為DFU造模成功。模型大鼠隨機分為模型組和舒洛地特低、中、高劑量組，每組8只。

1.3動物給藥 造模結束當天分別對舒洛地特低、中、高劑量組大鼠給予5、10、20 mg/kg舒洛地特〔11〕腹腔注射，對照組、模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥14 d。給藥0、3、7、14 d時，檢測大鼠隨機血糖。

1.4大鼠創(chuàng)面愈合情況 分別于給藥7、14 d對大鼠足背創(chuàng)面拍照，采用Image軟件計算其面積，計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-當前測量面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.5ELISA檢測血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達 給藥結束后，各組大鼠采集尾靜脈血，3 000 r/min離心分離上清液。按照IL-6、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測吸光度(OD)值。配制IL-6、IL-8和TNF-α標準溶液，使用酶標儀檢測OD值，繪制標準曲線。根據(jù)血清樣品OD值與標準曲線方程計算血清IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.6HE染色觀察創(chuàng)面組織病理變化 各組大鼠剪取創(chuàng)面部位及周圍3 mm的組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸去水分，分為兩份，一份置于-80℃低溫保存；另一份用10%甲醛溶液固定，用石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡觀察創(chuàng)面組織病理變化。

1.7Western印跡法檢測創(chuàng)傷組織HIF-1α/GPER/VEGF通路相關蛋白表達 將-80℃低溫保存的創(chuàng)面組織于冰上解凍，剪碎，加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上研磨、勻漿，12 000 r/ min離心15 min，分離上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度，取樣品與上樣緩沖液混合，沸水煮沸5 min使蛋白變性，向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣孔加高溫變性的蛋白樣本，電泳、濕轉，5%脫脂奶粉封閉2 h，將帶有目的蛋白條帶的膜放在相應一抗(HIF-1α抗體、GPER抗體、VEGF抗體、GAPDH抗體，均1∶1 000稀釋)稀釋液中4℃孵育過夜，洗膜，放在二抗(HRP標記的羊抗兔lgG，1∶2 000稀釋)稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1給藥過程中各組血糖水平變化 給藥0、3、7、14 d，與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組血糖水平均顯著升高(P<0.05)；給藥3、7、14 d，與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組血糖水平均顯著降低(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，血糖水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.2給藥過程中各組大鼠創(chuàng)面愈合情況 給藥7、14 d，與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，大鼠創(chuàng)面愈合率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達變化 與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平均顯著降低(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組創(chuàng)面組織病理變化 對照組創(chuàng)面組織中存在少量炎癥細胞及大量膠原纖維、肉芽組織及新生毛細血管；模型組創(chuàng)面組織中有大量炎癥細胞浸潤，可見少量膠原纖維沉積及肉芽組織、新生毛細血管生長；隨著舒洛地特的使用及劑量的升高，創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤程度逐漸減輕，膠原纖維沉積及肉芽組織、新生毛細血管數(shù)量逐漸增多。見圖1。

表1 各組血糖水平及創(chuàng)面愈合率比較

表2 各組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平及創(chuàng)面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平比較

圖1 各組創(chuàng)面組織病理變化(HE染色，×200)

2.5各組創(chuàng)面組織中HIF-1α/GPER/VEGF通路相關蛋白表達 與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組創(chuàng)面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組創(chuàng)面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

1～5:對照組、模型組、舒洛地特低劑量組、舒洛地特中劑量組、舒洛地特高劑量組圖2 各組創(chuàng)面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達

3 討 論

潰瘍創(chuàng)面愈合是多種因素共同作用的結果，組織受損愈合時伴有肉芽組織形成，而新生血管是肉芽組織的重要組成部分，通過提供血氧供應在創(chuàng)面愈合過程發(fā)揮作用，血管生成數(shù)量及生成速度均對創(chuàng)面愈合有影響〔12〕。但血管內(nèi)皮細胞損傷及功能異常是糖尿病并發(fā)血管病變的早期改變之一，會導致血液流通變緩，當糖尿病大鼠出現(xiàn)創(chuàng)傷后，血管內(nèi)皮細胞增殖積極，但無法有效形成功能毛細血管，影響創(chuàng)面血氧供應，導致創(chuàng)面愈合困難〔13，14〕。本研究結果提示，DFU大鼠模型建立成功，DFU大鼠創(chuàng)傷更難愈合，炎癥反應更加嚴重，且難以生成新生毛細血管。

舒洛地特是臨床上的一種新型葡糖胺聚糖制劑，既往報道其具有抑制炎癥反應及保護血管內(nèi)皮細胞的作用〔15，16〕。本研究結果提示，舒洛地特能降低大鼠血糖水平，降低炎癥反應，促進創(chuàng)面組織中新生毛細血管生成，能幫助DFU大鼠創(chuàng)面愈合，但涉及的相關作用機制還需進一步探究。

HIF-1α、VEGF均為重要的血管生成生長因子，有助于積極改善糖尿病創(chuàng)面的新生血管形成及愈合效果〔17〕。糖尿病狀態(tài)對HIF-1α的轉錄、翻譯具有抑制作用，糖尿病創(chuàng)面組織由于相對缺氧，其愈合過程伴隨HIF-1α表達的增加，同時HIF-1α表達因高血糖環(huán)境而受到抑制，導致糖尿病創(chuàng)面愈合較非糖尿病緩慢〔18〕。本研究結果提示，DFU大鼠體內(nèi)高血糖環(huán)境抑制了發(fā)生創(chuàng)傷后的HIF-1α蛋白表達。VEGF是特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的細胞因子，能誘導新生血管形成，同時是HIF-1α的下游基因，可被HIF-1α誘導表達〔19〕。本研究亦發(fā)現(xiàn)，DFU大鼠體內(nèi)高血糖環(huán)境會抑制創(chuàng)面組織中VEGF蛋白表達，導致新生毛細血管生成減少。GPER是近年來發(fā)現(xiàn)的雌激素受體，在缺血性腦卒中中，其能通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用，在腫瘤中也可調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF通路誘導形成腫瘤微血管環(huán)境〔5，20〕。本研究結果提示，DFU大鼠體內(nèi)高血糖環(huán)境會抑制HIF-1α/GPER/VEGF通路，最終影響創(chuàng)面組織新生毛細血管生成，導致創(chuàng)面愈合變慢。而隨著舒洛地特的使用及劑量的升高，舒洛地特可呈劑量依賴性降低血糖水平，減輕高血糖環(huán)境對HIF-1α/GPER/VEGF通路的抑制，恢復創(chuàng)面組織新生毛細血管生成。

綜上，舒洛地特可降低DFU大鼠血糖水平，同時抑制炎癥反應并激活HIF-1α/GPER/VEGF通路，促進創(chuàng)面組織新生毛細血管生成及創(chuàng)面愈合。