AKT2 rs3730051、AKT2 rs969531基因多態(tài)性與廣西地區(qū)人群ANCA相關(guān)性血管炎的關(guān)聯(lián)性

李柔 薛超 黎偉 饒金蘭

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 南寧 530007)

原發(fā)性抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)性血管炎(AAV)是一組以小血管壞死性炎性損傷和纖維素樣壞死為特征的自身免疫性疾病，可致腎臟、肺臟等全身多器官損害，現(xiàn)已成為較常見(jiàn)的自身免疫性疾病之一，疾病病情復(fù)雜多變，發(fā)病高峰在65～74歲，有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)約50%患者在治療緩解后的5年內(nèi)仍復(fù)發(fā)〔1〕。AAV發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前已證實(shí)遺傳因素參與ANCA相關(guān)性血管炎的發(fā)病過(guò)程中〔2〕，同時(shí)環(huán)境、藥物、感染等可能是重要誘因共同導(dǎo)致AAV的發(fā)生。AKT又稱(chēng)作蛋白激酶B，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， AKT參與多條細(xì)胞信號(hào)通路，其中最重要作為磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的核心下游分子在機(jī)體中發(fā)揮作用。PI3K-AKT信號(hào)通路廣泛存在細(xì)胞中，PI3K活化后催化AKT磷酸化，引起信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化糖原合成酶激酶(GSK)-3、叉頭框蛋白(Fox)Os、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bad)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)9、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mTOR)及P21 等多種蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及糖代謝調(diào)節(jié)等多種活動(dòng)〔3〕。目前已有研究表示PI3K-AKT信號(hào)通路與腫瘤、自身免疫性疾病、腎臟相關(guān)疾病發(fā)生和病理進(jìn)展密切相關(guān)〔4，5〕。筆者推測(cè)PI3K-AKT信號(hào)通路可能參與AAV發(fā)病及疾病發(fā)展過(guò)程中，AKT是PI3K下游的關(guān)鍵蛋白，其中AKT2作為同工酶之一，在腫瘤和糖尿病中發(fā)揮重要作用〔6,7〕。目前AKT2在ANCA相關(guān)性血管炎中遺傳學(xué)意義尚不明確，本研究旨在探討AKT2 rs3730051、rs969531基因多態(tài)性與廣西地區(qū)人群ANCA相關(guān)性血管炎的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2005年1月至2018年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院及門(mén)診確診為AAV的215例患者為AAV組，其中男82例，女133例，平均年齡(54.44±14.9)歲。對(duì)照組收集同期于體檢中心體檢的性別、年齡相仿的健康人群201例，其中男79例，女122例，平均年齡(52.21±11.87)歲。兩組平均年齡(t=1.691)及性別構(gòu)成(χ2=0.059)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究對(duì)象籍貫均為廣西，本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及全體納入對(duì)象的知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：參照2018年增編的2012年Chapel Hill國(guó)際血管炎命名會(huì)議的標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除繼發(fā)性小血管炎及合并多器官功能障礙、腫瘤、其他自身免疫性疾病、妊娠的患者。

1.2資料收集 收集納入患者的一般資料、臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料。一般資料包括：年齡、性別。臨床資料包括：血尿、發(fā)熱、咳嗽、水腫、皮疹、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛、咯血、體重下降(≥5 kg/30 d)等癥狀。實(shí)驗(yàn)室資料包括：血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、血脂四項(xiàng)、尿蛋白定量及定性、空腹血糖、自身抗體、ANCA抗體、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血沉、抗鏈球菌溶血素(ASO)、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、補(bǔ)體、胸片、腎臟穿刺病理結(jié)果。

1.3外周血收集和基因組DNA提取 使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集所有研究對(duì)象外周靜脈血2 ml，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟提取外周血基因組DNA。

1.4基因分型 采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增結(jié)合高通量測(cè)序方法，由生工生物工程(上海)有限公司完成基因分型。具體步驟：設(shè)計(jì)并合成好一個(gè)包含本研究中AKT2 rs3730051、rs969531位點(diǎn)的引物池，然后通過(guò)兩步PCR的方法完成目標(biāo)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)序列的擴(kuò)增和兼容Illumina測(cè)序文庫(kù)的制備。第一輪PCR體系如下：DNA 模板(10 ng/μl) 2 μl;上游引物池(10 μmol/L)1 μl;下游引物池(10 μmol/L) 1 μl;2×PCR Ready Mix 15 μl(總體積 25 μl)(Kapa HiFi Ready Mix)。配制好反應(yīng)體系后，在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)上執(zhí)行以下反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性3 min，然后執(zhí)行8個(gè)循環(huán)，條件是98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s。緊接著執(zhí)行25個(gè)循環(huán)，條件是98℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。最后72℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。PCR完成后，使用1%的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確定產(chǎn)物大小正確，使用AMPure XP磁珠純化回收PCR產(chǎn)物。然后以第一輪PCR產(chǎn)物為模板執(zhí)行第二輪PCR反應(yīng)，以獲得測(cè)序帶分子標(biāo)簽的文庫(kù)。反應(yīng)體系如下：DNA模板(10 ng/μl) 2 μl，通用P7引物(含分子標(biāo)簽，10 μmol/L)1 μl;通用P5引物(10 μmol/L) 1 μl;2× PCR Ready Mix 15 μl(總體積30 μl)。配制好反應(yīng)體系后，執(zhí)行如下PCR程序：98℃預(yù)變性5 min，然后執(zhí)行5個(gè)循環(huán)程序，變性94℃ 30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，最終72℃延伸5 min。完成后4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。最終PCR產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠純化回收。各個(gè)PCR產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen測(cè)序儀(Illumina,San Diego,CA)進(jìn)行測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件和SHEsis在線(xiàn)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析、χ2檢驗(yàn)和Logistic回歸分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，采用秩和檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)以P>0.05表示群體具有代表性。

2 結(jié) 果

2.1各SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分析 兩組樣本在rs3730051、rs969531位點(diǎn)上基因型、等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明研究對(duì)象具有群體代表性。AAV組與對(duì)照組AKT2 rs3730051、rs969531基因型及等位基因分布頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2AAV組各基因型間臨床癥狀比較 在AAV組215例患者中采集到185例患者的臨床癥狀，根據(jù)體重下降、發(fā)熱、咳嗽、水腫、關(guān)節(jié)痛癥狀發(fā)生頻率，分別在各個(gè)位點(diǎn)的基因型間進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)rs3730051位點(diǎn)基因型頻率在AAV患者中伴體重下降和不伴體重下降亞組中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在AAV組中，以rs3730051位點(diǎn)基因型為自變量，是否出現(xiàn)體重下降癥狀為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，以CC+TC基因型為參照(OR=1)，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型出現(xiàn)體重下降癥狀的風(fēng)險(xiǎn)是CC+TC基因型的3.043倍(OR=3.043，OR95%CI=1.43～6.45；P=0.003)。見(jiàn)表2、表3。

表1 AKT2 rs3730051、rs969531基因型和等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

表2 AAV組rs3730051、rs969531位點(diǎn)各基因型在臨床癥狀亞組的對(duì)比〔n(%)〕

2.3AAV組各基因型實(shí)驗(yàn)室檢查比較 對(duì)AAV組中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、三酰甘油、膽固醇、空腹血糖實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分別在各個(gè)位點(diǎn)的基因型間進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)rs3730051位點(diǎn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)在AAV患者各基因型中分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 AAV組rs3730051、rs969531各基因型實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的對(duì)比〔M(P25，P75),n=215〕

3 討 論

AAV以多臟器受累為常見(jiàn)表現(xiàn)，自然病程死亡率高，預(yù)后差，影響預(yù)后的關(guān)鍵因素為早期診斷、早期及合理使用糖皮質(zhì)激素和(或)免疫抑制劑治療。為提高AAV的診斷水平和治療效果，需盡快闡明其發(fā)病機(jī)制，爭(zhēng)取在病因水平上進(jìn)行預(yù)防及治療。其中遺傳因素在AAV的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，AKT2位于人類(lèi)染色體的19q13.2，為AKT的一種重要亞型， AKT2影響細(xì)胞增殖，在早期囊胚增殖和胚胎發(fā)育中必不可少〔8〕。AKT2持續(xù)活化與腫瘤密切相關(guān)， AKT2在肺癌〔9〕、肝細(xì)胞癌〔10〕、結(jié)腸癌〔11〕、卵巢癌〔12〕、乳腺癌〔13〕等多種腫瘤組織有過(guò)度表達(dá)或活化，并與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。在免疫系統(tǒng)中，AKT2參與體液反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)CD19磷酸化，促進(jìn)B細(xì)胞受體(BCR)信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白重塑，增強(qiáng)B細(xì)胞的活化〔14〕。目前B細(xì)胞抑制劑利妥昔單抗對(duì)AAV治療療效逐漸證實(shí)， AKT2可能通過(guò)影響B(tài)細(xì)胞活化參與AAV發(fā)病機(jī)制。AKT2可影響輔助性T細(xì)胞(Th)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTreg)的分化及功能，AKT2可以促進(jìn)Th-17亞群的分化及影響外周CD4 T細(xì)胞的功能〔15〕。Qiao等〔16〕發(fā)現(xiàn)AKT2通過(guò)Foxo1/Foxo3a依賴(lài)的方式參與抑制iTreg的生成。Ouyang等〔17〕發(fā)現(xiàn)敲除AKT2小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的自身免疫性腦脊髓炎，這與tTreg增殖缺陷和Th1/Th17反應(yīng)升高有關(guān)。Th17/Treg失衡在AAV發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。Abdulahad等〔18〕發(fā)現(xiàn)在AAV患者外周血中Th-17和白細(xì)胞介素(IL)-17A水平升高，并普遍存在以Th-17為主的Th細(xì)胞的異常分化，從而導(dǎo)致靶器官的損害〔19〕。在AAV患者活動(dòng)期中檢測(cè)到Treg細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損〔20〕，疾病進(jìn)展可能與CD4 T細(xì)胞數(shù)量的增加相關(guān)。根據(jù)上述分析，AKT2可能參與通過(guò)T細(xì)胞免疫影響AAV發(fā)病及疾病進(jìn)展。目前AKT2與AAV疾病的關(guān)聯(lián)性尚缺乏研究，因此推測(cè)AKT2 rs3730051、rs969531基因多態(tài)性是否與AAV的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究結(jié)果提示，所選擇的AKT2 rs3730051、rs969531位點(diǎn)可能與廣西人群AAV的遺傳易感性無(wú)關(guān)。目前關(guān)于該兩位點(diǎn)研究尚少，僅有單項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)AKT2 rs3730051與多囊卵巢綜合征發(fā)病相關(guān)〔21〕，一項(xiàng)國(guó)內(nèi)小樣本研究發(fā)現(xiàn)AKT2 rs3730051突變能增加冠心病的發(fā)病率〔22〕。PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)免疫細(xì)胞的募集及活化的調(diào)控具有重要作用，已有研究提示在多種炎癥疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化癥等疾病病程中發(fā)揮著重要作用〔4〕，但該通路的基因多態(tài)性與自身免疫性疾病關(guān)聯(lián)性研究甚少，需進(jìn)一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，AKT2 rs3730051位點(diǎn)攜帶TT基因型發(fā)生體重下降的風(fēng)險(xiǎn)較TC+CC基因型高。AKT2是維持正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)的重要基因，AKT2通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)及GSK等多種底物影響糖代謝。AKT2對(duì)胰島素抵抗和糖尿病發(fā)病起重要作用，研究證實(shí)缺乏AKT2基因的小鼠對(duì)胰島素有抵抗，同時(shí)胰島素抑制葡萄糖產(chǎn)生的能力被完全清除〔23〕。在嚴(yán)重胰島素抵抗的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有AKT2基因的突變〔24〕。在脂質(zhì)代謝中，PI3K/AKT通路通過(guò)抑制 Foxo1 的磷酸化而解除對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ的活性抑制，從而促進(jìn)成脂過(guò)程〔25〕。其中有研究表示干擾AKT2較干擾AKT1明顯抑制成脂分化過(guò)程，提示可能為AKT2參與上述過(guò)程〔26〕。筆者推測(cè)AKT2 rs3730051位點(diǎn)可能影響AKT的下游底物進(jìn)而影響糖代謝、脂質(zhì)代謝通路，造成機(jī)體代謝紊亂導(dǎo)致體重下降發(fā)生，但在本研究中對(duì)病例組中兩位點(diǎn)的各基因型總膽固醇、三酰甘油、血糖指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比未見(jiàn)明顯差異，考慮可能與營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)程度不同，故該影響機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室資料分析顯示，在AAV組rs3730051位點(diǎn)各基因型攜帶TT基因型的白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高。AKT2可調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化影響炎癥反應(yīng)，Wu等〔27〕發(fā)現(xiàn)在牙周炎患者中過(guò)表達(dá)AKT2可以誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化，降低M2極化，還可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，進(jìn)而增加促炎介質(zhì)的釋放。小血管的炎性損傷是AAV的基本特征，筆者推測(cè)在rs3730051位點(diǎn)攜帶TT基因型時(shí)AKT2基因活性較高和功能較活躍，促進(jìn)白細(xì)胞升高并影響巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但該亞組白細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值在正常范圍內(nèi)，該結(jié)果需辨證看待。

綜上，AKT2 rs3730051、rs969531基因多態(tài)性與廣西人群AAV遺傳易感性無(wú)關(guān)，AKT2 rs3730051基因多態(tài)性與AAV患者體重下降相關(guān)，AKT2 rs3730051基因多態(tài)性影響AAV患者的白細(xì)胞水平。但由于本研究樣本量較小和地域局限，目前對(duì)AKT2基因多態(tài)性研究尚少，上述結(jié)論需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及進(jìn)行多區(qū)域、多位點(diǎn)研究。