HS-SPME-GC法測(cè)定釀造果酒中甲醇和雜醇的含量

仲 惟，李 濤

（1.三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品園林學(xué)院，河南 三門(mén)峽 472000；2.河南科技大學(xué) 應(yīng)用工程學(xué)院，河南 三門(mén)峽 472000）

果酒一般是指以水果為原料經(jīng)發(fā)酵及一系列工藝處理得到的低酒精度飲料酒，由于原料或生產(chǎn)環(huán)節(jié)的影響，果酒釀制過(guò)程中不可避免有甲醇、雜醇的產(chǎn)生[1-2]。甲醇的攝入過(guò)量會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅，GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定白葡萄酒中甲醇含量不得高于250 mg/L，白紅葡萄酒中甲醇含量不得高于400 mg/L，但目前我國(guó)對(duì)其他水果釀造的發(fā)酵酒中甲醇含量尚無(wú)明確規(guī)定，主要參考葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。雜醇是具有三個(gè)及以上碳原子的一元醇類脂肪醇混合物的俗稱，果酒中的雜醇主要是丙醇、丁醇、異丁醇、戊醇、異戊醇等[6-8]。適量的雜醇可以襯托酯香，增強(qiáng)果酒的風(fēng)味，但過(guò)量則不僅導(dǎo)致果酒產(chǎn)生異雜味，而且對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)有毒害作用，是導(dǎo)致“上頭”的主要因素之一[9-10]，因此果酒中甲醇及雜醇的含量是評(píng)價(jià)果酒品質(zhì)的重要考量因素。

目前測(cè)定果酒中甲醇及雜醇的方法有分光光度法[11-13]、氣相色譜法[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）法[15-16]等。分光光度法雖然可以測(cè)定果酒中各類醇的含量，但是操作步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、目標(biāo)組分選擇性不強(qiáng)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于質(zhì)譜儀設(shè)備昂貴，測(cè)樣成本高，限制了方法的普及性。本實(shí)驗(yàn)擬采用氣相色譜儀，并通過(guò)頂空固相微萃取的條件優(yōu)化，嘗試建立一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography，HS-SPME-GC）的方法，來(lái)檢測(cè)果酒中的甲醇、雜醇，并為其方法的可推廣性進(jìn)行驗(yàn)證。旨在為釀造果酒過(guò)程中對(duì)甲醇及雜醇含量及時(shí)監(jiān)測(cè)和調(diào)控，對(duì)提升果酒的品質(zhì)和安全性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（99.9%）、正丙醇（99.9%）、異丙醇（99.9%）、異丁醇（99.9%）、正丁醇（99.9%）、異戊醇（99.9%）、活性戊醇（99.8%）、正戊醇（99.9%）標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)純化水；釀酒原料：市售。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

6820型氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測(cè)器）：美國(guó)Agilent公司；XS204電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；TG-35MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、CP-WAXMS（60 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱：美國(guó)安捷倫公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）固相微萃取頭、聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）固相微萃取頭、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）固相微萃取頭；二乙烯基苯/聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷（DVB/Carbowax/PDMS）固相微萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果酒釀造方法

以傳統(tǒng)果酒發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，參照相關(guān)文獻(xiàn)研究[17-19]，分別進(jìn)行山楂酒、獼猴桃酒以及葡萄酒的釀造以及陳釀，并在釀造后0、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d、240 d取樣進(jìn)行甲醇及雜醇的測(cè)定。

1.3.2 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

將萃取頭插入GC進(jìn)樣口中，于250 ℃老化2 h。稱取2 mL樣品超聲5 min趕去不同果酒樣品中的氣泡后，置于10 mL頂空進(jìn)樣瓶中，插入萃取頭，于不同的萃取溫度下頂空萃取一段時(shí)間，于250 ℃解吸5.0 min。

根據(jù)以上條件為基礎(chǔ)，分別比較不同的萃取頭（PDMS固相微萃取頭、PA固相微萃取頭、DVB/Carbowax/PDMS固相微萃取頭、PDMS/DVB固相微萃取頭）；萃取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、萃取時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min）條件下的相對(duì)峰面積，考察不同條件對(duì)樣品中甲醇及雜醇組分萃取效果的影響。

1.3.3 氣相色譜條件優(yōu)化

CP-WAXMS毛細(xì)管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持10 min，以5℃/min升至150℃，保持10 min，再以10 ℃/min升至270℃，保持10 min；分流比20∶1；載氣為高純氮?dú)猓∟2）（99.99%）；空氣流速為300 mL/min；氫氣流速為20 mL/min；采用氫火焰離子化檢測(cè)器，溫度230 ℃進(jìn)樣方式為取頂空進(jìn)樣瓶上部氣體，進(jìn)樣體積1.0 mL。

根據(jù)以上條件為基礎(chǔ)，分別比較了3款毛細(xì)管色譜柱[TG-35MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、HP-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）、CP-WAXMS（60 m×250 μm×0.25 μm）]、不同的柱初始溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、載氣流速（10 mL/min、15 mL/min、20 mL/min、25 mL/min、30 mL/min）以及分流比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1）對(duì)待測(cè)8種組分分離效果的影響。

1.3.4 定性定量方法

如圖3所示，對(duì)于5G前傳，WDM-PON技術(shù)基于FTTX ODN的點(diǎn)對(duì)多點(diǎn)樹(shù)型網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌瑢?shí)現(xiàn)了單纖10～20通道的密集波分，能大量節(jié)省光纖布線資源，且每個(gè)通道提供25～50 Gbit/s的帶寬，滿足5G前傳通用公共無(wú)線電接口（eCPRI）的帶寬需求。對(duì)于采用集中化無(wú)線接入（C-RAN）架構(gòu)，需要在城區(qū)實(shí)現(xiàn)5G基站密集連續(xù)覆蓋，同時(shí)骨干光纖資源非常緊張的場(chǎng)景，WDM-PON是一個(gè)非常合適的技術(shù)。

依據(jù)標(biāo)樣中各組分的保留時(shí)間對(duì)樣品中各組分定性，采用外標(biāo)法定量。

1.3.5 方法學(xué)考察

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制甲醇質(zhì)量濃度為0.1～50 mg/mL，正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、活性戊醇、正戊醇質(zhì)量濃度為0.01～5.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，并對(duì)方法的加標(biāo)回收率、精密度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 樣品分析

將不同果酒樣品按氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。并利用該方法對(duì)陳釀?dòng)诔Ｓ萌萜髦械钠咸丫疲愥動(dòng)谙鹉就爸校⑸介疲愥動(dòng)诎卒P鋼容器中）、獼猴桃酒（陳釀?dòng)诎卒P鋼容器中）3種果酒中的甲醇、雜醇進(jìn)行測(cè)定，并跟蹤測(cè)定3種果酒陳釀過(guò)程中8種組分的含量變化。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用IBM SPSS Statistics 24軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.5和TBtools軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 固相微萃取頭的選擇

圖1 不同萃取頭對(duì)各組分萃取效果的影響Fig.1 Effect of different extraction heads on extraction efficiency of each component

由圖1可知，PDMS固相微萃取頭的頂空萃取效果最好，8種組分測(cè)定的相對(duì)峰面積都＞90%，其次是PA固相微萃取頭，而DVB/Carbowax/PDMS固相微萃取頭和PDMS/DVB固相微萃取頭對(duì)8種組分的頂空萃取效果不佳，相對(duì)峰面積＜80%。這主要因?yàn)楣滔辔⑤腿∵^(guò)程中萃取效果主要受萃取頭涂層極性以及表面積的影響，非極性涂層萃取非極性化合物效果較好，果酒樣品的甲醇及雜醇屬偏非極性，而PDMS屬于偏非極性的固相微萃取頭，而Carbowax和DVB固相微萃取頭更適用于偏極性化合物的萃取，因此本試驗(yàn)頂空萃取選擇PDMS固相微萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的選擇

頂空萃取過(guò)程中萃取溫度對(duì)萃取效果有雙重作用[21-22]。萃取溫度越高時(shí)，果酒中的甲醇及雜醇分子擴(kuò)散速度加快，萃取時(shí)間變短；但是萃取溫度越高，甲醇及雜醇在固相微萃取頭的涂層中分配系數(shù)也會(huì)降低，吸附量會(huì)減小，影響萃取頭的靈敏度。本研究在上述實(shí)驗(yàn)條件下，分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的溫度下萃取60 min，比較不同萃取溫度對(duì)各組分頂空吸附的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)各組分萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of each component

由圖2可知，50 ℃條件下的PDMS萃取頭對(duì)果酒樣品中的甲醇及雜醇的吸附量最大，說(shuō)明在此溫度下的頂空萃取效果最佳。而萃取溫度為40 ℃時(shí)，甲醇及雜醇的擴(kuò)散速度較慢或揮發(fā)不完全，萃取效果不佳；而萃取溫度達(dá)到60 ℃以上時(shí)，樣品中甲醇及雜醇組分在PDMS固相萃取頭的涂層中分配系數(shù)降低，各組分的吸附量均有不同程度的減小。綜合考慮，選擇50 ℃作為萃取溫度。

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇

不同萃取時(shí)間對(duì)果酒樣品中甲醇及雜醇頂空萃取效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)各組分萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of each component

由圖3可知，隨著頂空萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，固相萃取頭對(duì)樣品中甲醇及雜醇的吸附量逐漸增加；當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)40 min后，固相萃取頭吸附量趨于飽和，吸附能力減弱，但同時(shí)分子擴(kuò)散還同時(shí)在進(jìn)行，表現(xiàn)為甲醇及雜醇的吸附量開(kāi)始有不同程度下降。因此，選擇40 min作為固相微萃取時(shí)間。

2.2 氣相色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

由于不同果酒經(jīng)發(fā)酵陳釀后成分復(fù)雜，酒體中揮發(fā)性組分較多，易對(duì)待測(cè)組分造成干擾，故要選擇一款能將待測(cè)8種目標(biāo)組分分離的毛細(xì)管色譜柱，以便在后續(xù)樣品分析中對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，3款毛細(xì)管色譜柱對(duì)8種待測(cè)物分離效果的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，TG-35MS、HP-5MS兩款毛細(xì)管色譜柱分離8種待測(cè)組分時(shí)，部分目標(biāo)組分分離度不佳、峰形不理想；而CP-WAXMS毛細(xì)管色譜柱由于口徑小，涂層較厚，能將甲醇與雜醇分離，且異戊醇與活性戊醇這兩種性質(zhì)相近的雜醇也能有效被分離，能滿足分離低沸點(diǎn)、成分復(fù)雜的果酒樣品檢測(cè)需求。

圖4 不同色譜柱的分離效果Fig.4 Separation effect of different chromatographic columns

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

毛細(xì)管氣相色譜分析待測(cè)物組分時(shí)，在選用上述CPWAXMS毛細(xì)管色譜柱的條件下，對(duì)影響8種組分分離的其他氣相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，分別比較不同的柱初始溫度、載氣流速以及分流比對(duì)待測(cè)8種組分分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，待測(cè)組分的分離度、保留時(shí)間和靈敏度均受到柱初始溫度直接影響。當(dāng)柱初始溫度為40 ℃時(shí)，甲醇與異丙醇分離度差，之后逐步升溫，發(fā)現(xiàn)最佳溫度為50 ℃，分離效果好；而載氣流速較小時(shí)，分析時(shí)間長(zhǎng)，載氣流速太大，分離效果差，最佳載氣流量為15 mL/min。選擇分流比時(shí)分流歧視會(huì)受到一般分流比大小的影響，通常分流歧視會(huì)因比值越大則可能性越大，比值越小，甲醇峰出現(xiàn)扁平現(xiàn)象，所以選擇20∶1的分流比。故最佳色譜條件為初始溫度50 ℃，載氣流速15 mL/min，分流比20∶1，此時(shí)8種組分的分離效果較好，具有較高的準(zhǔn)確度，混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖見(jiàn)圖5。由圖5可知，此條件下各物質(zhì)分離情況良好。

圖5 甲醇及雜醇混合標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of methanol and fusel mixed standards

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 果酒中甲醇、雜醇的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

分別配制甲醇質(zhì)量濃度為0.1～50 mg/mL，正丙醇、異丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、活性戊醇、正戊醇質(zhì)量濃度為0.01～5.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中檢出限（limit of detection，LOD）以信噪比（S/N）=3計(jì)算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以信噪比（S/N）=10計(jì)算，結(jié)果如表1所示。

表1 8種組分的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 1 Retention time,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 8 kinds of components

續(xù)表

由表1可知，8種組分在標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R＞0.999），并得到8種目標(biāo)組分的檢出限為0.001 0～0.005 0 mg/mL，定量限為0.003 0～0.015 0 mg/mL。

2.3.2 加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)

分別添加0.010 mg/mL、0.10 mg/mL、1.0 mg/mL 3個(gè)梯度濃度的甲醇及雜醇混合溶液到已知本底濃度果酒樣品中，每個(gè)水平測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Recovery and precision test results of the method (n=5)

由表2可知，8種組分的3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為88.3%～96.7%，重復(fù)測(cè)定5次的精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD范圍為2.7%～5.1%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要的準(zhǔn)確度和精密度，可以用于果酒樣品中雜醇的分析檢測(cè)。

2.4 樣品中目標(biāo)物的測(cè)定

按照確定的測(cè)定方法，對(duì)3種果酒6批樣品進(jìn)行氣相色譜分析，采用外標(biāo)法定量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 果酒樣品中醇類物質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of alcohols in fruit wine samples

從表3可知，3種果酒成品中主要的雜醇為正丙醇、異丁醇、異戊醇，雜醇總量均＜0.4 mg/mL，甲醇含量＜0.2mg/mL，各組分含量適中，賦予了果酒芳香的口味和酒體的醇厚感。

2.5 陳釀時(shí)間對(duì)甲醇和雜醇含量的影響

新釀制的果酒一般需貯存一段時(shí)間，以減少新酒中的辛辣性[23-24]，使酒體更綿軟和適口。本研究選擇3種果酒（葡萄酒、山楂酒、獼猴桃酒）為研究對(duì)象，分別研究在常用陳釀容器中陳釀240 d酒體中甲醇、雜醇含量的變化，結(jié)果分別見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 陳釀時(shí)間對(duì)甲醇含量的影響Fig.6 Effect of aging time on methanol content

圖7 陳釀時(shí)間對(duì)雜醇含量的影響Fig.7 Effect of aging time on fusel content

由圖6可知，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒中的甲醇含量下降趨勢(shì)明顯，陳釀240 d后甲醇含量由最初的0.181 mg/mL下降到0.139 mg/mL；而山楂酒和獼猴桃酒中的甲醇含量呈緩慢下降趨勢(shì)，變化不顯著。這可能是與不同果酒的酒體特性以及選用的陳釀容器有關(guān)，甲醇為低沸點(diǎn)易揮發(fā)物質(zhì)，選用的陳釀容器氣孔率越高、致密度越小，越有利于其揮發(fā)至外界中，葡萄酒陳釀時(shí)使用的橡木桶的孔隙較大，與外界氣體交換率高，故葡萄酒的酒體中甲醇含量下降最多。

由圖7可知，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒中的雜醇總量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，陳釀240 d后雜醇總量由0.235 mg/mL上升到0.449 mg/mL；而山楂酒、獼猴桃酒中的雜醇總量隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。在陳釀過(guò)程中，由于雜醇的揮發(fā)性較小，隨著乙醇和水的揮發(fā)，導(dǎo)致了雜醇總量相對(duì)濃縮；但同時(shí)雜醇也會(huì)在陳釀的過(guò)程中被酒中的溶氧緩慢氧化分解成醛，醛再被氧化成酸，這會(huì)導(dǎo)致雜醇含量的下降。葡萄酒在陳釀過(guò)程中，一般使用的橡木桶孔隙較大，與外界氣體交換率高，這會(huì)導(dǎo)致含量升高的濃縮作用大于降低含量的化學(xué)反應(yīng)，致使葡萄酒在陳釀過(guò)程中雜醇總量變現(xiàn)為上升趨勢(shì)；而山楂酒與獼猴桃酒陳釀使用的不銹鋼容器與氣體交換率低，含量升高的濃縮作用小于降低含量的化學(xué)反應(yīng)，故雜醇含量呈下降趨勢(shì)。何瓊等[25]研究了無(wú)花果酒陳釀期甲醇及雜醇含量的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)無(wú)花果酒陳釀9個(gè)月后，酒體中正丙醇、正丁醇、異戊醇的含量都隨著陳釀時(shí)間的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，同時(shí)甲醇含量也下降了27.58%，與本研究中山楂酒與獼猴桃酒陳釀過(guò)程中的趨勢(shì)相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的結(jié)論。這些果酒中雜醇在陳釀過(guò)程下降的原因可能是轉(zhuǎn)化為相應(yīng)醛類及酸類物質(zhì)，如異丁醇、異戊醇可以轉(zhuǎn)化形成乙酸酯，而甲醇的下降是陳釀過(guò)程中轉(zhuǎn)化為了甲酸。

3 結(jié)論

該研究建立了一種利用HS-SPME-GC法同時(shí)測(cè)定果酒中甲醇和雜醇的研究方法，并優(yōu)化了其試驗(yàn)條件，并利用建立的方法對(duì)葡萄酒、山楂酒、獼猴桃酒3種果酒陳釀過(guò)程中的甲醇、雜醇含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，各化合物在0.01～50 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R＞0.999），該方法的檢出限為0.001～0.005 mg/mL，定量限為0.003～0.015 mg/mL，加標(biāo)回收率達(dá)到88.3%～96.7%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為2.7%～5.1%。隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，3種果酒中的甲醇均有不同程度的下降，其中下降最快的是葡萄酒中的甲醇；而隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄酒酒樣中的雜醇總量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，山楂酒、獼猴桃酒酒體中的雜醇總量均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。該方法準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)單，利用該方法可對(duì)不同果酒中甲醇、雜醇進(jìn)行分析和測(cè)定，有助于提高檢測(cè)和分析此類樣品的效率，為果酒行業(yè)的質(zhì)量改進(jìn)提供試驗(yàn)依據(jù)。