苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

曹新志，宋澤麗，胡 琴，趙迎慶，張楷正

（1.宜賓四川輕化工大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；3.中化（臨沂）作物營(yíng)養(yǎng)有限公司，山東 臨沂 271000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）是一種優(yōu)質(zhì)的藥食兩用谷物資源[1-2]，其植株適應(yīng)性強(qiáng)，種植范圍廣，是醫(yī)藥和食品的優(yōu)質(zhì)谷物來(lái)源[3-4]。黃酮類(lèi)化合物是苦蕎中最重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗糖尿病和降膽固醇等多種功效[5-6]?？嗍w中淀粉含量高，占總干質(zhì)量的70%左右[5]，是發(fā)酵釀造的理想原料。

苦蕎因其豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生物活性成分，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。在食品和醫(yī)藥方面，都有不少的加工產(chǎn)品，苦蕎饅頭、苦蕎面和苦蕎茶等常見(jiàn)于日常生活中[8-10]。其中以苦蕎作為發(fā)酵原料釀造的醋[9]、啤酒[11]、酸奶[12]等產(chǎn)品兼具有苦蕎特征性風(fēng)味及高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。作為小曲酒釀造研究國(guó)之一，我國(guó)學(xué)者已在苦蕎小曲酒釀造方面進(jìn)行了許多研究，萬(wàn)萍等[14]通過(guò)對(duì)酒曲和打量水的用量及糧糠比和發(fā)酵時(shí)間的研究對(duì)固態(tài)法釀造苦蕎酒的工藝進(jìn)行了初探；李園園[15]以苦蕎米為原料，采用液態(tài)法對(duì)糖化及發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，使淀粉轉(zhuǎn)化率和酒精度得以提高。但鮮有人研究半固態(tài)發(fā)酵工藝釀造苦蕎小曲酒。

本研究以苦蕎為原料，采用半固態(tài)發(fā)酵方法釀造苦蕎小曲酒，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)從不同料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，確定最優(yōu)工藝條件，并采用氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測(cè)定苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分。以期為今后苦蕎小曲酒的研究和生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：四川省涼山彝族自治州；小曲：重慶市合川區(qū)鑫星曲藥廠；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、氫氧化鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；H01-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；DL-1電子萬(wàn)用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；AR1140電子天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Thermo 868 pH計(jì)：熱電（上海）科技儀器有限公司；TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦蕎小曲酒的釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料處理、泡糧：選擇顆粒飽滿，無(wú)霉粒的優(yōu)質(zhì)苦蕎，苦蕎按料水比1∶3（g∶mL），以先水（水溫60 ℃）后糧的順序加入泡糧容器中，由邊緣先內(nèi)部翻拌苦蕎一次，刮平，過(guò)程中不再攪拌，避免產(chǎn)酸，浸泡4 h。

蒸糧、出甑：將浸泡好的苦蕎瀝去水分，倒入甑內(nèi)，圓氣后加蓋蒸40 min，蒸熟的苦蕎飽滿，手捏軟綿，無(wú)硬心。

攤晾、拌小曲：將蒸熟的苦蕎取出放于攤晾盤(pán)中，攤涼至40 ℃左右加入苦蕎質(zhì)量0.6%的小曲。

培菌糖化：將拌好小曲的糧醅置于白瓷盤(pán)中蓋上紗布，于30 ℃條件下糖化25 h。在2 h內(nèi)完成攤晾、拌曲和上箱，以防止雜菌的感染，以免影響培菌。

半固態(tài)發(fā)酵：糖化完成后，將糧醅裝入5 L白酒發(fā)酵罐封口發(fā)酵，按料水比1∶1.5（g∶mL）加水混合均勻，于28 ℃恒溫發(fā)酵9 d。

蒸餾：采用液態(tài)蒸餾法，保證摘酒溫度維持在25 ℃以下，掐頭去尾接酒，得到原酒。

1.3.2 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

通過(guò)出酒率、總酸含量、總酯含量及感官評(píng)分進(jìn)行判定，分別考察料水比（1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5（g∶mL）），發(fā)酵時(shí)間（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d），發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）3個(gè)因素對(duì)苦蕎小曲酒品質(zhì)的影響，探究最佳釀造工藝條件。

1.3.3 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以出酒率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)料水比（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和發(fā)酵溫度（C）進(jìn)行優(yōu)化，確定苦蕎小曲酒的最佳半固態(tài)發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定

總固形物含量的測(cè)定：參照《釀酒分析與檢測(cè)》[16]中的方法；酒精度的測(cè)定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的酒精計(jì)法；總酸、總酯的測(cè)定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的指示劑法。

1.3.5 原料出酒率的計(jì)算

1.3.6 感官評(píng)定

由12位前期經(jīng)過(guò)白酒品評(píng)訓(xùn)練的專(zhuān)業(yè)人員依據(jù)DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》[18]進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2，取12人的平均分，滿分100分。

表2 苦蕎小曲酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.7 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

苦蕎小曲酒中揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定采用GC-MS法。分析條件設(shè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[19]。揮發(fā)性產(chǎn)物的定性、定量分析參照文獻(xiàn)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對(duì)苦蕎小曲酒品質(zhì)的影響

不同料水比對(duì)苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著料水比的變化，苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)分呈先升高后降低的趨勢(shì)，料水比為1.0∶1.5（g∶mL）時(shí)出酒率和感官評(píng)分均為最高，分別為（57.54±0.30）%、（82.37±0.50）分。這可能是因?yàn)樗痔贂?huì)抑制酵母的生產(chǎn)繁殖，以致于出酒率不高、而水分含量太高，則會(huì)稀釋酒精度，從而降低出酒率。因此，選取料水比為1.0∶1.5（g∶mL）為宜。

圖1 不同料水比對(duì)苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of different material and water ratios on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同料水比對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著料水比的減小，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量整體呈先略微上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料水比在1.0∶0.5～1.0∶1.5（g∶mL）范圍內(nèi)變化時(shí)，總酸、總酯含量變化不顯著（P＞0.05），在料水比＜1.0∶1.5（g∶mL）后，總酸、總酯含量下降顯著（P＜0.05）；因此，選取料水比為1∶1.5（g∶mL）為宜。

圖2 不同料水比對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響Fig.2 Effect of different material and water ratios on total acids and total esters content of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定料水比為1.0∶1.5（g∶mL）。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎小曲酒出酒率呈先升高后降低的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間9 d時(shí)出酒率最高，為（58.56±0.26）%；這可能是因?yàn)? d后酵母進(jìn)入停滯或衰退期，不再合成酒精，導(dǎo)致出酒率降低。同時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，感官評(píng)分呈先上升后逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間＞9 d后，變化不顯著（P＞0.05）。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間9 d為宜。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量先逐漸增加，發(fā)酵時(shí)間＞9 d后趨于平穩(wěn)，變化不顯著（P＞0.05）。這可能由于在發(fā)酵過(guò)程中隨著微生物的生長(zhǎng)繁殖都會(huì)產(chǎn)生各種有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間9 d為宜。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯的影響Fig.4 Effects of different fermentation time on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定發(fā)酵時(shí)間為9 d。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎小曲酒品質(zhì)的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎小曲酒出酒率及感官評(píng)價(jià)的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)價(jià)均先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)出酒率和感官評(píng)分均為最高，分別為（58.52±0.4）%、（84.75±0.37）分；這是由于過(guò)低的溫度使酵母的生長(zhǎng)和代謝較緩慢，使其產(chǎn)酒率低，溫度過(guò)高使酵母利用還原糖代謝產(chǎn)出酒精的能力下降。因此，選擇發(fā)酵溫度28 ℃為宜。

圖5 不同發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎小曲酒出酒率和感官評(píng)分的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperature on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量而逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到28 ℃后則無(wú)明顯變化（P＞0.05）。因此，選擇發(fā)酵溫度28 ℃為宜。

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)苦蕎小曲酒總酸和總酯的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperature on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.2 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，3個(gè)因素對(duì)出酒率高低的影響順序?yàn)榱纤龋ˋ）＞發(fā)酵溫度（C）＞發(fā)酵時(shí)間（B）。通過(guò)極差分析得到半固態(tài)發(fā)酵工藝最佳條件組合為A2B2C2，即料水比1.0∶1.5（g∶mL）、發(fā)酵時(shí)間9 d、發(fā)酵溫度28 ℃。

表3 苦蕎小曲酒半固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

由表4可知，料水比對(duì)半固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中出酒率有極顯著影響（P＜0.01），發(fā)酵溫度對(duì)半固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中出酒率有顯著影響（P＜0.05），發(fā)酵時(shí)間對(duì)半固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中出酒率影響不顯著（P＞0.05）。

將正交試驗(yàn)中由直觀分析所得的最優(yōu)組合A2B1C2（對(duì)照組）和理論最優(yōu)組合A2B2C2（驗(yàn)證組）同時(shí)進(jìn)行5次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組合A2B1C2出酒率為（58.28±0.26）%，組合A2B2C2出酒率為（58.96±0.39）%，兩組出酒率有顯著性差異（P＜0.05），且理論最優(yōu)組較高。故選擇最優(yōu)半固態(tài)發(fā)酵工藝條件為A2B2C2，即料水比1∶1.5（g∶mL）、發(fā)酵時(shí)間9 d、發(fā)酵溫度28 ℃。

2.3 苦蕎小曲酒部分理化指標(biāo)分析

對(duì)最佳工藝條件下釀造的苦蕎小曲酒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，苦蕎小曲酒酒精度為（52.70±0.92）%vol；出酒率為（58.06±0.65）%；總酸和總酯的含量分別為（0.69±0.07）g/L和（2.18±0.19）g/L，總酸和總酯比例協(xié)調(diào)；經(jīng)測(cè)定基酒中的總固形物含量為（0.09±0.01）g/L；感官評(píng)分為（85.33±0.58）分，且每批次釀造出的苦蕎小曲酒的酒體都清亮透明且香味協(xié)調(diào)，具有乙酸乙酯為主體的協(xié)調(diào)性復(fù)合香氣且伴有苦蕎特有的清香?？嗍w小曲酒的各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合GB/T 26761—2011《小曲固態(tài)法白酒》[21]要求。

表5 苦蕎小曲酒部分理化指標(biāo)分析結(jié)果Table 5 Analysis results of some physicochemical indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

2.4 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

采用GC-MS檢測(cè)最優(yōu)工藝條件下生產(chǎn)的苦蕎小曲酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 苦蕎小曲酒揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS分析結(jié)果Table 6 Results of volatile components in tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu analysis by GC-MS

續(xù)表

由表6可知，利用GC-MS從苦蕎小曲酒中共檢出53種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括23種醇類(lèi)物質(zhì)、19種酯類(lèi)物質(zhì)、5種酸類(lèi)物質(zhì)、2種醛類(lèi)物質(zhì)、3種烴類(lèi)物質(zhì)、1種其他類(lèi)物質(zhì)。其中酯類(lèi)化合物和芳香族化合物是最突出的化合物。其中對(duì)酒體的主要香型和風(fēng)格影響最大的就是酯類(lèi)化合物。它們主要以乙酯的形式存在，賦予小曲酒以果香和花香的感官特征[22]。乙酸乙酯和乳酸乙酯在苦蕎小曲酒中的含量最高?？嗍w小曲酒中的酯類(lèi)香氣成分主要來(lái)自微生物的代謝和生化反應(yīng)，還有少數(shù)是通過(guò)酯化反應(yīng)產(chǎn)生的[23]。醇類(lèi)化合物中，除乙醇外含量較高的是異戊醇、異丁醇、正丙醇、2-甲基丁醇、正戊醇、乙偶姻、異丁醇。其中異丁醇、異戊醇是雜醇油的主要成分，含量過(guò)高會(huì)使人頭痛、頭暈等[24]。乙酸是苦蕎小曲酒中含量最高的酸類(lèi)化合物，達(dá)870.95 mg/L，酸類(lèi)化合物具有維持酯類(lèi)香氣的作用[25]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以苦蕎為原料，以小曲為糖化發(fā)酵劑，采用半固態(tài)發(fā)酵法釀造苦蕎小曲酒，采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最優(yōu)半固態(tài)發(fā)酵工藝為料水比1.0∶1.5（g∶mL）、發(fā)酵時(shí)間9 d、發(fā)酵溫度28 ℃。在此條件下發(fā)酵的苦蕎小曲酒酒精度為52.7%vol；出酒率為58.06%；總酸和總酯的含量分別為0.69 g/L、2.18 g/L；總固形物含量為0.09 g/L；感官評(píng)分為85.33分。采用GC-MS從苦蕎小曲酒中共檢出揮發(fā)性成分53種，其中23種醇類(lèi)物質(zhì)、19種酯類(lèi)物質(zhì)、5種酸類(lèi)物質(zhì)、2種醛類(lèi)物質(zhì)、3種烴類(lèi)物質(zhì)、1種其他類(lèi)物質(zhì)。本研究為后續(xù)半固態(tài)法釀造苦蕎小曲酒的生產(chǎn)和研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。