貝萊斯芽孢桿菌對小曲酒釀造過程中酵母菌生長及風(fēng)味物質(zhì)代謝的影響

蒲領(lǐng)平，鄧 杰，衛(wèi)春會(huì)，任志強(qiáng)，黃治國

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 遂寧 629200）

白酒為中國特有的一種蒸餾酒，多使用細(xì)菌、酵母菌、霉菌等微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵而成[1-2]。隨著白酒產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，單一菌種發(fā)酵引起白酒風(fēng)味特征同質(zhì)化，商業(yè)競爭力降低的問題逐漸凸顯出來。然而，接種發(fā)酵可以通過影響微生物群落的代謝活性，進(jìn)而改善發(fā)酵食品的風(fēng)味。如接種地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）能夠增加醬香型白酒酒醅發(fā)酵液中的風(fēng)味物質(zhì)，提高感官評分[3]；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）的相互作用有利于乙酸乙酯的合成[4]。酵母菌在酒精發(fā)酵中起著主發(fā)酵的作用，芽孢桿菌類普遍存在于清香型小曲白酒酒醅中[5]，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）作為重要的釀酒功能微生物，是白酒高溫大曲的優(yōu)勢菌，具有較高的產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)淀粉酶能力，能通過調(diào)節(jié)代謝活性，改變大曲的原生菌群、酶活性和風(fēng)味成分[6]。作為一種新興的功能性菌種[7]，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵領(lǐng)域[8-9]。貝萊斯芽孢桿菌在白酒領(lǐng)域的研究，主要是從大曲中分離出具有高發(fā)酵力和高活性的菌株[10-11]。目前，對于白酒中芽孢桿菌和酵母菌的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究較多[12-13]，而將貝萊斯芽孢桿菌用到強(qiáng)化酒醅的制作中，研究其在小曲清香型白酒釀造過程中對酵母菌影響的相關(guān)報(bào)道較少。因此有必要對貝萊斯芽孢桿菌和酵母菌之間的相互作用進(jìn)行探究。

本研究通過在酒醅中強(qiáng)化添加不同量的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），跟蹤分析了在強(qiáng)化酒醅制作過程中釀酒酵母的變化，對其發(fā)酵液酒精含量進(jìn)行測定，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀測定固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中總酯和高級醇含量，探究了貝萊斯芽孢桿菌對酵母菌生長及風(fēng)味物質(zhì)的影響，旨在為芽孢桿菌在小曲清香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BI1：由釀酒微生物技術(shù)與應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；糖化發(fā)酵劑（釀酒曲）（含釀酒酵母109CFU/g）：安琪酵母股份有限公司；高粱、糠殼：宜賓市售。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨、瓊脂粉（均為生化試劑）、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、孟加拉玫瑰紅、葡萄糖、無水乙醇（均為分析純）：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；2-辛醇（2 mg/mL）、乙酸戊酯（3 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、胰白胨10 g/L（固體加入瓊脂粉20 g/L），pH 7.0。

孟加拉紅培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、孟加拉紅0.03 g/L、瓊脂粉20 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱∶水（質(zhì)量比）=1∶4，加10 U/gα-淀粉酶90 ℃液化1 h，150 U/g 糖化酶60 ℃糖化3 h，過濾離心，調(diào)節(jié)糖度至10 °Bx[14]。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；LS-1201生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；A360紫外分光光度計(jì)：上海翱藝儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌BI1種子液的制備

菌株的活化與保藏：挑取一環(huán)貝萊斯芽孢桿菌BI1菌體于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)1 d后，取菌液分別稀釋104、105、106倍后，取100 μL菌液，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在成功獲取單菌落后再挑取單菌落進(jìn)行平板劃線，活化完成后，以斜面4 ℃保藏備用。

種子液的制備：挑取一環(huán)菌體于已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)14 h，使菌體達(dá)到對數(shù)生長期；取3～5 mL菌液用紫外可見分光光度計(jì)測定OD660nm值，當(dāng)OD660nm為1.0時(shí)，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.2 麩皮小曲制作工藝

稱取100 g麩皮和100 mL水混勻，121 ℃滅菌20 min，烘干備用。取10 mL貝萊斯芽孢桿菌種子液于15 mL離心管中，6 000 r/min離心后，將菌體接種至滅菌后的麩皮中，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，于40 ℃烘箱中烘干后打碎備用。

1.3.3 白酒固態(tài)釀造工藝流程

參照小曲清香型白酒釀造工藝，以高粱為原料，5 L保溫桶為發(fā)酵容器，將高粱均勻粉碎，添加0.4%釀酒曲，潤糧4 h后與清水混合后蒸糧4 h，攤晾冷卻后加曲拌糠，然后25 ℃培菌，最后將酒醅放入30 ℃房間發(fā)酵15 d。按照不同的發(fā)酵時(shí)間（0 d、5 d、10 d、15 d）在上、中、下層3個(gè)點(diǎn)取等量樣品，混合均勻，用四分法縮分后，裝入廣口瓶中作為供試樣品。小曲清香型白酒固態(tài)釀造工藝如下：

1.3.4 貝萊斯芽孢桿菌接種順序?qū)Πl(fā)酵的影響

（1）先接種釀酒酵母：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1×106CFU/g釀酒酵母，12 h后分別接種0（空白對照組）、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g的貝萊斯芽孢桿菌，在發(fā)酵0 d、5 d、10 d和15 d取樣測生物量。

（2）先接種貝萊斯芽孢桿菌：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種0（空白對照組）、1×104CFU/g、1×105CFU/g、1×106CFU/g的貝萊斯芽孢桿菌，發(fā)酵12 h后接種1×106CFU/g釀酒酵母，在發(fā)酵0 d、5 d、10 d和15 d取樣測生物量。

1.3.5 測定方法

（1）酵母菌生物量的測定

稱取5 g麩曲樣品，加入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30 min。吸取100 μL菌液到1.5 mL EP管，加入0.9 mL無菌水，稀釋10倍。吸取100 μL上述稀釋液，涂布于LB培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基上，分別于37 ℃培養(yǎng)24 h，28 ℃培養(yǎng)48 h。采用稀釋涂布平板法測定酵母菌生物量。

（2）固態(tài)釀造酒醅酒精度測定

稱取100 g發(fā)酵15 d的酒醅于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL水混勻，緩緩加熱蒸餾，以100 mL容量瓶收集餾出液。參照國標(biāo)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的酒精計(jì)法測量酒精度。

（3）總酯和高級醇含量測定

根據(jù)文獻(xiàn)[15]，采用GC-MS法對發(fā)酵完成后發(fā)酵液的高級醇含量與總酯含量進(jìn)行分析。

樣品測定：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》對酒醅進(jìn)行處理，稱取酒醅樣本100 g，加入體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液100 mL浸泡30 min，再加入100 mL去離子水，混勻，蒸餾出100 mL樣液；取900 μL樣液于進(jìn)樣瓶中，加入2 mg/mL的2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液和3 mg/mL乙酸戊酯內(nèi)標(biāo)溶液各50 μL，隨后自動(dòng)進(jìn)樣。

氣相色譜條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（60.00 mm×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為99.999%氦氣（He）；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃，保持1 min；3 ℃/min升到46℃，6 ℃/min升到64℃，保持2min；8 ℃/min升到117 ℃，保持1 min；15 ℃/min升到230 ℃并保持5 min；載氣流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，離子源溫度為230 ℃；電子能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為20～550 amu；四極桿溫度為150 ℃。

定性方法：采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology）05a.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對，用GC-MS 化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖進(jìn)行定性。

定量方法：以2 mg/mL的2-辛醇和3 mg/mL乙酸戊酯內(nèi)標(biāo)溶液為標(biāo)準(zhǔn)物，檢測代謝產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)。采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

設(shè)置3組平行，試驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（xˉ±S）表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌與酵母菌接種先后順序的比較

糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌與糖化后接種貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵對酵母菌數(shù)量的影響結(jié)果見圖1。

酵母菌是白酒生產(chǎn)的關(guān)鍵，其生長的優(yōu)劣直接影響白酒的品質(zhì)和出酒率。由圖1A可知，隨著菌株BI1添加量的不斷增大，酵母菌數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢，但都在一個(gè)數(shù)量級，菌株BI1添加量為104CFU/g發(fā)酵5 d時(shí)，酵母菌數(shù)量最大為（3.50±0.1）×108CFU/g，貝萊斯芽孢桿菌添加量為106CFU/g發(fā)酵15 d時(shí)，酵母菌數(shù)量最小為（6.98±0.4）×107CFU/g，說明酵母菌數(shù)量與該菌添加量呈負(fù)相關(guān)。由圖1B可知，糖化后接種貝萊斯芽孢桿菌的培養(yǎng)基中，在發(fā)酵第5～10天酵母菌的數(shù)量差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵第5天酵母菌的數(shù)量達(dá)到峰值，這可能是因?yàn)榻湍妇纳L周期短，在5 d左右就進(jìn)入對數(shù)生長期；而發(fā)酵10 d后，酵母菌的數(shù)量急劇減少，可能是由于較高生物量的菌株BI1影響了酒醅的微生物區(qū)系，使酒醅中酵母菌的生長受到一定抑制，這與先前報(bào)道結(jié)果一致[16]。因此，糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌BI1更有利于白酒的發(fā)酵。

圖1 不同接種順序?qū)湍妇L的影響Fig.1 Effect of different inoculation sequence on the growth of yeast

2.2 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酒精度的影響

酒精含量是酵母細(xì)胞代謝途徑和能量利用的外部表現(xiàn)，在白酒釀造中發(fā)揮極其重要的作用[17-19]，這說明能夠一定程度上反映出原酒出酒率和原酒質(zhì)量，貝萊斯芽孢桿菌添加量對發(fā)酵液酒精度的影響結(jié)果見圖2。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酒精度的影響Fig.2 Effect of Bacillus velezensis addition on alcohol content

由圖2可知，隨著貝萊斯芽孢桿菌添加量的增加，酒精度呈下降趨勢，可能是因?yàn)榧?xì)菌能夠抑制酵母菌的乙醇代謝[20]；與空白對照組相比，添加1×106CFU/g貝萊斯芽孢桿菌的菌株BI1能顯著降低發(fā)酵液的酒精度（P＜0.05），可能是由于發(fā)酵過程中微生物間營養(yǎng)及氧氣競爭[21-22]，導(dǎo)致酵母菌的產(chǎn)醇能力會(huì)在與其他微生物的相互作用中而改變，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量降低，進(jìn)而酒精度下降。因此，貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

2.3 貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響

酵母菌利用發(fā)酵原料中游離的氨基氮，從而合成自身生長繁殖所需的蛋白質(zhì)，當(dāng)氨基酸中的氨基被利用后，殘余的α-酮酸經(jīng)過發(fā)酵脫羧與加氫還原，可以得到相應(yīng)的高級醇[23]，高級醇能夠增加白酒的協(xié)調(diào)感和飽滿感，但高級醇含量過高會(huì)對白酒品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[24-25]，不同貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響見表1及圖3。

表1 不同添加量貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液的高級醇含量Table 1 Higher alcohol contents in fermentation broth of Bacillus velezensis with different addition

圖3 貝萊斯芽孢桿菌添加量對高級醇含量的影響Fig.3 Effect of Bacillus velezensis addition on higher alcohol contents

由表1及圖3可知，3種添加量貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)高級醇能力存在明顯差異，總體上，產(chǎn)異戊醇最強(qiáng)，產(chǎn)2-乙烯氧基乙醇最弱，但這五種高級醇含量均低于空白對照組。隨著貝萊斯芽孢桿菌添加量的增加，總高級醇含量呈先下降后上升的趨勢，可能是因?yàn)樵谝欢ㄌ砑臃秶鷥?nèi)，貝萊斯芽孢桿菌對于抑制高級醇的產(chǎn)生有一定的作用[26]。然而，大量貝萊斯芽孢桿菌添加后的生物擾動(dòng)改變了微生物間的代謝活性，使得總高級醇含量上升[27]；在不同菌株BI1添加量下，總高級醇含量均低于空白對照組，可能是由于菌株BI1的存在影響酵母菌代謝途徑中關(guān)鍵酶和基因等發(fā)生改變，從而減弱了醇類物質(zhì)合成。綜合對總高級醇含量和對白酒的協(xié)調(diào)感的影響，最佳貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

2.4 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質(zhì)含量的影響

酵母菌主要通過酯化反應(yīng)途徑、醇?；D(zhuǎn)移酶途徑和醇脫氫酶途徑合成酯類物質(zhì)[28]。酒醅中總酯的含量在一定程度上反映了其發(fā)酵情況，大量酯類物質(zhì)有助于產(chǎn)生果香等[29]。貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質(zhì)含量的影響見表2及圖4。

表2 不同添加量貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液的酯類物質(zhì)含量Table 2 Esters contents in fermentation broth of Bacillus velezensis with different addition

圖4 貝萊斯芽孢桿菌添加量對酯類物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of Bacillus velezensis addition on esters contents

由表2及圖4可知，與空白對照組相比，添加貝萊斯芽孢桿菌后，乙酸乙酯、乳酸乙酯和癸酸乙酯的含量均有提高，其中添加104CFU/g菌株BI1條件下，乙酸乙酯與乳酸乙酯的比例為1∶1，這表明此時(shí)酒體風(fēng)格最佳。與空白對照相比，添加1×104CFU/g的菌株BI1能顯著增加發(fā)酵液的酯類物質(zhì)含量（P＜0.05），然而添加105CFU/g菌株BI1能顯著降低發(fā)酵液的酯類物質(zhì)含量（P＜0.05），這可能是由于接種了不同菌體濃度的芽孢桿菌菌株干擾了酒醅中其他微生物的生長代謝，導(dǎo)致發(fā)酵液中總酯含量有顯著區(qū)別。貝萊斯芽孢桿菌添加量為104CFU/g時(shí)總酯含量最高，因此最佳芽孢桿菌添加量為104CFU/g。

3 結(jié)論

固態(tài)發(fā)酵具有能耗低，發(fā)酵過程易于控制的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)通過建立實(shí)驗(yàn)室固態(tài)釀造模型，用貝萊斯芽孢桿菌制成麩曲添加到酒醅中發(fā)酵，研究其對小曲酒發(fā)酵過程中酵母菌生長和風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，糖化前接種貝萊斯芽孢桿菌BI1更有利于白酒的發(fā)酵。貝萊斯芽孢桿菌對酵母有生長抑制效應(yīng)，但是對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中酯類物質(zhì)含量有一定的提高作用，強(qiáng)化酒醅發(fā)酵液中高級醇含量低，綜合貝萊斯芽孢桿菌BI1對酒精度、高級醇和酯類物質(zhì)的影響，貝萊斯芽孢桿菌BI1最佳添加量為104CFU/g。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對生產(chǎn)高級醇含量低的優(yōu)質(zhì)小曲清香型白酒有指導(dǎo)意義，但由于酒醅中微生物之間的作用較復(fù)雜，后續(xù)還需要進(jìn)行更深一步的研究。