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    5 種食用菌水提物生物活性的比較

    2023-03-09 13:55:24韓明月郝利民王小龍江慶伍劉可可劉永奇伊娟娟魯吉珂
    食品科學(xué) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:水提物清除率光度

    韓明月,李 俐,郝利民,王小龍,江慶伍,李 雪,劉可可,劉永奇,伊娟娟,*,魯吉珂,*

    (1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院,北京 100010;3.河南省銀豐生物工程技術(shù)有限公司,河南 鄭州 450001;4.安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司,安徽 六安 237300)

    食用菌通稱為蘑菇,是一類可供食用、子實(shí)體碩大的真菌[1]。食用菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,含有多種對(duì)人體有益的活性成分,包括酚類化合物、萜類化合物、黃酮類化合物、多糖類化合物等,相應(yīng)展現(xiàn)出多種生物學(xué)功能,如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及輻射防護(hù)等作用[2-3]。

    在生物體內(nèi)自由基的生成和清除通常處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),自由基過剩將會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的氧化損傷,進(jìn)而誘導(dǎo)衰老、癌癥、肝損傷、心血管等疾病[4-5]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗各種病原微生物,如細(xì)菌、病毒和寄生蟲等的主要防御系統(tǒng)。機(jī)體在發(fā)揮免疫應(yīng)答時(shí)不僅依賴于胸腺、脾臟等免疫器官,還依賴于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[6]。隨著核能技術(shù)的廣泛應(yīng)用,人類經(jīng)常暴露于各種各樣的電離輻射中。但電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體的免疫、造血、生殖等系統(tǒng)造成不同程度的氧化損傷[7],天然輻射防護(hù)劑的開發(fā)在來源、效用、成本及安全等方面具有特殊的優(yōu)勢(shì),對(duì)人類健康具有十分重要的意義。

    食用菌具有開發(fā)成天然抗氧化劑、免疫調(diào)節(jié)劑和輻射防護(hù)劑的潛力,本研究以草菇、灰樹花、紅菇、雞腿菇、樹舌5 種食用菌水提物為實(shí)驗(yàn)材料,通過生物活性對(duì)比研究篩選出活性較高的食用菌水提物,為天然抗氧化劑和輻射防護(hù)劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    草菇水提物(water extracts ofVolvariellavolvacea,WEVV)、灰樹花水提物(water extracts ofGrifolafrondosa,WEGF)、紅菇水提物(water extracts ofRussulavinosa Lindblad,WERV)、雞腿菇水提物(water extracts ofCoprinus comatus,WECC)和樹舌水提物(water extracts ofGanoderma applanatum,WEGA)由安徽金寨喬康藥業(yè)有限公司提供。

    考馬斯亮藍(lán)G-250 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、沒食子酸、福林-酚 上海麥克林生化科技有限公司;蘆丁 北京索萊寶科技有限公司;鐵氰化鉀、過硫酸鉀 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸 上??曝S實(shí)業(yè)有限公司;三氯化鐵、硫酸亞鐵 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;苯酚、抗壞血酸(ascorbic acid,VC)、水楊酸 天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司;30%過氧化氫 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。以上試劑均為分析純。

    小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海);小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12 南京三生生物技術(shù)有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、地塞米松、胰蛋白酶消化液北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清 杭州四季青生物有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑美國(guó)Sigma試劑公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8) 上海陶術(shù)生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HH-2SC型恒溫水浴鍋 常州普天儀器制造有限公司;TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JW-1016型低速離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司;CMax Plus濾光片型光吸收酶標(biāo)儀美谷分子儀器(上海)有限公司;60Co γ輻射裝置(200萬 Ci) 河南省科學(xué)院同位素研究所有限公司;3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;QL-902型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 食用菌水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

    采用苯酚硫酸法測(cè)定食用菌水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、490 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=13.435x-0.023 7(R2=0.999 7)。

    1.3.2 食用菌水提物中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

    采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定食用菌水提物中總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9]。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、樣品反應(yīng)液在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=6.867 1x+0.002 7(R2=0.998 7)。

    1.3.3 5 種食用菌水提物中粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

    5 種食用菌水提物經(jīng)醇沉過夜,4 000 r/min離心10 min獲得粗多糖沉淀,將沉淀溶解定容,并參照出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定 苯酚-硫酸法》[8]測(cè)定樣品溶液中的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    1.3.4 食用菌水提物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

    采用福林-酚法檢測(cè)食用菌水提物中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、760 nm 波長(zhǎng)處的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=69.873x+0.002 3(R2=0.999 7)。

    1.3.5 食用菌水提物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

    采用NaNO2-AlCl3法測(cè)定食用菌水提物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品,其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、510 nm波長(zhǎng)處吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=7.577x-0.002 3(R2=0.999 8)。

    1.3.6 食用菌水提物的體外抗氧化活性測(cè)定

    1.3.6.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

    采用劉宇琪等[12]的方法測(cè)定。7.4 mmol/L的ABTS和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,避光靜置12~16 h,用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋,使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度在0.70±0.02左右,制成ABTS工作液。取不同質(zhì)量濃度的食用菌水提物溶液(0.2~1.0 mg/mL)以及VC溶液(0.001~0.005 mg/mL)各1 mL,加6 mL ABTS工作液,混勻并在室溫下靜置6 min,測(cè)定混合液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,按照公式(1)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。

    式中:A0為以等體積蒸餾水代替水提物樣品溶液的吸光度;A1為1 mL水提物樣品溶液與6 mL ABTS工作液混合的吸光度;A2為以等體積蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度。

    1.3.6.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

    采用Luan Xiaoxu等[13]方法評(píng)估DPPH自由基清除活性并稍作修改。分別將食用菌水提物配制成質(zhì)量濃度為0.2~1.0 mg/mL的樣品溶液,并分別取2 mL樣品溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混勻,靜置20 min后,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合液的吸光度。質(zhì)量濃度0.2~1.0 mg/mL的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組。以2 mL蒸餾水和2 mL無水乙醇混合液作為空白對(duì)照。根據(jù)公式(2)計(jì)算食用菌水提物清除DPPH自由基的能力。

    式中:A0為2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水混合的吸光度;A1為2 mL DPPH溶液與2 mL水提物樣品溶液混合的吸光度;A2為2 mL無水乙醇溶液與2 mL水提物樣品溶液混合的吸光度。

    1.3.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定

    參照Z(yǔ)hang Tao等[14]方法并稍作改進(jìn)。取不同質(zhì)量濃度的食用菌水提物(1.0~5.0 mg/mL)及VC溶液(0.1~0.5 mg/mL)各1 mL,依次加入1 mL 5 mmol/L FeSO4溶液、1 mL蒸餾水、1 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及1 mL 5 mmol/L H2O2溶液,混合均勻,37 ℃下放置30 min,測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處的吸光度,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,按公式(3)計(jì)算羥自由基清除率。

    式中:A0為等體積蒸餾水代替水提物樣品溶液的吸光度;A1為水提物樣品溶液的吸光度;A2為等體積蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

    1.3.6.4 總還原力測(cè)定

    根據(jù)Zhang Jingjing等[15]的方法并稍作修改,進(jìn)行總還原力測(cè)定。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度食用菌水提物溶液(0.2~1.0 mg/mL),依次加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液,混合均勻,50 ℃下靜置20 min,加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氟乙酸終止反應(yīng),3 000 r/min離心10 min,取2 mL上清液與2 mL蒸餾水、0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液混合均勻,50 ℃下靜置10 min,檢測(cè)混合液700 nm波長(zhǎng)處的吸光度,以吸光度表征總還原力的強(qiáng)弱。以蒸餾水為空白對(duì)照。以質(zhì)量濃度0.001~0.005 mg/mL的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照。

    1.3.7 食用菌水提物的體外免疫活性檢測(cè)

    采用CCK-8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖活性[16]。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞濃度接種于96 孔板中,過夜培養(yǎng)巨噬細(xì)胞使其充分貼壁。次日,5 種食用菌水提物(質(zhì)量濃度10~200 μg/mL)分別作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)組和LPS(質(zhì)量濃度1 μg/mL)組分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做5 個(gè)重復(fù)孔,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    24 h之后,棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM培養(yǎng)基,每孔避光加入110 μL,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1~4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度,并按公式(4)計(jì)算細(xì)胞存活率。

    式中:A0為CCK-8溶液吸光度;A1為陰性對(duì)照孔的吸光度;A2為樣品孔的吸光度。

    1.3.8 食用菌水提物的體外抗輻射活性檢測(cè)

    將小鼠正常肝細(xì)胞AML-12在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1% ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑和質(zhì)量濃度40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.3.8.1 AML-12細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    采用CCK-8方法檢測(cè)5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞活力的影響[17-18]。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AML-12細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,按照約5 000 個(gè)/孔加入96 孔板中,于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入10 μL不同質(zhì)量濃度的樣品,刺激AML-12細(xì)胞,PBS組作為陰性對(duì)照,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做5 個(gè)重復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)36 h,棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基,每孔避光加入110 μL,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1~4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度,并按公式(5)計(jì)算細(xì)胞存活率。

    式中:A0為CCK-8溶液吸光度;A1為陰性對(duì)照孔的吸光度;A2為樣品孔的吸光度。

    1.3.8.2 輻射防護(hù)實(shí)驗(yàn)

    通過60Co γ照射建立肝細(xì)胞AML-12輻射損傷模型,并采用CCK-8方法檢測(cè)5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞的放射保護(hù)作用[17-18]。AML-12細(xì)胞培養(yǎng)步驟與1.3.8.1節(jié)相同。當(dāng)樣品作用于細(xì)胞后于體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行60Co γ射線輻射處理,輻射劑量為6 Gy,劑量率為2 Gy/min。以輻照后的PBS組作為模型(model control,MC)組。培養(yǎng)24 h后,棄去96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,并避光配制含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和10% CCK-8溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基,每孔避光加入110 μL,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1~4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度,并按公式(6)計(jì)算細(xì)胞存活率。

    式中:A0為CCK-8溶液吸光度;A1為未輻照陰性對(duì)照孔的吸光度;A2為樣品孔吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P<0.001表示差異高度顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 5 種食用菌水提物中總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

    為了探究5 種食用菌水提物的主要成分,對(duì)其總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定及對(duì)比,結(jié)果見表1。5 種食用菌水提物的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均超過50%以上,其中WECC和WEVV總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,分別為(84.87±7.31)%和(80.90±1.20)%,表明糖類組分在5 種食用菌水提物中的占比較大。WEGA和WEGF總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(2.50±0.05)%和(1.06±0.03)%,其余水提物的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低。為了探究水提物中多糖的含量,將5 種食用菌水提物經(jīng)醇沉得到的粗多糖進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,5 種食用菌水提物中WEGF的粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,其粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(61.28±2.95)%。值得注意的是,WEGA的總酚、總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于其余食用菌水提物,分別為(2.62±0.01)%和(3.03±0.02)%。以上研究結(jié)果初步顯示,5 種食用菌水提物均含有一定含量的活性成分,而糖類化合物是該5 種食用菌水提物的主要成分。已有報(bào)道表明,食用菌多糖具有抗氧化[19]、抗輻射[20]、降血糖[21]、降血脂[22]及增強(qiáng)免疫力[23]等多種生物活性。因而,有必要對(duì)這5 種食用菌水提物的生物活性進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

    表1 5 種食用菌水提物中總糖、總蛋白、粗多糖、總酚及總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of total sugar,total proteins,crude polysaccharides,total phenols and total flavonoids in water extracts from five edible mushrooms

    2.2 食用菌水提物的體外抗氧化活性

    2.2.1 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

    ABTS陽(yáng)離子自由基是由ABTS與過硫酸鉀發(fā)生氧化反應(yīng)生成的,呈現(xiàn)藍(lán)綠色,并在734 nm波長(zhǎng)下有特征吸收峰。當(dāng)向ABTS陽(yáng)離子自由基中補(bǔ)充自由基清除劑后,藍(lán)綠色變淡,其吸光度也會(huì)隨著抗氧化劑的抗氧化能力的增加而降低。因而,ABTS陽(yáng)離子自由基清除率可以作為評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力的重要指標(biāo)[24]。如圖1所示,陽(yáng)性對(duì)照VC及5 種食用菌水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基均具有清除能力。在樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),WEGA、WEGF、WERV、WEVV、WECC對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率分別為(99.78±0.10)%、(71.43±0.67)%、(65.54±0.92)%、(40.47±0.44)%和(38.58±0.42)%,其中WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最強(qiáng)。據(jù)Shi Min等[25]從豆腐渣發(fā)酵的靈芝中提取4 種多糖,靈芝多糖組分4(Ganoderma lucidumpolysaccharide-IV,GLP-IV)對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除活性最高,其質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)清除率為98.68%。與GLP-IV相比,質(zhì)量濃度1 mg/mL的WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率高于質(zhì)量濃度5 mg/mL的GLP-IV,表現(xiàn)出較高的抗氧化活性。綜上所述,WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力較高。

    圖1 5 種食用菌水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig.1 2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)cation radical scavenging capacity of water extracts from fvie edible mushrooms

    2.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

    DPPH自由基乙醇溶液呈紫色,當(dāng)加入具有清除自由基能力的樣品時(shí),能夠使得DPPH自由基的孤對(duì)電子被配對(duì),原本紫色的DPPH自由基乙醇溶液顏色變淺,根據(jù)顏色變淺的程度可以判斷樣品抗氧化能力的大小[26]。如圖2所示,陽(yáng)性對(duì)照VC及5 種食用菌水提物的質(zhì)量濃度與DPPH自由基的清除能力呈正相關(guān)。在0.2~1.0 mg/mL食用菌水提物質(zhì)量濃度范圍內(nèi),WEGA的DPPH自由基清除率均高于其他4 種食用菌水提物,但低于陽(yáng)性對(duì)照VC的DPPH自由基清除率。在樣品質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),5 種食用菌水提物的DPPH自由基清除率分別為WEGA(88.36±0.30)%、WEGF(85.37±0.41)%、WERV(62.81±0.39)%、WEVV(59.69±0.63)%、WECC(54.85±0.23)%。其中WEGA對(duì)DPPH自由基清除率最高,且高于真空技術(shù)提取的香菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除率(低于50%)[27]??偟膩碚f,5 種食用菌水提物中WEGA對(duì)DPPH自由基的清除能力最好。

    圖2 5 種食用菌水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.2 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity of water extracts from five edible mushrooms

    2.2.3 羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

    在已知的自由基中,羥自由基的氧化能力比較強(qiáng),其氧化能力可以對(duì)幾乎所有的生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、糖類等造成氧化損傷,因而測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的清除能力具有十分重要的意義[28]。如圖3所示,當(dāng)VC質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時(shí),其羥自由基清除率為(68.92±5.89)%,高于5 種食用菌水提物的羥自由基的清除能力。5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除能力均呈現(xiàn)濃度依賴性增加。但與DPPH自由基清除能力相比,5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除作用較弱。在1~5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),WEGA的羥自由基清除活性高于其他食用菌。在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),WEGA羥自由基清除率達(dá)到最大,為(33.44±0.07)%,并高于從平菇子實(shí)體中分離出的兩種多糖組分PSPO-1a和PSPO-4a對(duì)羥自由基的清除能力,PSPO-1a和PSPO-4a的清除率均低于25%[29]。結(jié)果表明WEGA是一種潛在的羥自由基清除劑。

    圖3 5 種食用菌水提物對(duì)羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of water extracts from five edible mushrooms

    2.2.4 總還原力測(cè)定結(jié)果

    抗氧化劑是通過自身的還原作用清除自由基,表現(xiàn)為還原能力越強(qiáng),抗氧化能力越強(qiáng),因此可以通過還原能力的大小判斷其抗氧化水平的高低。如圖4所示,每種食用菌水提物的總還原能力均隨著樣品質(zhì)量濃度增加,呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)。在0.2~1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),WEGA的總還原能力高于其他食用菌水提物。5 種食用菌水提物總還原能力的大小依次為WEGA>W(wǎng)ERV>W(wǎng)EGF>W(wǎng)EVV>W(wǎng)ECC。結(jié)果表明WEGA比其他4 種食用菌水提物具有更強(qiáng)的總還原能力。

    圖4 5 種食用菌水提物的總還原力Fig.4 Total reducing power of water extracts from five edible mushrooms

    2.3 食用菌水提物的體外免疫活性分析結(jié)果

    巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中占有非常重要的地位,其體外增殖能力可以作為評(píng)價(jià)生物活性化合物免疫調(diào)節(jié)作用的指標(biāo)[30-31]。如圖5所示,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與陰性對(duì)照組相比,WECC和WEVV對(duì)巨噬細(xì)胞增殖具有較弱的促進(jìn)作用。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在40~200 μg/mL時(shí),WERV對(duì)巨噬細(xì)胞增殖有劑量依賴性抑制作用。WEGF在10~160 μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞的促增殖作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),這一結(jié)果與Ma Xiaolei等[32]報(bào)道的灰樹花多糖組分GFP-A對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性的趨勢(shì)一致。并且當(dāng)WEGF質(zhì)量濃度在80~200 μg/mL時(shí),WEGF與其他4 種食用菌水提物相比,對(duì)巨噬細(xì)胞增殖促進(jìn)能力最強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí),5 種食用菌水提物中WEGA對(duì)巨噬細(xì)胞增殖促進(jìn)能力最強(qiáng),并與陽(yáng)性對(duì)照作用相當(dāng)。綜上所述,WEGA具有較好的免疫調(diào)節(jié)活性。已有報(bào)道表明樹舌多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性[33],與本研究結(jié)果相一致。

    圖5 5 種食用菌水提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.5 Effects of water extracts from five edible mushrooms on RAW264.7 cell viability

    2.4 食用菌水提物的體外抗輻射活性

    電離輻射是能引起一切物質(zhì)電離的總稱[34]。電離輻射會(huì)對(duì)機(jī)體造成直接和間接的傷害,嚴(yán)重危害人類身體健康[35]。肝臟是生物體的重要代謝器官,電離輻射也會(huì)對(duì)肝臟造成損傷[17,36]。因此,60Co γ輻射氧化損傷的小鼠肝細(xì)胞AML-12可以作為評(píng)價(jià)生物活性化合物的輻射防護(hù)作用的細(xì)胞模型。

    如圖6A所示,5 種食用菌水提物均能促進(jìn)AML-12細(xì)胞的增殖,并對(duì)AML-12細(xì)胞無毒性作用。如圖6B所示,60Co γ輻射后,與陰性對(duì)照組相比,MC組AML-12細(xì)胞存活率極顯著下降(P<0.01)。WEGF在質(zhì)量濃度80~200 μg/mL時(shí),能夠改善AML-12細(xì)胞存活率的下降,但改善作用較弱。與MC組相比,WECC和WERV在質(zhì)量濃度10~200 μg/mL范圍內(nèi)均能改善輻射所致的肝細(xì)胞AML-12的損傷,但隨質(zhì)量濃度的增加WECC對(duì)AML-12細(xì)胞的輻射防護(hù)作用逐漸下降。在質(zhì)量濃度10~200 μg/mL范圍內(nèi),與其余4 種食用菌水提物相比,WEVV能夠明顯改善電離輻射導(dǎo)致的AML-12細(xì)胞存活率下降。WEGA在低質(zhì)量濃度(10~40 μg/mL)時(shí)對(duì)肝細(xì)胞AML-12細(xì)胞存活率下降表現(xiàn)出顯著的改善作用(P<0.05、P<0.01)。因而,WEGA、WEVV、WECC和WERV均可作為天然的輻射防護(hù)劑進(jìn)行開發(fā)利用。此外,課題組前期采用AML-12細(xì)胞進(jìn)行輻射防護(hù)作用研究時(shí),發(fā)現(xiàn)布拉氏酵母發(fā)酵的山藥多糖對(duì)60Co γ射線誘導(dǎo)的AML-12細(xì)胞損傷表現(xiàn)出較好的輻射防護(hù)作用[18]。而本研究水提物主要組分分析顯示,糖類是5 種食用菌水提物的主要成分,由此推測(cè)多糖可能是食用菌水提物發(fā)揮輻射防護(hù)作用的主要因素,值得進(jìn)一步探究。

    圖6 5 種食用菌水提物對(duì)AML-12細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of water extracts from five edible mushrooms on AML-12 cell viability

    3 討論

    近些年來,關(guān)于食用菌生物活性的研究備受科研工作者的關(guān)注,食用菌中的功能性成分已成為天然藥物資源開發(fā)的領(lǐng)域之一[37]。目前,關(guān)于食用菌生物活性方面的研究,主要是針對(duì)單種食用菌的生物活性進(jìn)行研究。本研究選用草菇、灰樹花、紅菇、雞腿菇、樹舌5 種食用菌水提物為研究對(duì)象,進(jìn)行主要成分分析及生物活性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 種食用菌水提物均具有一定的抗氧化活性、免疫活性和輻射防護(hù)作用,這可能與5 種食用菌水提物富含糖類化合物相關(guān)。WEGA的還原能力、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均高于WEVV、WEGF、WERV、WECC,特別是當(dāng)WEGA質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),WEGA對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率高達(dá)(99.78±0.10)%,表明其是天然抗氧化功能食品開發(fā)的良好原料來源。

    同時(shí),5 種食用菌水提物的體外免疫活性結(jié)果顯示,低質(zhì)量濃度(10 μg/mL)時(shí),WEGA對(duì)巨噬細(xì)胞的促增殖能力強(qiáng)于其他食用菌水提物;在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(10~160 μg/mL),WEGF對(duì)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴性的促增殖效果。此外,5 種食用菌水提物對(duì)60Co γ輻射下的肝細(xì)胞AML-12輻射防護(hù)結(jié)果顯示,WEVV的輻射防護(hù)作用較強(qiáng);WEGA的抗輻射活性結(jié)果與其體外免疫活性結(jié)果相似,在低質(zhì)量濃度(10~40 μg/mL)時(shí)明顯改善電離輻射導(dǎo)致的肝細(xì)胞AML-12的損傷。綜合比較,WEGA具有較好的抗氧化、免疫及抗輻射活性,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為WEGA相關(guān)功能產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。

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