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      超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物結(jié)構(gòu)特性的影響

      2023-03-09 13:55:18李海靜劉紅玉夏秀芳
      食品科學(xué) 2023年3期
      關(guān)鍵詞:蛋白酶解性腺海參

      李海靜,王 松,劉紅玉,夏秀芳,*

      (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.大莊園肉業(yè)集團(tuán)股份有限公司,黑龍江 綏化 151100)

      海參性腺作為海參的內(nèi)臟,是海參加工過程中的一種副產(chǎn)品。由于加工過程中利用率較低,海參性腺常常被丟棄,不僅會造成資源浪費(fèi),而且可能導(dǎo)致環(huán)境污染[1]。海參性腺中蛋白質(zhì)含量極高(約為55%),是優(yōu)質(zhì)的動物蛋白質(zhì)來源[2]。目前,酶解法因酶解后溶液中無有毒化學(xué)物質(zhì)殘留,是提取海參副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的主要方法[3]。但是傳統(tǒng)的酶解法存在酶解時間長、酶利用率低和底物轉(zhuǎn)化率低等缺點[4-5]。因此,研發(fā)新的加工方法對于提高酶解率至關(guān)重要。

      超聲波作為一種安全、環(huán)保、高效和無毒的新興物理加工技術(shù),已廣泛應(yīng)用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性[6-9]。超聲產(chǎn)生的空化、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會破壞蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和疏水相互作用等,使卷曲的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開[10-12]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)展開時,會暴露出新的酶解位點,增加底物與酶接觸的機(jī)會,從而促進(jìn)酶解,提高蛋白質(zhì)利用率[4,13]。此外,超聲預(yù)處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的展開促使連接蛋白之間的肽鍵更大程度地暴露于酶,增加了酶與肽鍵作用的可能性,進(jìn)而有利于酶分子與底物接觸并發(fā)揮作用[14]。

      本研究利用不同時間(0、5、15、25、35 min,200 W)超聲預(yù)處理海參性腺蛋白酶解物,探究其側(cè)鏈、二級和三級結(jié)構(gòu)、表面疏水性、粒徑和微觀結(jié)構(gòu)等的變化情況,確定出最佳的超聲預(yù)處理時間,以期為超聲技術(shù)在海參性腺蛋白開發(fā)利用方面提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      海參性腺 大連水產(chǎn)有限公司;中性蛋白酶(酶活力81 000 U/g) 北京索萊寶科技有限公司。

      磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS) 美國Sigma公司;所用試劑均為分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;721型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司;MS3000激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 樣品制備

      將海參性腺凍干并研磨成粉末,過60 目篩。取100 g粉末添加400 mL正己烷和50 mL乙醇(8∶1,V/V),攪拌1 h。4 ℃、8 000×g離心10 min,獲得沉淀后,按上述方法重復(fù)操作兩次。將脫脂后的海參性腺粉在室溫下自然風(fēng)干,置于-20 ℃貯存。

      1.3.2 超聲預(yù)處理

      用蒸餾水將脫脂海參性腺粉(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為42.86%)配制成一定質(zhì)量濃度(1 g/100 mL)的蛋白溶液并置于雙層燒杯中。對溶液進(jìn)行超聲處理,處理參數(shù):頻率20 kHz;功率200 W[13];時間0、5、15、25、35 min;間歇模式:超聲2 s和間歇2 s(防止局部過熱。根據(jù)預(yù)實驗所測水解度得到:未超聲組水解度為7.98%,超聲1 s和間歇3 s組水解度為8.15%,超聲2 s和間歇2 s組水解度為10.11%,超聲3 s和間歇1 s組水解度為9.06%)。超聲處理后,蛋白溶液置于4 ℃保存待進(jìn)一步處理。

      1.3.3 酶解處理

      參照Li Haijing等[15]的方法進(jìn)行酶解處理。用1 mol/L NaOH溶液將超聲預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0,添加中性蛋白酶(添加量為4 500 U/g)后在50 ℃下進(jìn)行酶解。酶解終止時,將混合物在100 ℃下煮沸10 min致中性蛋白酶失活。酶解液冷卻至室溫后,于10 000×g下離心30 min。通過雙縮脲法測定上清液的蛋白質(zhì)量濃度約為10~12 mg/mL。將上清液凍干成粉末,并在-20 ℃下貯存作進(jìn)一步分析。

      1.3.4 側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的測定

      根據(jù)Li Haijing等[15]的方法測定海參性腺蛋白酶解物的紫外-可見光譜,用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)將1.3.3節(jié)凍干的粉末配制成0.2 mg/mL的溶液。用紫外-可見分光光度計將樣品溶液在240~360 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。并以磷酸鹽緩沖液為對照。

      1.3.5 二級結(jié)構(gòu)的測定

      根據(jù)Li Wenwen等[16]的方法使用傅里葉變換紅外光譜測定海參性腺蛋白酶解物的二級結(jié)構(gòu),并使用Peak Fit Version 4.12軟件對二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,根據(jù)酰胺I帶(1 700~1 600 cm-1)各指定峰的相對面積計算海參性腺蛋白酶解物二級結(jié)構(gòu)相對含量。

      1.3.6 三級結(jié)構(gòu)的測定

      參考張熙[17]的方法并略作修改,使用熒光分光光度計測定海參性腺蛋白的三級結(jié)構(gòu)。將凍干樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中制備1.0 mg/mL樣品溶液,并在25 ℃條件下進(jìn)行測定。測定條件:激發(fā)波長290 nm、狹縫寬度5 nm、發(fā)射波長310~400 nm。

      1.3.7 表面疏水性的測定

      根據(jù)Li Fangfei等[18]的方法測定海參性腺蛋白酶解物的表面疏水性,并略作修改。用磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.0)將海參性腺蛋白酶解物溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。然后,將20 μL ANS(8.0 mmol/L)溶液添加到4 mL海參性腺蛋白溶液中,避光反應(yīng)10 min。在激發(fā)和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm的條件下測定。

      1.3.8 粒徑分布的測定

      參照Li Fangfei等[19]的方法測定酶解物的粒徑分布。將海參性腺蛋白酶解物用蒸餾水配制成1.0 mg/mL蛋白溶液,在室溫條件下用激光粒度儀測定樣品的粒徑分布。

      1.3.9 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

      參照Li Haijing等[15]的方法觀察海參性腺蛋白酶解物的微觀結(jié)構(gòu)。凍干的海參性腺蛋白酶解物涂在雙面導(dǎo)電膠上并在原料涂層上噴金約10 min,用掃描電子顯微鏡在5 000 倍的放大倍數(shù)下觀察其形態(tài)。

      1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

      每個實驗重復(fù)3 次,每次3 個平行。所得數(shù)據(jù)使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件的Duncan檢驗進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05表示差異顯著性。用Origin 2019軟件作圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的影響

      蛋白質(zhì)殘基側(cè)鏈基團(tuán)(如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等)對紫外光有很強(qiáng)的吸收作用,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收峰分別在279、275 nm和257 nm波長處[20]。海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的變化可以通過苯丙氨酸在257 nm波長處的紫外-可見光譜反映。如圖1所示,隨著超聲預(yù)處理時間的延長(0~15 min),蛋白質(zhì)的紫外吸光度明顯增加,當(dāng)超聲時間為15 min時,蛋白質(zhì)的紫外吸光度增加了7.30%。這可能是因為超聲時間的延長產(chǎn)生了更強(qiáng)的空化作用,破壞了蛋白質(zhì)分子間的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開和重排,暴露出更多的芳香氨基酸,從而使紫外吸收強(qiáng)度增加[21]。當(dāng)超聲時間從15 min延長到35 min時,蛋白質(zhì)的紫外吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢,Huang Liuru等[22]也發(fā)現(xiàn)超聲處理20 min和30 min后大豆分離蛋白的紫外吸收強(qiáng)度低于超聲10 min后的紫外吸收強(qiáng)度,這可能是因為超聲時間的延長導(dǎo)致一些疏水基團(tuán)的嵌入或形成更大的聚集體,引起蛋白質(zhì)表面發(fā)色基團(tuán)數(shù)量減少,導(dǎo)致紫外吸光度下降。因此,適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理時間(15 min)有利于海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的展開。

      圖1 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of ultrasound pretreatment on the UV spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      2.2 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物二級結(jié)構(gòu)的影響

      傅里葉變換紅外光譜通過基線校正、反卷積、二階導(dǎo)數(shù)和吸光度曲線擬合來分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化[23],其中,酰胺I 帶(1 600~1 700 cm-1)能夠反映α-螺旋(1 648~1 664 cm-1)、β-折疊(1 615~1 637 cm-1和1 682~1 700 cm-1)、β-轉(zhuǎn)角(1 664~1 681 cm-1)和無規(guī)卷曲(1 637~1 648 cm-1)的含量[24-25]。不同超聲預(yù)處理時間對海參性腺蛋白酶解物二級結(jié)構(gòu)及相對含量的影響如圖2所示,隨著超聲預(yù)處理時間的延長,α-螺旋相對含量先降低后升高,在15 min時達(dá)到最小值(降低了9.98%),β-折疊相對含量的變化呈現(xiàn)相反的趨勢,在15 min時增加了50.72%。α-螺旋是蛋白質(zhì)較常見的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),其主要是通過分子內(nèi)氫鍵來維持蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列。超聲波空化作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,暴露了疏水區(qū)域,使分子內(nèi)氫鍵發(fā)生斷裂而減少,從而引起α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少[15]。β-折疊結(jié)構(gòu)含量的增加可能是因為超聲預(yù)處理破壞了維持海參性腺蛋白高級結(jié)構(gòu)的次級鍵(如氫鍵、靜電相互作用和范德華力等),從而引起蛋白結(jié)構(gòu)的展開[26]。然而,過長時間的超聲預(yù)處理會中斷分子間的相互作用,引起蛋白質(zhì)分子聚集,從而使α-螺旋相對含量的升高和β-折疊相對含量的降低[27]。王喜波等[25]指出β-折疊含量還與蛋白質(zhì)的疏水相互作用有關(guān),其降低表明蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露,疏水性增強(qiáng)。

      圖2 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物二級結(jié)構(gòu)紅外光譜(A)和相對含量(B)的影響Fig.2 Effect of ultrasound pretreatment on the infrared spectrum (A)and secondary structure composition (B) of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      超聲預(yù)處理顯著降低了海參性腺蛋白酶解物無規(guī)卷曲相對含量(P<0.05),而對β-轉(zhuǎn)角相對含量影響不顯著(P>0.05)。這一結(jié)果與戴澤川等[28]的結(jié)論一致,其同樣發(fā)現(xiàn)隨著超聲時間的延長,蝦肌肉蛋白的無規(guī)卷曲比例減小。超聲波可以使無規(guī)卷曲的聚集結(jié)構(gòu)發(fā)生解離,引起其含量下降,從而轉(zhuǎn)化為β-折疊(0~15 min)或α-螺旋(15~35 min)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致后兩者含量升高[29]。

      2.3 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物三級結(jié)構(gòu)的影響

      蛋白的內(nèi)源熒光光譜可以表征蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的數(shù)量,直觀反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化情況[30]。如圖3所示,在340 nm波長處附近觀察到所有樣品有一個熒光發(fā)射峰,不同超聲預(yù)處理時間的海參性腺蛋白酶解物熒光發(fā)射峰位置變化不明顯,但熒光強(qiáng)度有明顯變化。樣品的熒光強(qiáng)度隨超聲預(yù)處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在15 min時有最大熒光強(qiáng)度(比0 min時增加了4.50%)。熒光強(qiáng)度的升高可能是超聲預(yù)處理使蛋白質(zhì)發(fā)生伸展,暴露了埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸殘基,引起蛋白質(zhì)表面的色氨酸殘基含量增加,從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度[20]。Zou Ye等[31]也認(rèn)為超聲預(yù)處理(20 kHz、100 W、10 min)可以使雞肝水溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,破壞蛋白質(zhì)分子的疏水鍵,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)更多疏水基團(tuán)暴露,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加。隨著超聲時間的繼續(xù)延長,熒光強(qiáng)度明顯下降,這可能是過長時間的超聲處理會使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)、聚集,已經(jīng)暴露的色氨酸基團(tuán)重新內(nèi)包于蛋白質(zhì)內(nèi)部,引起蛋白質(zhì)空間位阻增加,導(dǎo)致熒光猝滅[17]。

      圖3 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物熒光光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasound pretreatment on the fluorescence spectrum of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      2.4 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響

      表面疏水性可以表征蛋白分子表面暴露疏水基團(tuán)的數(shù)量,是評價蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的重要參數(shù)[32]。超聲預(yù)處理時間對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響如圖4所示,隨超聲預(yù)處理時間的延長(0~15 min),蛋白表面疏水性呈升高的趨勢,當(dāng)超聲時間為15 min時,蛋白質(zhì)的表面疏水性比0 min時增加了13.42%。Jiang Lianzhou等[27]利用超聲(頻率20 kHz、功率300 W、超聲4 s間歇2 s)處理黑豆分離蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑豆分離蛋白表面疏水性隨超聲處理時間的延長(12~24 min)而升高。這可能是超聲空化效應(yīng)能夠使蛋白氫鍵和分子間作用力斷裂,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,導(dǎo)致分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和區(qū)域暴露于周圍的極性環(huán)境,使得熒光探針更容易與之結(jié)合,從而引起表面疏水性升高[15]。隨著超聲預(yù)處理時間的繼續(xù)延長(15~35 min),表面疏水性開始降低。這可能是蛋白質(zhì)在疏水作用的驅(qū)動下相互靠近并發(fā)生了聚集,導(dǎo)致暴露的疏水基團(tuán)重新被包埋在蛋白內(nèi)部[32]。此外,王笑宇等[33]認(rèn)為超聲波的作用不足以破壞蛋白質(zhì)分子核心的疏水作用,過度超聲(500 W、15 min)可能會使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加疏松,導(dǎo)致一些親水肽鏈上的基團(tuán)更容易發(fā)生水合作用,使得表面疏水性降低。

      圖4 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物表面疏水性的影響Fig.4 Effect of ultrasound pretreatment on the surface hydrophobicity of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      2.5 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物粒徑的影響

      d0.1、d0.5和d0.9分別表示粒徑累積分布(0~100%)中10%、50%和90%所對應(yīng)的粒徑。d3,2為粒徑對表面積加權(quán)平均值(表面積平均粒徑),d4,3為粒徑對體積加權(quán)平均值(體積平均粒徑),可以用來反映粒徑的變化[34]。粒徑分布和平均粒徑可以反映出蛋白因結(jié)構(gòu)改變發(fā)生的聚集行為[18]。超聲預(yù)處理時間對海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響如圖5和表1所示,隨超聲預(yù)處理時間的延長,海參性腺蛋白酶解物的體積平均粒徑(d4,3)和表面平均粒徑(d3,2)均先減小后增大,其中超聲預(yù)處理時間為15 min時兩者達(dá)到最?。?6.2 nm和34.3 nm),顯著低于對照組(P<0.05)。粒徑分布范圍也呈現(xiàn)類似的趨勢。超聲處理使蛋白粒徑減小歸因于超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的微射流和高剪切應(yīng)力破壞了蛋白質(zhì)分子間的相互作用,使蛋白質(zhì)分解成更小的碎片[15]。田然等[35]認(rèn)為,超聲空化和聲流的綜合效應(yīng)還可以增加蛋白質(zhì)顆粒的碰撞速度和強(qiáng)度,促使大的蛋白聚集體被裂解成更小的碎片,從而引起蛋白質(zhì)粒徑減小。d0.1、d0.5和d0.9的變化趨勢與d4,3和d3,2的變化趨勢相似,表明適當(dāng)時間的超聲預(yù)處理(15 min)可以減小海參性腺蛋白酶解物的粒徑,防止蛋白質(zhì)聚集。這可能是因為適當(dāng)時間超聲預(yù)處理產(chǎn)生的機(jī)械剪切力使海參性腺蛋白分子被粉碎,導(dǎo)致粒徑變小,而過長時間的超聲作用會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子重新聚集。此外,齊寶坤等[36]指出,蛋白質(zhì)的表面疏水性與粒徑之間呈顯著負(fù)相關(guān),即蛋白質(zhì)粒徑越小,其表面疏水性越大,本實驗結(jié)果與其所得結(jié)論一致。當(dāng)超聲時間超過15 min時,海參性腺蛋白酶解物的粒徑隨超聲預(yù)處理時間的延長而增大,這可能是因為過長時間的超聲處理會產(chǎn)生較強(qiáng)的空化效應(yīng),生成過量自由基,從而加速蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動,使蛋白質(zhì)分子之間碰撞的機(jī)會增加,導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)分子聚集并形成較大的顆粒[37-38]。李笑笑[39]也認(rèn)為超聲處理使大豆分離蛋白粒徑增大是超聲處理促使部分蛋白質(zhì)分子相互聯(lián)接,并重新聚合所致。

      圖5 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物粒徑分布的影響Fig.5 Effect of ultrasound pretreatment on the particle size distribution of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      表1 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物平均粒徑的影響Table 1 Effect of ultrasound pretreatment on the average particle size of sea cucumber gonad protein hydrolysates

      2.6 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響

      超聲預(yù)處理時間對海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖6所示,未經(jīng)超聲處理的海參性腺蛋白酶解物顯示出許多不規(guī)則片段、小孔洞和大聚集體。隨著超聲預(yù)處理時間的延長(0~15 min),海參性腺蛋白酶解物組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了更多的細(xì)小孔洞,樣品質(zhì)地更加疏松,顆粒變小且均勻,這與粒徑分析結(jié)果一致。此現(xiàn)象表明超聲空化效應(yīng)產(chǎn)生的微射流和高剪切應(yīng)力能夠有效破壞蛋白質(zhì)緊密結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)變得疏松多孔,增強(qiáng)了酶與底物的相互作用,從而提高了酶解效率[40-41]。劉運(yùn)[42]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯蛋白經(jīng)過超聲預(yù)處理后,其顆粒變得細(xì)小,比表面積增大,從而使蛋白與酶有接觸位點數(shù)量增加,酶解效率得以提高。隨著超聲預(yù)處理時間的繼續(xù)延長(25~35 min),海參性腺蛋白酶解物出現(xiàn)了較多大的團(tuán)聚體,表明過長時間的超聲處理反而使蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集,這與熒光和表面疏水性分析結(jié)果一致。邸紅艷[43]的研究也表明超聲輔助提取核桃粕蛋白60 min后,原本比較分散的部分蛋白質(zhì)又重新聚集。

      圖6 超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物微觀結(jié)構(gòu)的影響(×5 000)Fig.6 Effect of ultrasound pretreatment on the microstructure of sea cucumber gonad protein hydrolysates (×5 000)

      3 討論

      海參性腺富含蛋白質(zhì)、多糖、精氨酸、賴氨酸等營養(yǎng)物質(zhì),但在海參的加工過程中,海參性腺通常作為下腳料被丟棄,造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[44]。大量研究表明蛋白酶可以促進(jìn)海參性腺的水解,從而獲得更容易被人體吸收的蛋白水解物[45-47]。然而,常規(guī)酶解法存在著時間長和效率低等問題[4],超聲波作為一種無損、綠色的新興加工技術(shù)可以有效提高酶解速率和酶利用率[48]。因此,本研究通過對海參性腺蛋白酶解物側(cè)鏈結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、表面疏水性、粒徑分布和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,探究超聲預(yù)處理對海參性腺蛋白酶解物結(jié)構(gòu)特性的影響,以期提高海參性腺蛋白的酶解效率。

      然而,超聲處理在改善蛋白結(jié)構(gòu)特性方面并不總是具有積極作用。本實驗結(jié)果表明:較長時間超聲預(yù)處理(25~35 min)的海參性腺酶解物紫外吸收強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度和表面疏水性均低于短時間超聲預(yù)處理(0~15 min)樣品,這可能是過度的超聲處理導(dǎo)致展開的蛋白質(zhì)變性,再次發(fā)生折疊或聚集,一些疏水基團(tuán)被包埋于蛋白內(nèi)部[49]。黃朝湯[50]得到了與本研究不同的結(jié)果,即經(jīng)短時間超聲預(yù)處理(0~20 min)的小麥蛋白水解物紫外吸光度和熒光強(qiáng)度均低于長時間超聲預(yù)處理(40~80 min)樣品,推測可能是較短時間的超聲處理產(chǎn)生較低強(qiáng)度的空化效應(yīng),不足以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,一些疏水基團(tuán)仍包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部[51]。因此,針對不同的實驗原料及研究對象,應(yīng)確定適宜的超聲預(yù)處理參數(shù)。

      4 結(jié)論

      不同時間的超聲預(yù)處理能不同程度地改變海參性腺蛋白酶解物的結(jié)構(gòu),隨著超聲預(yù)處理時間的延長,海參性腺蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)先展開后發(fā)生聚集。其中,15 min超聲預(yù)處理能最大程度地促進(jìn)海參性腺蛋白結(jié)構(gòu)的展開,暴露出更多的酶解位點和疏水基團(tuán)。經(jīng)超聲預(yù)處理15 min的蛋白顆粒最小。因此,適當(dāng)?shù)某暡A(yù)處理(15 min)能夠促進(jìn)海參性腺蛋白酶解物結(jié)構(gòu)的展開和提高酶解作用,減少聚集體的形成,從而提高海參性腺的利用價值。本研究可為超聲波在海參及其副產(chǎn)品中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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