葡萄柚籽提取物及其納米乳對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生物菌膜的抑制作用

王思亓，梁曉云，張 晨，張文棟，程 宇，宓曉雨，趙王晨，王龍鳳，江 蕓*

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210023）

近年來食源性腐敗菌和致病菌生物菌膜引起的食品安全問題受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。生物菌膜是指附著于各種物質(zhì)表面被細(xì)菌自產(chǎn)的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）包裹的有一定三維結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)菌群體[1-2]。據(jù)報(bào)道，生物菌膜中細(xì)菌對(duì)抗生素和化學(xué)試劑的抗性比浮游細(xì)菌高10～1 000 倍[3]。因此，食品加工環(huán)境中的生物菌膜已成為細(xì)菌交叉污染的重要來源，可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[4]。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是主要的食源性有害菌，因這兩種菌污染而引發(fā)的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[5-6]。大多數(shù)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株都有形成生物菌膜的能力[7]。

近年來，控制生物菌膜已成為研究熱點(diǎn)[8-10]。其中，植物源天然抗菌物質(zhì)在抑制食源性有害菌生長(zhǎng)增殖、有效延長(zhǎng)食品貨架期方面已有大量報(bào)道。精油是從植物不同部位提取的復(fù)雜混合物，大部分具有廣譜抑菌作用[11-12]。然而，由于水溶性和生物利用度低、化學(xué)穩(wěn)定性差、揮發(fā)性高等問題，精油及其成分的實(shí)際應(yīng)用受到較大限制[13]。為了保持其生物活性，減少其對(duì)食品感官特性的影響，將精油制備成納米乳液是一種可行的方式[14-15]。目前，精油納米乳抑菌方面的研究報(bào)道越來越多。葡萄柚籽提取物（grapefruit seed extract，GSE）已被證實(shí)具有較好的廣譜抗菌活性[16]，其抗菌活性主要來源于多酚類黃酮，如柚皮苷、檸檬苦素、槲皮素、山柰酚、橙皮苷及其他化合物[17-18]。GSE已被成功開發(fā)成多種形式的商品進(jìn)入國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)。本課題組前期以美國(guó)GSE濃縮口服液NutriBiotic產(chǎn)品為研究對(duì)象，制備成葡萄柚籽提取物納米乳（grapefruit seed extract nanoemulsion，GNE），有效提高了GSE抗菌活性[19]，而關(guān)于GNE對(duì)食源性有害菌生物菌膜抑制方面的研究尚鮮見報(bào)道。

本研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)細(xì)菌，比較GSE和GNE對(duì)兩種菌生物菌膜形成的抑制效應(yīng)，包括分析生物菌膜中黏附菌數(shù)變化、EPS含量變化，利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microcopy，SEM）和共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察生物菌膜微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。進(jìn)一步比較GSE和GNE對(duì)兩種菌單種菌膜和混合菌膜的清除效果。從而為食源性有害菌生物菌膜的有效控制提供理論參考，為GSE在市場(chǎng)的推廣應(yīng)用提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室前期從某企業(yè)豬肉屠宰線分離所得；金黃色葡萄球菌ATCC 25923（以下簡(jiǎn)稱金葡菌）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、酵母提取物（yeast extract，YE）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、麥康凱瓊脂、Baird-Parker瓊脂 北京陸橋技術(shù)有限公司；LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kits（L7012） 美國(guó)Molecular Probes公司；GSE（有效成分33%） 美國(guó)NutriBiotic公司；磷酸鹽緩沖液 南京峰昌生物科技有限公司；氯化鈉、乙醇 南京化學(xué)試劑有限公司；總蛋白定量檢測(cè)試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

M2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；SZX超凈工作臺(tái) 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國(guó)Baker公司；拍打式均質(zhì)器 青島眾瑞智能儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；QL-200微型漩渦混合儀海門其林貝爾儀器有限公司；SU8020 SEM 日本Hitachi公司；LSM880 CLSM 德國(guó)Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制備

將－80 ℃凍存的大腸桿菌和金葡菌經(jīng)TSA-YE平板劃線，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化，2 次活化后的菌液濃度達(dá)到9（lg（CFU/mL））左右，菌落總數(shù)經(jīng)TSA培養(yǎng)計(jì)數(shù)驗(yàn)證。

1.3.2 GNE的制備

GNE的制備參照Guo Mingming等[20]的方法稍作修改。將6.0%（以體系總質(zhì)量計(jì)，下同）GSE、2.2%中鏈甘油三酯、0.8%吐溫80和91.0%去離子水混合后用磁力攪拌器攪拌30 min以獲得粗乳液。然后將GSE粗乳液用均質(zhì)機(jī)以5 000 r/min高速均質(zhì)4 min。隨后，使用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)粗乳液超聲處理（200 W、15 min）以獲得穩(wěn)定均勻、GSE終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.98%的納米乳液。

1.3.3 GSE和GNE對(duì)兩菌生物菌膜的干預(yù)實(shí)驗(yàn)

前期實(shí)驗(yàn)得出GNE對(duì)大腸桿菌和金葡菌的最小抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為1.2%、0.6%[19]，本實(shí)驗(yàn)選用GNE濃度為1/2 MIC進(jìn)行抑制菌膜形成實(shí)驗(yàn)。用TSB將GSE和GNE母液分別稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%、0.3%的工作液，作為大腸桿菌和金葡菌生物菌膜形成的培養(yǎng)液，同時(shí)以正常TSB作為對(duì)照組。吸取1.3.1節(jié)的菌液，加入載有不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm）和130 mL上述3 種培養(yǎng)液的玻璃盒中，菌液濃度約為6（lg（CFU/mL））。于37 ℃分別靜置培養(yǎng)24、48、72、120 h，規(guī)定時(shí)間取出鋼片，用無菌生理鹽水漂洗3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體，分別進(jìn)行以下指標(biāo)分析。

1.3.3.1 生物菌膜中黏附菌數(shù)的測(cè)定

將載有生物菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，采用拍擊-沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體[21]，在8 擊/s條件下拍擊60 s，吸取均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布至TSA-YE平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 生物菌膜EPS中蛋白質(zhì)和多糖含量分析

菌膜分別培養(yǎng)24、72 h，取出鋼片漂洗后用棉球擦拭法采集生物菌膜[22]。將擦拭的棉球置于裝有10 mL無菌生理鹽水和一定量玻璃珠的離心管中，渦旋3 min，使棉球上的菌體充分脫落，去除棉球，然后將菌懸液離心（5 000×g、4 ℃、10 min）。獲得的上清液即為EPS樣本。用總蛋白定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。在562 nm波長(zhǎng)處蛋白質(zhì)含量與溶液吸光度成正比，采用酶標(biāo)儀測(cè)定A562nm，得到蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝0.000 8x＋0.159（R2＝0.997 6），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算上清液中的胞外蛋白質(zhì)含量[23]。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖含量。將各組的EPS樣本取2 mL至10 mL離心管中，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)6%苯酚溶液，混勻后逐滴加入5 mL體積分?jǐn)?shù)95%硫酸溶液。將反應(yīng)液置于室溫冷卻，避光孵育。孵育完成后在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值。采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝16.669x＋0.178 4（R2＝0.998），最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得出EPS中多糖的含量[23]。

1.3.3.3 生物菌膜SEM觀察

按照1.3.3節(jié)的方法在3 種培養(yǎng)液中制備生物菌膜，其中不銹鋼片為10 mm×10 mm×1 mm。分別在24、72 h時(shí)取出不銹鋼片，生理鹽水漂洗后將黏附生物菌膜的鋼片放入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定過夜，隨后加入體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液固定2 h，最后用滅菌水沖洗3 次。將固定好的樣品用乙醇梯度脫水15 min并干燥，用于SEM觀察。

1.3.3.4 生物菌膜CLSM觀察

按照1.3.3節(jié)的方法制備生物菌膜，在24、72 h取出不銹鋼片，漂洗后吸取LIVE/DEAD?熒光染液對(duì)不銹鋼片表面進(jìn)行染色，室溫避光條件下充分作用15 min后，用無菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以除去多余熒光染料，室溫避光條件下放置自然干燥，使用CLSM（10×）觀察染色后的生物菌膜結(jié)構(gòu)。LIVE/DEAD?為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）復(fù)配的熒光染料，SYTO-9與PI能分別使活、死細(xì)胞在CLSM下呈現(xiàn)綠色、紅色熒光，其中SYTO 9激發(fā)波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)分別為480 nm和500 nm，PI激發(fā)波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)分別為490 nm和635 nm。三維投影使用ZEN Blue Lite 2_3軟件的z-stacks簡(jiǎn)易3D功能重建。

1.3.4 GSE和GNE對(duì)單種菌膜和混合菌膜的清除實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 選擇性培養(yǎng)計(jì)數(shù)平板的確定

為了對(duì)混合菌膜中大腸桿菌和金葡菌分別計(jì)數(shù)，首先需要確定合適的選擇性平板。將1.3.1節(jié)大腸桿菌和金葡菌的培養(yǎng)菌液進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的稀釋度分別涂布在麥康凱瓊脂平板和Baird-Parker瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.4.2 大腸桿菌和金葡菌單種菌膜和混合菌膜的制備

將1.3.1節(jié)大腸桿菌和金葡菌的培養(yǎng)菌液?jiǎn)为?dú)或同時(shí)接種至裝有不銹鋼片（75 mm×25 mm×1 mm）和TSB的玻璃盒中，其中兩種菌濃度均為6（lg（CFU/mL）），37 ℃靜置培養(yǎng)72 h，取出鋼片，漂洗后用1.3.4.1節(jié)確定的選擇性平板37 ℃培養(yǎng)24 h，對(duì)兩種菌分別進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.3.4.3 GSE和GNE處理單種菌膜和混合菌膜

將1.3.4.2節(jié)得到的載有菌膜的不銹鋼片，漂洗后分別放入由生理鹽水配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%和1.8%的GSE、GNE溶液中37 ℃處理24 h，以生理鹽水37 ℃處理24 h為對(duì)照。處理結(jié)束后取出不銹鋼片，漂洗后按照1.3.3.1節(jié)方法進(jìn)行均質(zhì)，吸取均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋，采用1.3.4.1節(jié)確定的選擇性平板分別對(duì)菌膜中大腸桿菌和金葡菌黏附菌數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)24 h。按下式進(jìn)一步計(jì)算清除率。

式中：A為GSE、GNE 處理組生物菌膜中黏附菌數(shù)/（CFU/mL）；B為生理鹽水對(duì)照組生物菌膜中黏附菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2021b軟件繪圖。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s單因素方差分析進(jìn)行多重比較，采用T檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間顯著性比較（以P＜0.05表示差異顯著）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSE和GNE對(duì)兩菌生物菌膜形成時(shí)黏附菌數(shù)的影響

GSE和GNE處理后大腸桿菌和金葡菌生物菌膜中黏附菌數(shù)的變化情況如圖1所示。大腸桿菌和金葡菌經(jīng)37 ℃、24 h培養(yǎng)后，對(duì)照組生長(zhǎng)到7～8（lg（CFU/cm2））。經(jīng)0.6%的GSE、GNE處理后，大腸桿菌生物菌膜中黏附菌數(shù)對(duì)數(shù)值比對(duì)照組減少1～2（lg（CFU/cm2）），且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GNE 的抑制活性強(qiáng)于GSE，120 h時(shí)大腸桿菌黏附菌數(shù)對(duì)數(shù)值比GSE組少0.9（lg（CFU/cm2））。GSE和GNE對(duì)金葡菌生物菌膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，隨著GSE和GNE作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抗金葡菌生物菌膜作用明顯增強(qiáng)，且相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GNE抑制效果亦強(qiáng)于GSE，120 h時(shí)金葡菌黏附菌數(shù)對(duì)數(shù)值比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））。結(jié)果表明，GSE和GNE在1/2 MIC下能有效抑制兩菌生物菌膜的形成，且對(duì)金葡菌的抑制作用更強(qiáng)。

圖1 生物菌膜形成過程中黏附菌數(shù)變化Fig.1 Changes in the number of adherent cells during biofilm formation

2.2 生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)和多糖含量的變化

GSE和GNE處理下大腸桿菌和金葡菌生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量變化如圖2、3所示。24 h時(shí)，3 個(gè)處理組之間大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量均無顯著性差異，表明菌膜形成24 h時(shí)GSE、GNE對(duì)大腸桿菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖產(chǎn)生的影響無顯著差異；而24 h時(shí)3 個(gè)處理之間金葡菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖含量存在顯著差異（P＜0.05），表明菌膜形成24 h時(shí)GSE、GNE顯著抑制了金葡菌胞外蛋白質(zhì)、胞外多糖的產(chǎn)生，且GNE抑制效果顯著強(qiáng)于GSE。72 h時(shí)，3 個(gè)處理之間兩種菌蛋白質(zhì)、胞外多糖含量均存在顯著差異（P＜0.05），表明菌膜形成72 h時(shí)GSE、GNE顯著抑制了大腸桿菌和金葡菌胞外蛋白質(zhì)和多糖的產(chǎn)生，且GNE抑制效果顯著強(qiáng)于GSE。GSE、GNE處理組菌膜形成72 h時(shí)胞外蛋白質(zhì)和多糖含量顯著高于24 h時(shí)（P＜0.05）。

圖2 生物菌膜中胞外蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Changes in the amount of extracellular proteins in biofilm

圖3 生物菌膜中胞外多糖含量變化Fig.3 Changes in the amount of extracellular polysaccharides in biofilm

2.3 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜SEM觀察結(jié)果

采用SEM 觀察大腸桿菌和金葡菌在TSB、1/2 MIC GSE和GNE分別培養(yǎng)24 h和72 h時(shí)生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)，如圖4A所示，大腸桿菌于TSB培養(yǎng)24 h時(shí)形成三維結(jié)構(gòu)，堆疊產(chǎn)生了較為疏松的生物菌膜，在菌體外有少量黏液產(chǎn)生；培養(yǎng)72 h時(shí)形成致密的三維結(jié)構(gòu)，菌體周圍有較厚的黏液層包裹。72 h時(shí)GSE組和GNE組菌體的團(tuán)聚及黏液分泌情況要多于24 h時(shí)，但均明顯少于TSB對(duì)照組，表明GSE和GNE抑制了大腸桿菌生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的形成及EPS的產(chǎn)生，且GNE抑制作用強(qiáng)于GSE。由圖4B可知，與大腸桿菌類似，GSE和GNE也抑制了金葡菌生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的形成及EPS的產(chǎn)生。SEM觀察結(jié)果與2.1節(jié)黏附菌菌數(shù)變化結(jié)果趨勢(shì)一致，且印證了2.2節(jié)GSE和GNE對(duì)EPS的抑制作用。

圖4 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜SEM圖（×5 000）Fig.4 SEM images of bioflims formed by E.coli and S.aureus (×5 000)

2.4 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜CLSM觀察結(jié)果

采用CLSM 觀察大腸桿菌和金葡菌在TSB、1/2 MIC GSE和1/2 MIC GNE條件下培養(yǎng)24 h和72 h時(shí)生物菌膜中活/死菌的分布情況。如圖5所示，大腸桿菌培養(yǎng)24 h時(shí)，對(duì)照組中大量菌體黏附于鋼片表面，有少量小的細(xì)菌“團(tuán)狀物”出現(xiàn)，而GSE和GNE組鋼片表面黏附菌體少于對(duì)照組，并且有較多紅色死菌分布其中。培養(yǎng)72 h時(shí)，3 組菌膜厚度與24 h相比均有所增加，對(duì)照組中黏附菌體更多，并形成了聚集的立體結(jié)構(gòu)；GSE和GNE組紅色死菌更多。金葡菌與大腸桿菌類似，對(duì)照組菌體的聚集方式由小型團(tuán)狀物變?yōu)橹旅艿牧Ⅲw結(jié)構(gòu)。從24 h到72 h，GSE和GNE組的菌膜厚度有所增加，但相比于對(duì)照組，菌膜結(jié)構(gòu)中疏松紅色區(qū)域明顯增加，這表明GSE和GNE都具有抑制生物菌膜形成的能力。

圖5 大腸桿菌和金葡菌生物菌膜CLSM圖（×10）Fig.5 CLSM images of biofilms formed by E.coli and S.aureus (×10)

2.5 大腸桿菌和金葡菌混合菌膜形成情況

為了對(duì)混合菌膜中兩種菌分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，首先確定了兩種菌的選擇性計(jì)數(shù)平板。如圖6所示，大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，而在Baird-Parker瓊脂平板上不生長(zhǎng)，金葡菌則相反，表明可以采用麥康凱瓊脂平板、Baird-Parker平板分別作為混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的計(jì)數(shù)平板。

圖6 大腸桿菌和金葡菌混合培養(yǎng)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的確定Fig.6 Determination of media for enumeration of mixed culture of E.coli and S.aureus

大腸桿菌和金葡菌在TSB中37 ℃、72 h單種菌膜和混合菌膜形成情況見圖7。大腸桿菌與金葡菌混合成膜時(shí)，混合菌膜中大腸桿菌與其單種菌膜形成量沒有顯著性差異，而混合菌膜中金葡菌的菌膜量顯著少于其單種菌膜形成量（P＜0.05）。

圖7 大腸桿菌和金葡菌混合菌膜形成72 h時(shí)黏附菌數(shù)Fig.7 Number of adherent cells in mixed biofilms formed by E.coli and S.aureus at 72 h

2.6 GSE和GNE對(duì)兩菌單種菌膜和混合菌膜清除作用

將大腸桿菌和金葡菌培養(yǎng)72 h的單種菌膜和混合菌膜分別于生理鹽水、GSE、GNE中處理24 h，結(jié)果如圖8所示。大腸桿菌單種菌膜能夠被GSE、GNE顯著清除，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%時(shí)GSE、GNE清除作用無顯著差異，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%時(shí)GNE清除作用顯著強(qiáng)于GSE（P＜0.05），清除率增加27.2%。金葡菌單種菌膜亦能被GSE、GNE顯著清除，且質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高清除作用越強(qiáng)，兩種質(zhì)量分?jǐn)?shù)下GNE清除作用均顯著強(qiáng)于GSE（P＜0.05），質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%時(shí)GNE比GSE清除率高7.7%。相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的GSE、GNE對(duì)金葡菌的清除作用強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的清除作用?；旌暇ぶ写竽c桿菌和金葡菌也能被GSE、GNE顯著清除，其中混合菌膜中大腸桿菌在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.8%時(shí)GNE清除作用強(qiáng)于GSE，清除率增加13.2%，混合菌膜中金葡菌在1.2%、1.8%兩種質(zhì)量分?jǐn)?shù)下GNE清除作用均顯著強(qiáng)于GSE（P＜0.05），清除率分別增加9.7%、14.3%。通過清除率比較GSE、GNE對(duì)單種菌膜和混合菌膜的清除作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)混合菌膜中大腸桿菌和金葡菌的清除作用均弱于對(duì)單種菌膜的清除作用，1.8%的GNE 對(duì)混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的清除率分別比對(duì)兩菌單種菌膜清除率低14.9%和6.2%。結(jié)果表明混合菌膜中兩種菌對(duì)GSE、GNE抗性增強(qiáng)。

圖8 GSE和GNE對(duì)單種菌膜和混合菌膜清除作用Fig.8 Effects of GSE and GNE on eliminating single and mixedspecies biofilms

3 討論

精油是天然衍生的芳香化合物，大部分精油具有強(qiáng)烈的抗菌、抗病毒和抗真菌活性，其作為天然抗菌劑在食品保鮮應(yīng)用研究方面被廣泛報(bào)道[12,16,24]。關(guān)于精油抑制生物菌膜方面的報(bào)道也越來越多。研究發(fā)現(xiàn)，佛手精油可有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌生物菌膜形成[25]。地中海地區(qū)不同種類植物精油均可抑制銅綠假單胞菌生物菌膜的形成[26]。夾竹桃精油、薄荷和茴香精油均可抑制大腸桿菌生物菌膜的形成，抑制能力依次減弱[27]。薄荷精油、百里香酚、牛至精油等可有效抑制金葡菌生物菌膜的形成[28-30]。本研究發(fā)現(xiàn)GSE對(duì)大腸桿菌和金葡菌生物菌膜、EPS形成具有抑制作用，而且1/2 MIC對(duì)金葡菌生物菌膜形成抑制效果強(qiáng)于大腸桿菌，這可能是由于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的特征結(jié)構(gòu)，使其對(duì)親脂性分子更具抗性[31]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，GSE對(duì)兩種菌成熟菌膜具有較好清除效果。Song等[32]也發(fā)現(xiàn)GSE在抑制菌膜形成和已形成菌膜清除方面有積極效果。

但是，GSE存在水溶性低、生物活性低、有苦味等問題，使其實(shí)際應(yīng)用受到限制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，將GSE制備成GNE改善了其水溶性，制備成的GNE是O/W型乳液，納米尺寸的液滴比表面積大，提高了有效成分的生物活性；此外，GNE對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸滲漏加劇，相比于GSE表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌作用[19]。佛手柑精油納米乳對(duì)金葡菌的MIC為0.38%[33]，甜橙精油納米乳液對(duì)大腸桿菌的MIC介于7.7%～11.0%之間；對(duì)金葡菌的MIC約為11%[34]。本課題組制備的GNE對(duì)大腸桿菌和金葡菌的MIC分別為1.2%和0.6%，抑菌性能較強(qiáng)[19]。近年來，逐漸出現(xiàn)精油納米乳液抑制生物菌膜方面的報(bào)道。Moghimi等[35]關(guān)于百里香精油及其納米乳對(duì)耐多藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌膜的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳液處理24 h時(shí)抗菌膜效果比相應(yīng)精油高36%。Prakash等[36]研究發(fā)現(xiàn)檸檬草精油納米乳液抗鼠傷寒沙門氏菌生物菌膜活性比相應(yīng)精油高11.61%。本研究也得到類似結(jié)論，GNE可以有效抑制大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的形成，并且作用效果強(qiáng)于GSE，1/2 MIC GNE作用120 h時(shí)兩菌菌膜形成量對(duì)數(shù)值均比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））以上，1.8%的GNE對(duì)已形成的大腸桿菌和金葡菌菌膜清除率分別比GSE高7.7%～27.2%。本研究采用SEM和CLSM也觀察到了GSE和GNE對(duì)生物菌膜的抑制效果，與菌膜計(jì)數(shù)分析結(jié)果相印證。本研究還發(fā)現(xiàn)GSE和GNE減少了生物菌膜胞外蛋白質(zhì)和多糖含量，這與Amrutha等[37]關(guān)于香辛料油納米乳、Wang Renjie等[38]關(guān)于D-檸檬烯納米乳減少EPS產(chǎn)生的研究結(jié)論類似。

自然環(huán)境中絕大多數(shù)菌膜都是多菌種混合生物菌膜，混合生物菌膜中不同菌種之間可呈現(xiàn)協(xié)同、拮抗等不同相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌、銅綠假單胞菌等會(huì)促進(jìn)大腸桿菌的菌膜形成[39-40]。另一些研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌可抑制銅綠假單胞菌、成團(tuán)泛菌生物菌膜的形成，但對(duì)沙拉廠分離株的菌膜形成沒有影響[41]。本研究中，大腸桿菌與金葡菌混合成膜時(shí)，大腸桿菌未受影響，而大腸桿菌對(duì)金葡菌菌膜形成產(chǎn)生了抑制作用，這與Manoharadas[42]、Ohn[43]等的研究結(jié)論相似。多菌種混合成膜時(shí)發(fā)生的不同交互效應(yīng)可能與不同菌種、不同菌株、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基質(zhì)等多種因素有關(guān)。

目前，對(duì)精油和納米乳清除混合菌膜方面的報(bào)道尚有限[44]。本研究中，GSE和GNE對(duì)已經(jīng)形成的混合菌膜表現(xiàn)出良好的清除效果。但是，混合菌膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下GSE和GNE對(duì)其清除率均低于對(duì)單種菌膜。Zhang Hongfei等[45]采用低能X射線清除單核細(xì)胞增生李斯特菌與熒光假單胞菌的混合菌膜時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相比于單種菌膜，混合菌膜抗性更強(qiáng)。Reigada等[46]在用萬古霉素清除銅綠假單胞菌和金葡菌形成的混合生物菌膜時(shí)也發(fā)現(xiàn)混合生物菌膜比單種菌膜更難清除的現(xiàn)象。實(shí)際生產(chǎn)加工中，食品加工接觸表面形成的生物菌膜大多是由多種細(xì)菌組成的混合菌膜，因此需要更加關(guān)注混合菌膜抗性增強(qiáng)后的食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和控制。

GNE比化學(xué)消毒劑安全性高，比柚皮素、百里香酚等單一成分抗菌劑價(jià)格低廉，并且本實(shí)驗(yàn)證實(shí)GNE具有較高的生物活性、較強(qiáng)的菌膜抑制能力。近年來，納米乳液在食品保鮮方面的應(yīng)用也有研究報(bào)道。Radi等[47]制備橙皮精油納米乳并對(duì)鮮切橙片進(jìn)行涂膜處理，結(jié)果表明橙皮精油納米乳能夠發(fā)揮有效的保鮮作用。吳玲艷[48]制備的非嗎啉納米乳涂膜劑能有效保證甘薯的品質(zhì)，延長(zhǎng)貨架期。雷凱[49]制備了香芹酚納米乳-羧甲基殼聚糖復(fù)合食品包裝膜并用于小麥面包貯藏，結(jié)果表明，小麥面包保質(zhì)期隨香芹酚濃度的增加而延遲，最長(zhǎng)可達(dá)7 d。因此，將GNE應(yīng)用于果蔬的涂膜保鮮，或加入可降解材料制備成保鮮膜用于食品包裝貯藏等具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

有害菌的生物菌膜給食品安全性帶來了嚴(yán)重危害，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合食品加工實(shí)際環(huán)境探究天然綠色產(chǎn)品GSE和具有更高生物活性及穩(wěn)定性的GNE對(duì)大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的抑制作用。GSE和GNE在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下均可以抑制大腸桿菌和金葡菌生物菌膜的形成，并且可以減少胞外蛋白質(zhì)和多糖的分泌，SEM和CLSM微觀形態(tài)觀察也得到一致的結(jié)論。生物菌膜的培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種菌混合成膜時(shí)，金葡菌的菌膜形成受到大腸桿菌顯著抑制。對(duì)已形成的生物菌膜進(jìn)行清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GSE和GNE也表現(xiàn)出積極的作用，且對(duì)金葡菌菌膜的清除作用更強(qiáng)。但是，相比于單種菌膜，混合菌膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，1.8%的GNE對(duì)混合菌膜中大腸桿菌、金葡菌的清除率分別比對(duì)兩菌單種菌膜清除率低14.9%和6.2%。這一結(jié)論提示有害菌混合生物菌膜抗性更強(qiáng)，可能會(huì)帶來更嚴(yán)重的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。比較GSE和GNE發(fā)現(xiàn)，GNE抑制菌膜形成及清除菌膜均強(qiáng)于GSE，1/2 MIC GNE作用120 h時(shí)兩菌菌膜形成量對(duì)數(shù)值均比GSE組少0.6（lg（CFU/cm2））以上，1.8%的GNE對(duì)已形成的單種菌膜和混合菌膜的清除率比GSE高7.7%～27.2%。本研究可為GSE和GNE在生物菌膜控制方面的推廣應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。