三代測序技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

武玉晶，劉爽，田亞瓊，范志娟，張磊，劉樹業(yè)（通信作者）

天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科·天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心·天津市肝膽研究所 （天津 300170）

由于全球環(huán)境變化、人類活動(dòng)和公用衛(wèi)生系統(tǒng)薄弱等因素，新型感染性疾病越來越常見[1]。感染性疾病是一類由于病原微生物感染而引起的疾病，基于所感染微生物的種屬和耐藥性選擇針對性抗生素是臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)基于生化或分離培養(yǎng)的微生物鑒定方法因耗時(shí)長、假陰性結(jié)果較多等缺點(diǎn)給臨床診治造成巨大困擾。分子生物學(xué)方法鑒定微生物能在一定程度上縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間、提高準(zhǔn)確率。質(zhì)譜技術(shù)，尤其是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用，但需將細(xì)菌分離培養(yǎng)，且鑒定菌種范圍也受限于數(shù)據(jù)庫的大小。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其衍生芯片等技術(shù)能針對某種微生物的靶基因判斷是否出現(xiàn)特定微生物感染，宏基因組測序技術(shù)可無偏倚地對標(biāo)本中的所有微生物核酸序列進(jìn)行檢測，但需排除定植菌污染，且讀長短，數(shù)據(jù)分析難度較高。三代測序（third generation sequencing，TGS）技術(shù)無需擴(kuò)增，可產(chǎn)生較長的讀長，是一項(xiàng)鑒定微生物的新興技術(shù)，有望提高臨床診斷、研究及追蹤感染性疾病的能力。本研究就TGS 技術(shù)在病原微生物檢驗(yàn)中的作用及特點(diǎn)作一綜述。

1 TGS 檢測原理

TGS 技術(shù)主要包括2種方法：一種是納米孔技術(shù)，其代表是英國牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）；另一種是單分子熒光測序技術(shù)，以美國太平洋生物的單分子實(shí)時(shí)測序（single molecule real-time，SMRT）技術(shù)為代表。TGS 共同點(diǎn)是無需擴(kuò)增，可直接檢測單個(gè)DNA 或RNA 分子的堿基，但由于檢測原理并不相同，又具有不同的特點(diǎn)。

1.1 納米孔測序

ONT 公司在2014年首次介紹了MinION 平臺(tái)，不同于二代測序的邊合成邊測序方式，該平臺(tái)測序的核心部件是蛋白質(zhì)納米孔。在納米孔系統(tǒng)中，納米孔插于可施加電壓的膜上，在膜上形成通道，當(dāng)施加跨膜電壓時(shí)，就可以通過檢測DNA 或RNA 不同堿基核苷酸通過納米孔時(shí)引起的微弱電流變化來鑒別核酸序列[2]。

納米孔測序具有以下優(yōu)勢。（1）讀長長：二代測序的單片段讀長一般不超過400 bp，而納米孔測序無需打斷待檢核酸片段，讀長一般在500 bp 以上，可高達(dá)2 Mb[3]；實(shí)際上，納米孔測序讀長長度的限制并不在于測序技術(shù)本身，而在于文庫制備中，需提取出完整的待檢DNA 或RNA 填充至流動(dòng)池中[4]；超長讀長使得納米孔技術(shù)具備很多優(yōu)勢，如無需準(zhǔn)備復(fù)雜文庫就能實(shí)現(xiàn)基因組從頭組裝，確定含有長重復(fù)序列的基因組區(qū)域，以及研究基因組內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異[5]。（2）數(shù)據(jù)處理難度降低：相較于二代測序，TGS 結(jié)果無需生物信息分析專家，對普通用戶更加友好。（3）經(jīng)濟(jì)快速：與Illunima 等二代測序設(shè)備相比，MinION 平臺(tái)進(jìn)行測序所需要的成本更低，約100美金；MinION 測序也無需對核酸進(jìn)行片段化，最快可在10 min 內(nèi)完成樣本建庫；納米孔測序?qū)崟r(shí)讀取的特點(diǎn)意味著在生物樣本解釋開始之前無固定的最小運(yùn)行時(shí)間，檢測時(shí)間往往在幾小時(shí)[6]。（4）納米孔測序MinION 設(shè)備袖珍：納米孔測序設(shè)備不需要成像設(shè)備，檢測系統(tǒng)體積較小，尤其是MinION Mk1B 設(shè)備僅重90 g，大小為3.3 cm×10.5 cm×2.3 cm，能夠直接放在手掌中；該設(shè)備可通過筆記本電腦的USB 接口供電，在實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境中也可使用，實(shí)現(xiàn)了真正的現(xiàn)場檢測。

納米孔測序也存在一些不足，主要是通量較低和錯(cuò)誤率較高。根據(jù)檢測核酸分子類型和建庫方法的差異，納米孔測序的錯(cuò)誤率一般在5%～20%間，錯(cuò)誤類型主要是插入和刪除，通常需要短讀長測序方法（如二代測序）進(jìn)行驗(yàn)證或糾錯(cuò)[7]。

1.2 單分子熒光測序技術(shù)

SMRT 是最早被商業(yè)化的TGS 技術(shù)[8]，其核心技術(shù)是零級波導(dǎo)技術(shù)和熒光集團(tuán)標(biāo)記在核苷酸的3’端[9]。前者依靠于一種直徑遠(yuǎn)小于檢測激光波長的孔，約為10～50 nm，其底部固定有DNA 聚合酶，激光照射在檢測孔底部發(fā)生衍射，照亮局部較小的范圍，只有在這個(gè)范圍內(nèi)，核苷酸攜帶的熒光基團(tuán)被激活后才能被檢測到，從而避免背景干擾[10]。在DNA 合成過程中，3’端結(jié)合熒光基團(tuán)的化學(xué)鍵斷裂并釋放熒光基團(tuán)，檢測系統(tǒng)通過熒光基團(tuán)在檢測孔底部停留的時(shí)間長短，判斷檢測到的熒光標(biāo)記堿基是否與模板鏈堿基相匹配；以此為基礎(chǔ)，SMRT可在合成互補(bǔ)鏈時(shí)，實(shí)時(shí)記錄不同堿基上標(biāo)記的不同熒光信息來確定堿基序列。

與納米孔測序類似，SMRT 測序也具有省時(shí)快速、無需擴(kuò)增直接測序、較為簡單的數(shù)據(jù)處理流程和長讀長等特點(diǎn)，并在重復(fù)區(qū)域測序中表現(xiàn)出十分優(yōu)越的性能。一項(xiàng)多中心研究果顯示，相較于短讀長檢測平臺(tái)，TGS 技術(shù)在高重復(fù)區(qū)域表現(xiàn)出最佳的序列定位性能[11]。天然DNA 分子可能攜帶不同類型的堿基修飾，如甲基化，而這些表觀遺傳修飾可直接被SMRT 設(shè)備檢測到；而單分子測序數(shù)據(jù)中的表觀遺傳信號(hào)相對較弱，需在特定位點(diǎn)進(jìn)行高覆蓋率檢測才能確定其是否被修飾[12]。因此，SMRT 主要用于繪制較小基因組中的表觀遺傳信號(hào)，如結(jié)核桿菌菌株中的甲基化模式[13]。與納米孔測序的系統(tǒng)錯(cuò)誤不同，SMRT 測序錯(cuò)誤是隨機(jī)錯(cuò)誤，測序錯(cuò)誤率約為15%，堿基錯(cuò)測率約為1%，可通過提高測序深度降低錯(cuò)誤率[14]。

2 TGS 臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

TGS 結(jié)合16S rRNA 或全序列測序技術(shù)可針對標(biāo)本中的所有微生物進(jìn)行無偏向性測序，可鑒定已知或未知的病原體，對細(xì)菌中的耐藥基因也有良好的檢測效果；同時(shí)，ONT 的MinION 設(shè)備袖珍，可用于實(shí)驗(yàn)室外環(huán)境中進(jìn)行檢測，為將來的快速床旁測序提供可能性。

2.1 微生物鑒定中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)微生物鑒定方法相比，TGS 技術(shù)不必依賴于分離培養(yǎng)和生化反應(yīng)，可直接對微生物進(jìn)行測序分析，更適合臨床少見的疑難菌和難培養(yǎng)菌鑒定。胎兒彎曲桿菌很少引起人類細(xì)菌性腦膜炎，但一項(xiàng)病例報(bào)道顯示，通過納米孔技術(shù)在免疫抑制患者中鑒定出胎兒彎曲桿菌，并將感染病原體鑒定至亞種水平[15]，為臨床治療提供了決策性指導(dǎo)。Sanderson 等[16]通過Illumina 測序平臺(tái)和ONT 同時(shí)對9個(gè)超聲處理液樣本（7個(gè)培養(yǎng)陽性和2個(gè)培養(yǎng)陰性）進(jìn)行測序，兩種方法檢測的結(jié)果一致；此外，與分離培養(yǎng)的方法相比，有2個(gè)陽性樣本被ONT 發(fā)現(xiàn)兩種額外的微生物陽性，提示ONT 測序具有更高的檢測靈敏度。

TGS 讀長較長的特點(diǎn)使得其在具有重復(fù)序列和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基因組研究中更具有優(yōu)勢。有研究者利用TGS 技術(shù)的重組裝策略，先通過準(zhǔn)確率較低的長重疊群構(gòu)建基因組框架，再利用準(zhǔn)確率較高的短重疊群對框架進(jìn)行糾正，最終獲得人巨細(xì)胞病毒的堿基序列，準(zhǔn)確率高達(dá)98.8%[17]。TGS 和宏基因組技術(shù)相結(jié)合，可快速鑒定標(biāo)本中的幾乎所有病原體，Charalampous 等[18]采用TGS 對患者下呼吸道標(biāo)本宏基因組檢測鑒定病原體及耐藥性，檢測靈敏度為96.6%，能夠準(zhǔn)確診斷出混合感染，為臨床治療提供重要依據(jù)。

由于TGS 可直接實(shí)現(xiàn)RNA 測序，使RNA 病毒檢測更加便捷。以往幾乎所有RNA 分子測序都需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增[19]，但ONT 技術(shù)能夠在RNA 自然狀態(tài)下進(jìn)行測序。2015年首次使用納米孔技術(shù)對RNA 病毒進(jìn)行直接測序，耗時(shí)4 h 產(chǎn)生可靠的基因草圖[20]，RNA 直接測序有助于揭示表觀遺傳RNA 修飾和微生物多種性狀的變化機(jī)制。

2.2 在耐藥性檢測中的應(yīng)用

微生物耐藥性檢測在臨床用藥方面具有重要的指導(dǎo)意義。微生物基因組的重復(fù)序列和質(zhì)粒中通常包含有重要的耐藥性遺傳信息[21]。納米孔測序技術(shù)對患者樣本進(jìn)行測序后，將結(jié)果序列與已知微生物耐藥基因數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對，可進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷[22]。TGS技術(shù)在檢測耐藥基因方面具有巨大潛力，堿基可信度也從最初的72%提升至99%[23-24]，隨著測序深度的加大，有望進(jìn)一步提高可信度。2019年ONT 發(fā)布了一款新的芯片R10，具有Q50級別的通用序列可信度，即堿基結(jié)果的可信度為99.999%，每100 000個(gè)堿基中出錯(cuò)的堿基數(shù)為1。研究證明，基于基因組學(xué)的抗菌藥物敏感性預(yù)測與通過稀釋進(jìn)行的最小抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果的一致性高達(dá)98%[25]。SMRT 技術(shù)被報(bào)道用于鑒定耐多藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥原理，發(fā)現(xiàn)其屬于一種新的序列類型和克隆復(fù)合體，并含有幾個(gè)耐藥基因，有力地解釋了耐多藥鮑曼不動(dòng)桿菌的某些耐藥表型發(fā)生的分子機(jī)制，并為臨床抗菌藥物的選擇指明了方向[26]。Tada 等[27]使用SMRT 技術(shù)對住院患者中分離出的耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌菌株NCGM1984進(jìn)行完整的基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌株含有位于染色體不同位點(diǎn)的兩個(gè)IMP-34型金屬β-內(nèi)酰胺酶，基因組中含有6組多于10 000 bp 的相同堿基對，證實(shí)為古噬菌體。此類基因區(qū)域的重建很難通過短讀長的二代測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)，TGS 技術(shù)有助于通過基因轉(zhuǎn)移闡明細(xì)菌耐藥基因的進(jìn)化過程[28]。在病毒基因檢測方面，TGS 技術(shù)通過長重復(fù)基因序列檢測的優(yōu)勢證明了甲型流感病毒缺陷型干擾顆粒存在于人類甲型流感病毒感染中，這一研究結(jié)果為理解甲流病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)制提供重要的線索[29]。

相較于傳統(tǒng)藥敏鑒定方法，TGS 技術(shù)在縮短檢驗(yàn)周轉(zhuǎn)時(shí)間方面具備巨大優(yōu)勢。Leggett 等[30]表明，納米孔技術(shù)結(jié)合優(yōu)化工作流程可將嬰兒糞便樣本細(xì)菌鑒定和藥敏結(jié)果檢測的周轉(zhuǎn)時(shí)間縮短到5 h 以內(nèi)；同時(shí)，TGS 基因型檢測與表型的相符度較高，可達(dá)98%。與二代測序相比，TGS 技術(shù)讀長長，在檢出耐藥基因重復(fù)序列和可移動(dòng)遺傳元件方面更有優(yōu)勢，是頗具應(yīng)用前景的耐藥基因檢測平臺(tái)。

2.3 在傳染性疾病中的應(yīng)用

ONT 的測序設(shè)備MinION 相較于NGS 平臺(tái)設(shè)備，除了體積更?。▋HU 盤大?。?、成本更低[31-32]以外，還可對多種標(biāo)本類型進(jìn)行實(shí)時(shí)的現(xiàn)場分析[33]。在西非埃博拉病毒流行期間，MinION 能夠?qū)崿F(xiàn)院外床旁檢測病毒，并在1 h 內(nèi)完成測序工作，在接收埃博拉病毒陽性樣本后的24 h 內(nèi)即可給出診斷結(jié)果，有助于對疫情的實(shí)時(shí)監(jiān)控[34]。在醫(yī)療資源有限、病毒隨時(shí)變異的情況下，納米孔測序技術(shù)能較大程度上幫助鑒定病原體。在2019年河北省某市的腺病毒疫情中，工作者應(yīng)用納米孔測序技術(shù)分別在14 min 和22 min 檢測到混合樣本和單樣本的7型腺病毒序列，3 h 內(nèi)產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)基本覆蓋腺病毒的參考基因組[35]。TGS 技術(shù)快速檢測病毒及其基因組序列為感染原確定和疫情溯源提供了重要參考。TGS 在極端環(huán)境下的穩(wěn)定性也已有文獻(xiàn)報(bào)道，研究者利用納米孔測序進(jìn)行宏基因組測序檢測加拿大高緯度永久凍土中微生物群落，檢測結(jié)果與二代測序結(jié)果一致[36]；TGS 技術(shù)還可用于在國際空間站中檢測λ 噬菌體、大腸桿菌和小家鼠的基因組，證明了該技術(shù)在國際空間站中進(jìn)行測序分析和微生物鑒定的可行性[37]。值得注意的是，這些研究中應(yīng)用的檢測標(biāo)本并非是人體標(biāo)本，TGS 在極端環(huán)境中進(jìn)行人類感染性疾病的病原體鑒定及其性能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在最近的新型冠狀病毒疫情防控中，一項(xiàng)納入1 200名受試者，共采集23 427個(gè)樣本（3 966個(gè)拭子，19 461個(gè)唾液標(biāo)本）的多中心前瞻性研究[38]中，納米孔測序結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)診斷的靈敏度和特異度均大于99.5%，是一種高度準(zhǔn)確的檢測方法，也是RT-qPCR 的潛在替代方法。有研究通過納米孔結(jié)合環(huán)等溫?cái)U(kuò)增方法成功檢出便標(biāo)本中低濃度的新型冠狀病毒，使用ONT 平臺(tái)檢測新型冠狀病毒核酸的檢測下限較低，可檢出10 copies/mL 載量的病毒[39-40]。ONT 平臺(tái)最新VolTRAX 實(shí)現(xiàn)了樣本提取、自動(dòng)上樣、智能化測序和數(shù)據(jù)分析的一站式服務(wù)，能夠給出病原微生物及其耐藥性基因的分析鑒定結(jié)果。

3 限制及展望

由于微生物基因組中擴(kuò)增子序列的高度相似性，二代測序的讀長較短、數(shù)據(jù)分析難度較大限制了其在微生物鑒定的應(yīng)用，而TGS 讀長更長，可鑒定至種或更低水平，有助于準(zhǔn)確、高效地檢測臨床樣本中的多種微生物。但TGS 技術(shù)也存在一些不足，納米孔測序和SMRT 技術(shù)都不能反復(fù)對一段序列進(jìn)行測序，導(dǎo)致測序深度不夠，結(jié)果數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和通量都較低；隨著平臺(tái)技術(shù)改進(jìn)和信息分析算法的優(yōu)化，TGS 技術(shù)的準(zhǔn)確率已經(jīng)由早期的80%左右提高至約95%，但電場力驅(qū)動(dòng)核酸通過孔徑速度過快與電流信號(hào)疊加等因素仍是提高準(zhǔn)確率的最大阻礙[41]，也是限制TGS 技術(shù)進(jìn)一步向臨床推廣的重要因素。希望隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、工程技術(shù)、生物信息分析學(xué)以及交叉學(xué)科的不斷創(chuàng)新發(fā)展，TGS技術(shù)能夠得到進(jìn)一步完善。

總之，傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)鑒定耗時(shí)長、陽性率低等不足影響臨床患者診治，二代測序技術(shù)建庫耗時(shí)長、數(shù)據(jù)信息處理難度較大、成本高等缺點(diǎn)也限制其在微生物檢測中耐藥性判斷方面的應(yīng)用范圍，TGS 技術(shù)在周轉(zhuǎn)時(shí)間、成本、數(shù)據(jù)處理、測序讀長和儀器便攜性等方面具有諸多優(yōu)勢，彌補(bǔ)二代測序和傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法的不足[42]。面對臨床快速鑒定感染病原體物種和耐藥特征的需求，TGS 技術(shù)有望成為病原微生物鑒定的主要發(fā)展方向。