無創(chuàng)產(chǎn)前篩查擴展性檢測臨床研究進展*

徐玉嬋 綜述，嚴提珍 審校

(柳州市婦幼保健院醫(yī)學遺傳科/柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室/柳州市生殖與遺傳研究所，廣西 柳州 545001)

中國出生缺陷發(fā)生率為5.6%，年均新增出生缺陷患者高達90萬例[1]。染色體異常是導致新生兒出生缺陷最常見的遺傳疾病，在新生兒中的發(fā)生率約為1/160。13、18、21-三體綜合征是最主要的常染色體非整倍體疾病，特別是21-三體綜合征在新生兒中的發(fā)生率較高，每800名活產(chǎn)嬰兒中就有1例患有唐氏綜合征(DS)[2]。目前，廣泛開展的唐氏篩查準確性低、假陽性率高[3]，因而對高風險孕婦仍需進行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，如抽吸絨毛、羊水、臍血等對染色體核型進行分析，進而增加了胎兒額外的流產(chǎn)風險[4]。香港中文大學盧煜明博士等于1997年首次報道了利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲得母體外周血中Y染色體的特異DNA序列，進而證實孕婦外周血的血漿中具有胎兒游離DNA(cffDNA)，為無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)提供了科學基礎[5]。2011年以來對新生兒非整倍體異常的NIPT得到一系列的臨床研究證實，并被廣泛用于臨床[6-7]?，F(xiàn)將NIPT在性染色體非整倍體(SCA)，雙胎妊娠，染色體微缺失、微重復，單基因遺傳病等臨床檢測中的研究進展綜述如下。

1 NIPT的擴展性檢測

1.1SCA SCA總發(fā)生率為1/500[8]，最常見者包括特納綜合征(45，X)、超雌綜合征(47，XXX)、Klinefelter綜合征(47，XXY)、超雄綜合征(47，XYY) 和SCAs嵌合體。SCA的臨床表型差異較大，患者大多數(shù)表現(xiàn)為性器官發(fā)育不良、性腺功能下降、不育或不孕等，但在智能與運動功能方面尚可。傳統(tǒng)血清學產(chǎn)前篩查主要針對21、18-三體綜合征和神經(jīng)管缺陷的檢測，并沒有針對包括特納綜合征、克氏綜合征等在內(nèi)的性染色體異常的風險評估。有學者認為，在有DS篩查的國家SCA檢出率低于50%，用于檢測DS的方法不能擴展到檢測SCA[9]。超聲檢查發(fā)現(xiàn)，頸部水囊狀淋巴管瘤及胎兒頸后皮下透明層增厚與45，XO有關[10]，但目前對其他SCA的產(chǎn)前篩查沒有特異度較高的方法。許多研究表明，NIPT可能是一種潛在的SCA篩查方法，但該技術尚有待于進一步研究。ZHANG等[11]對10 275例參加NIPT的孕婦進行分析表明，對NIPT所監(jiān)測孕婦的染色體變異的總體陽性預測值(PPV)為54.55%(18/33)，檢測特納綜合征(45，X)的總體PPV為29.41%(5/17)。說明NIPT可通過大規(guī)模并行基因組測序分析cffDNA鑒定胎兒性染色體異常，但對特納綜合征(45，X)的準確性尚有待于提高。美國一項大型臨床試驗研究表明，在69 794例單胎妊娠孕婦中檢出1 359例(1.95%)NIPT高風險結(jié)果，其中 SCA的PPV為69.0%[12]。BEVILACQUA等[13]評估有關篩查SCA患者選擇和影響該選擇的因素發(fā)現(xiàn)，3 162名孕婦中61.9%選擇了SCA篩查。118例(73.3%)篩查高風險的隨訪數(shù)據(jù)表明涉及X染色體的SCA的PPV低于涉及Y染色體的SCA。其中5例47，XYY病例均被正確識別，PPV為100%;47，XXY病例PPV為63.33%(19/30);47，XXX和45，X的PPV分別為22.73%(5/22)和24.59%(15/61)。在中國湖南22 2107名孕婦參與的一項大規(guī)模研究結(jié)果也顯示，NIPT篩查X單體的真實陽性率較低，而其他SCA的預測相對準確[14]。X染色體變異的孕婦也可能會影響cffDNA產(chǎn)前檢測結(jié)果，從而產(chǎn)生假陽性或假陰性。常家禎等[15]在發(fā)現(xiàn)的SCA高危病例中與侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果并不相符的74例患者中有19例母體基因拷貝數(shù)變異(CNV-seq)檢測出現(xiàn)母體X染色體變異，占SCA假陽性病例的25.68%(19/74)。另一項研究結(jié)果顯示，母體因素是NIPT性染色體異常高假陽性的主要因素，使用 cffDNA(ChrX)/cffDNA比例可暫時區(qū)分異常游離DNA的母源或胎兒來源[16]。當比率大于2時所有胎兒的核型均正常，而75.00%(6/8)的母親X染色體異常;比率小于或等于2時只有10.00%(4/40)的母親有X染色體CNV改變，而32.50%(13/40)的胎兒有性染色體CNV異常。值得強調(diào)的是，當產(chǎn)前診斷結(jié)果與NIPT結(jié)果不一致時建議檢測母體外周血CNV-seq找出假陽性或陰性結(jié)果的原因，并且不建議對已知X染色體變異的孕婦進行NIPT。

1.2雙胎妊娠 自然雙胎發(fā)病率大約為1/90，但由于國家“二孩”，甚至“三孩”政策的鋪開，輔助生殖技術的需求量逐漸增加，雙胎妊娠發(fā)生率也相應上升。目前，在中國雙胎妊娠發(fā)生率已達到2%。雙胎妊娠新生兒染色體非整倍體病的風險遠比單胎妊娠高[17]，并且篩查受各種因素的影響，是臨床研究的熱點和難點。雙胎妊娠單純使用母體血清學篩查存在一定的局限性，因檢測的假陽性率高導致需進行雙胎羊膜腔穿刺檢查的可能性增大，最高可達18.3%[18]，進而提高了由于侵入性產(chǎn)前診斷導致的孕婦流產(chǎn)概率，所以，一般并不建議對雙胎妊娠單純開展血清學檢查。NIPT技術在自然單胎妊娠中的篩查研究現(xiàn)已獲得應用，但在雙胎妊娠中使用的文獻報道卻極少見。因沒有大樣本的調(diào)查，檢測的準確率尚不清楚，雙胎妊娠在國內(nèi)孕婦外周血cffDNA產(chǎn)前篩查和診斷技術規(guī)范中屬“慎用人群”。SARNO等[19]研究表明，417例雙胎妊娠中21-三體檢出率為100%(8/8)，18-三體或13-三體檢出率為60.00%(3/5)，假陽性率為 0.25%(1/404)。一項納入35項NIPT相關研究的meta分析結(jié)果顯示，在雙胎妊娠中對21-三體綜合征的篩查發(fā)現(xiàn)，共有24例21-三體和1 111例非三體性21號染色體異常，總檢出率為100%(95%可信區(qū)間：95.2～100.0)，假陽性率為0(95%可信區(qū)間：0.000～0.003)[20]。雙胎妊娠母親血漿中具有2個胎兒的游離DNA，但不能識別，且影響因素較復雜。有研究表明，雙胎妊娠NIPT檢測的準確性與cffDNA水平，即“胎兒分數(shù) ”有關[21]。單卵雙胎在cffDNA總數(shù)約為4%后即可達到測定條件，且遺傳物質(zhì)水平與單胎一致。而雙卵雙胎染色體核型通常并不相同，如異常cffDNA少而正常cffDNA水平高，檢測結(jié)果可能因正常胎兒“掩蓋”了異常胎兒而提示為低風險造成假陰性。YU等[22]發(fā)現(xiàn)，雙胎之一死亡是引起NIPT假陽性的主要因素，異常胎兒死亡后孕婦外周血中仍存在著死亡胎兒的游離DNA，該影響至少持續(xù)7～8周，但不超過12～14周，所以，雙胎之一死亡消失時建議直接產(chǎn)前診斷而不是產(chǎn)前篩查。另有研究表明，雙胎妊娠中cffDNA與母親血漿DNA比率遠不及單胎妊娠，中位數(shù)分別為8.0%、11.0%；而NIPT檢測中雙胎妊娠重采率也比單胎高，第1次抽樣后失敗率雙胎和單胎分別為9.4%、2.9%[19]。NIPT檢測雙胎、輔助生殖助孕胎兒21、18、13-三體綜合征具有一定的可行性，但仍存在假陽性，篩查高風險需進一步進行介入性產(chǎn)前診斷，且雙胎妊娠檢測失敗率，以及篩查低風險孕婦死胎、流產(chǎn)等異常妊娠結(jié)局發(fā)生率均高于單胎妊娠，因而檢測的后續(xù)處理和遺傳咨詢尤為重要[23]。

1.3染色體微缺失、微重復 染色體微缺失/微重復綜合征是一類由于CNV-seq所致的具有復雜表型的綜合征性病癥，是造成新生兒出生缺陷的主要遺傳性原因之一。據(jù)統(tǒng)計，在不明病因的兒童智力下降、多發(fā)畸形和生長/發(fā)育延遲中約有12%是由染色體中的微缺失/微重復引起的。2011年PETERS等[24]在新英格蘭雜志報道了1例通過NIPT方法檢出的在12p11.22-p12.1之間4.2 Mb的微缺失，并通過介入性產(chǎn)前診斷證明了該胎兒的染色體微缺失遺傳自其患有Asperger′s綜合征的母親，可導致生長/發(fā)育遲緩和多發(fā)畸形的臨床表型。說明NIPT不僅對常見染色體非整倍性，而且對CNV的檢測均具有潛在意義，但這種最新方法仍處于起步階段。一項納入42 910例單胎妊娠的研究結(jié)果顯示，NIPT檢測染色體微缺失/微重復的PPV為28.99%，其中CNV≤5 Mb的PPV為20.83%，5～10 Mb的PPV在50.00%以內(nèi)，>10 Mb的PPV為27.27%[25]。另有研究采用NIPT檢查了8 141例單胎妊娠，結(jié)果顯示，51例(0.63%)染色體微缺失或微重復的篩查高風險病例，但只有13例(36.11%)經(jīng)產(chǎn)前診斷確診為陽性病例[26]。有學者利用算法優(yōu)化以增加分析的靈敏度，如CHEN等[27]開發(fā)了一種實用的胎兒CNV分析方法，通過低覆蓋全基因組測序(約0.08倍)檢測大于10 Mb的胎兒染色體缺失/重復，在1 311例樣本中檢測到4個樣本的缺失/重復，范圍為9.01～28.46 Mb，檢測大于10 Mb染色體缺失/重復的靈敏度和特異度分別為100%、99.92%。WAPNER等[28]則針對目標區(qū)域基于單核苷酸多態(tài)性技術的 NIPT 方法對358例孕婦血漿樣本檢測了5種微缺失綜合征，其中胎兒22q11.2 缺失的檢出率為 97.8%，假陽性率為 0.76%，其余 4 種綜合征(1p36缺失、Cri-du-chat綜合征、Angelman綜合征、Prader-Willi綜合征)的檢出率均為 100%。此后國內(nèi)外多家機構(gòu)擴展了NIPT的分析技術領域，增加了CNV-seq檢測，即NIPT-Plus。近期中國一項共有94 085名單胎妊娠婦女參加的大型NIPS-Plus臨床研究結(jié)果顯示，對已知微缺失/微重復綜合征(32例)、DiGeorge綜合征的PPV為93%，22q11.22微重復的PPV為68%，Prader-Willi/Angleman綜合征的PPV為75%，Cri-du-Chat綜合征的PPV為50%；對剩余的全基因組微缺失/微重復綜合征(88例)組合的PPV為32%(CNV≥10 Mb)和19%(CNV<10 Mb)[29]。可見，NIPS-Plus對DiGeorge綜合征具有較高的PPV，對其他染色體微缺失/微重復綜合征的PPV則沒有那么高。

1.4單基因遺傳病 單基因遺傳病是由于一對等位基因突變引起且遺傳上遵循孟德爾遺傳定律的病癥，因而也稱為孟德爾遺傳病。截至2020年，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫在線上公布的表型和分子機制已知的單基因遺傳病為5 947種。國外統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，出生缺陷中染色體異常占6%，而單基因遺傳病占7.5%，所有單基因遺傳病的累積發(fā)病率高達1%，是出生缺陷的主要原因。檢查新生兒單基因遺傳性疾病最直接的手段就是對胎兒組織或細胞的檢查，如通過羊水穿刺或絨毛層取樣進行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。目前，通過cffDNA對單基因遺傳病進行檢測的技術開展受到限制，主要由于以下3種原因：(1)孕婦血漿中存在大量母源DNA信息的干擾，若cffDNA水平又偏低則胎兒DNA信息將因母源性變異而無法檢測；(2)母體外周血中cffDNA水平很低，導致無法檢出結(jié)果或造成假陰性與假陽性結(jié)果；(3)由于不同型單基因病致病原因的復雜程度不同，因而檢測的策略各有差異，大多數(shù)單基因遺傳病的無創(chuàng)檢測均需依賴于先證者樣本構(gòu)建胎兒單倍體型。從檢測技術上看，基于cffDNA的單基因病檢測其發(fā)展大致經(jīng)歷了從PCR、熒光定量 PCR、數(shù)字PCR、低深度二代測序到現(xiàn)在的高深度二代測序過程。目前，對利用cffDNA檢查胎兒單基因病變的研究重點主要聚焦于對常染色體遺傳疾病及其X-連鎖病變的檢測，主要研究的疾病涉及地中海貧血、軟骨發(fā)育不良、強直性肌肉營養(yǎng)不良、亨廷頓舞蹈癥等14種人群患病率較高的病癥。英國在單基因病無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術向臨床轉(zhuǎn)化方面做了許多工作并取得了成效，目前，已針對軟骨損傷發(fā)育缺陷、致死性骨生長/發(fā)育缺乏、阿佩氏綜合征、囊性纖維化、成纖維細胞生長因子受體基因相關的顱縫過早閉癥等建立了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷臨床服務[30]。國內(nèi)近期有研究表明，通過靶向捕獲測序和單倍型輔助分析方法可實現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒地中海貧血的基因型[31]。LI等[32]采用SHAPEIT軟件構(gòu)建了親代單倍型，并對新生兒與遺傳的父親之間的單倍體型劑量應用相應定量分析的方法推斷胎兒突變的遺傳狀態(tài)，成功構(gòu)建了5個β-地中海貧血家庭的親本單倍型并檢測了遺傳的親本突變。

2 小 結(jié)

NIPT可能是一種潛在的SCA篩查方法，篩查X-染色體單體的真實陽性率較低，而對其他SCA的預測相對準確。X-染色體變異的孕婦可能會影響cffDNA產(chǎn)前篩查結(jié)果，因而不建議對已知X-染色體變異孕婦進行NIPT。按規(guī)范標準管理方法和規(guī)范操作進行，NIPT的雙胎21、18、13-三體綜合征存在一定的有效性，但因沒有大量的臨床使用結(jié)果，其應用價值尚有待于進一步研究。根據(jù)目前的研究進展和指南意見分析，以NIPT的方式篩查研究結(jié)果較明確的5 Mb以上的胎兒CNV存在一定可行性，適用于 NIPT的臨床檢測范圍有望拓展至21、18、13-三體綜合征以外的染色體病。目前，單基因遺傳病的NIPT研發(fā)總體仍處在科研探討中，但各種方法仍需經(jīng)過更大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)的檢驗，因此，測試方法及對整個測試系統(tǒng)的品質(zhì)監(jiān)管與監(jiān)控均須進一步明確與細化方可用于臨床研究。盧煜明博士隊伍最近的研究結(jié)果顯示，孕婦血漿中存有新生兒染色體外環(huán)狀DNA，具有較強的生物穩(wěn)定性和獨特的分子特征，或?qū)⒖赡転檠杆侔l(fā)展的NIPT研發(fā)領域創(chuàng)造出一個全新的生物標志物[33-34]。相信未來由于檢測成本的下降和科技的提升，NIPT在產(chǎn)前檢測領域?qū)⒕邆涓用黠@的技術優(yōu)勢和廣泛的發(fā)展前景。