RhoGTP酶活化蛋白在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用的研究進(jìn)展

徐 倩，段 華，甘 露，劉麒薇

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院 婦科微創(chuàng)中心，北京 100006

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在形態(tài)上發(fā)生向間(充)質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變,并獲得遷移能力。在此過(guò)程中，極化的上皮細(xì)胞經(jīng)歷多種生化改變，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞表型，細(xì)胞遷移能力、抗凋亡能力及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力增強(qiáng)[1]。近年來(lái)，RhoGTP酶活化蛋白(RhoGTPase activating protein，RhoGAP)對(duì)EMT過(guò)程中細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及細(xì)胞遷移能力的調(diào)控越來(lái)越受到研究者的重視[2]。作為Rho家族小GTP酶的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，RhoGAP可以參與調(diào)控細(xì)胞表面受體同肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響EMT相關(guān)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及纖維化疾病的轉(zhuǎn)歸，成為抗腫瘤及抗纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。本文就RhoGAP在EMT過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 EMT與RhoGTP酶的關(guān)系

EMT主要包括3種類(lèi)型：胚胎發(fā)育及器官發(fā)生相關(guān)EMT、組織再生及纖維化相關(guān)EMT、癌侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)EMT[1]。上皮細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中、受到炎性刺激或致癌因素刺激時(shí)，都可能發(fā)生EMT過(guò)程，分別轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及具有轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細(xì)胞[3]。在發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞中，細(xì)胞骨架改變，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏素及γ-連環(huán)蛋白表達(dá)降低，同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白、N-鈣黏素及纖連蛋白增多，基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)物質(zhì)增多[4]。RhoGTP酶可以調(diào)節(jié)很多細(xì)胞的基礎(chǔ)功能過(guò)程，包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分化[5]。其家族關(guān)鍵成員包括Rho、Rac和Cdc42。Rho可以對(duì)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維進(jìn)行重新裝配，并刺激細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮；Rac可以誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白表面突起即板狀偽足的裝配；Cdc42促進(jìn)富含肌動(dòng)蛋白的指狀延伸即絲狀偽足形成，并且調(diào)整細(xì)胞的非對(duì)稱性。

在多種轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞系中，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚可以影響細(xì)胞大小，并提高細(xì)胞E-鈣黏素的表達(dá)水平，表明肌動(dòng)蛋白重構(gòu)是發(fā)生EMT的上游調(diào)控因子[8]。因此，RhoGTP酶是胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控中的重要分子開(kāi)關(guān)，是EMT過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[6]。

2 RhoGAP對(duì)EMT的調(diào)控作用

RhoGAP作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子加速RhoGTP酶的水解，促進(jìn)內(nèi)源性GTP酶活化，使其更易于與GTP分離并結(jié)合GDP[7]，從而使RhoGTP酶由活性型-GTP限制型轉(zhuǎn)變?yōu)槭Щ钚?GDP限制型。RhoGAP蛋白分子具有一個(gè)指狀結(jié)構(gòu)保守結(jié)構(gòu)域,其帶正電荷精氨酸可以進(jìn)入GTP酶的催化基團(tuán)，通過(guò)中和GTPγ-磷酸鹽的負(fù)電荷發(fā)揮作用[8]。

RhoGAP失活足以引起Rho通路超活化，促進(jìn)Rho介導(dǎo)的細(xì)胞改變進(jìn)程，RhoGAP對(duì)RhoGTP酶活性的調(diào)節(jié)是此過(guò)程中的重要生理學(xué)機(jī)制[9]。RhoGAP在很多轉(zhuǎn)移性癌類(lèi)型中表達(dá)量下降，提示RhoGAP可能在癌侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)EMT中發(fā)揮調(diào)控作用。RhoGAP通過(guò)RhoGTP酶影響細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞連接及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的各種成分，改變上皮細(xì)胞極性的穩(wěn)定性，調(diào)控EMT過(guò)程，從而影響疾病轉(zhuǎn)歸。

人類(lèi)RhoGAP分子的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了其細(xì)胞內(nèi)底物RhoGTP酶的種類(lèi),過(guò)量RhoGAP分子的存在提示RhoGAP分子在調(diào)節(jié)RhoGTP酶時(shí)具有特異性，這種特異性與RhoGTP酶催化基團(tuán)外的氨基酸殘基種類(lèi)有關(guān)。如前所述，細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白重構(gòu)在EMT中發(fā)揮重要作用，其主要以3種形式存在：1)板狀偽足，由相互交叉結(jié)合的肌動(dòng)蛋白微絲形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成；2)絲狀偽足，由平行的肌動(dòng)蛋白微絲形成指狀結(jié)構(gòu)組成，這是遷移細(xì)胞前緣的兩種突出結(jié)構(gòu)；3)肌動(dòng)-肌球蛋白微絲束，多見(jiàn)于纖維母細(xì)胞，以應(yīng)力纖維和弧狀排列形式插入黏著斑復(fù)合物。RhoGAP即通過(guò)調(diào)節(jié)這些肌動(dòng)蛋白組分進(jìn)而參與EMT中的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變及細(xì)胞遷移。以下對(duì)近年來(lái)研究較多的EMT相關(guān)RhoGAP進(jìn)行綜述。

2.1 肝癌缺失蛋白-1(deleted in liver cancer-1,DLC1) 與腫瘤轉(zhuǎn)移

DLC基因1(DLC1)定位于人類(lèi)染色體8p21.3-22，也叫做STARD12/ARHGAP7，其表達(dá)產(chǎn)物由1 091個(gè)氨基酸組成。其結(jié)構(gòu)主要包括不育基序區(qū)域、RhoGAP和START(steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer，START)3個(gè)結(jié)構(gòu)域。DLC蛋白家族主要通過(guò)負(fù)性調(diào)控Rho蛋白及其效應(yīng)因子和調(diào)控黏著斑蛋白去磷酸化而發(fā)揮其生物學(xué)功能。DLC1起初被作為肝細(xì)胞癌的腫瘤抑制因子，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其在很多人類(lèi)腫瘤中都有缺失，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及胰腺癌。

DLC1可以通過(guò)抑制TGF-β1通路傳導(dǎo)從而調(diào)控CD105的表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)移過(guò)程，發(fā)揮抑癌作用[10]。高轉(zhuǎn)移性的結(jié)直腸癌細(xì)胞外泌體miR-106b-3p與低轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞共培養(yǎng)，其可以通過(guò)下調(diào)DLC1的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程，說(shuō)明DLC1能夠通過(guò)調(diào)控EMT過(guò)程，發(fā)揮抑癌作用[11]。DLC1蛋白可以通過(guò)作用于EGFR/AKT/NF-KappaB通路上調(diào)E-鈣黏素的表達(dá)，阻斷鼻咽癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，從而影響癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)可以激活DLC1的GAP活性，經(jīng)過(guò)磷酸化及去磷酸化作用，最終形成MEK/ERK-黏著斑激酶-DLC1-蛋白磷酸酶(PP2A)互作復(fù)合體，為細(xì)胞播散及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的時(shí)空調(diào)控提供新的檢查點(diǎn)[13]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，DLC1可以通過(guò)其RhoGAP作用機(jī)制提高E-鈣黏素的表達(dá)水平，從而加強(qiáng)細(xì)胞集聚。以上研究均表明，DLC1可以通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)Rho通路，改變肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，抑制細(xì)胞的EMT過(guò)程，提示其可能成為轉(zhuǎn)移性癌的治療靶點(diǎn)。

2.2 p190RhoGAP對(duì)RhoGTP酶的調(diào)節(jié)

p190RhoGAP家族蛋白是RhoGAP家族中研究較為廣泛的一類(lèi)GTP酶活化蛋白,可以被非受體蛋白酪氨酸激酶Src介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化激活。p190RhoGAP家族蛋白包括兩個(gè)成員：p190RhoGAP-A(p190-A)和p190RhoGAP-B (p190-B)，也分別叫做ArhGAP35、ArhGAP5，其基因分別定位于人類(lèi)染色體19q13.3和14q12。作為RhoGAP家族重要成員之一，p190RhoGAP可以調(diào)節(jié)RhoGTP酶分子RhoA、Rac1以及Cdc42的活性狀態(tài)，從而參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性維持、細(xì)胞增殖分裂及細(xì)胞遷移等過(guò)程，而這些過(guò)程也與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性[14]。p190-A主要由3個(gè)區(qū)域組成：N端GTP結(jié)合區(qū)域、中部多個(gè)蛋白-蛋白互作區(qū)域以及C端GAP區(qū)域，并傾向于表現(xiàn)RhoA特異性結(jié)合。p190-A主要調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移及多種細(xì)胞的腫瘤生成。p190-B主要在胚胎生成及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，此外，p190-B對(duì)血管生成有重要的調(diào)節(jié)作用，且可調(diào)控 MMPs 的活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。

p190A可以逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，上調(diào)E-鈣黏素的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控Hippo通路，提高細(xì)胞接觸抑制，從而抑制腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抑癌作用[15-16]。結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，上調(diào)p190-B可以抑制RhoA蛋白的活性，改變E-鈣黏素、N-鈣黏素及波形蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步調(diào)控癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。葉酸可以增強(qiáng)cSrc和p190RhoGAP活性，降低RhoA活性，但ROCK抑制劑、cSrc抑制劑或p190RhoGAP沉默技術(shù)均可以逆轉(zhuǎn)這種改變，提示葉酸可以通過(guò)葉酸受體/cSrc/p190RhoGAP/RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

2.3 肌球蛋白Ⅸ(myosinⅨ)負(fù)性調(diào)節(jié)Rho蛋白活性

人類(lèi)表達(dá)兩種myosinⅨ基因：myosin-Ⅸa (Myo9a)和myosin-Ⅸb (Myo9b)。與其他肌球蛋白不同的是，myosinⅨ的尾部有一個(gè)RhoGAP區(qū)域，負(fù)性調(diào)節(jié)RhoGTP酶活性，其特異性針對(duì)Rho調(diào)節(jié)，而非Rac1或Cdc42。Myo9a常見(jiàn)表達(dá)于成年人的睪丸及腦部；Myo9b則主要在免疫系統(tǒng)表達(dá)，在宿主防御功能中參與細(xì)胞骨架形態(tài)快速變化及能動(dòng)性變化[18]。

細(xì)胞遷移需要細(xì)胞極化與收縮，并依賴于肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)與動(dòng)力學(xué)改變。Myo9b蛋白可以負(fù)性調(diào)節(jié)Rho蛋白的活性，白細(xì)胞中Myo9b蛋白的缺失可導(dǎo)致Rho活性增強(qiáng)，影響白細(xì)胞正常形態(tài)的維持，并影響白細(xì)胞的正常遷移能力[19]。局部加入Myo9b、Myo9b啟動(dòng)因子及GAP激活因子可以促進(jìn)白細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)，并增強(qiáng)細(xì)胞的正常遷移能力，提示Myo9b可以通過(guò)影響局部Rho的活性而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。抑制Myo9b在破骨細(xì)胞中表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞錯(cuò)位分布，酪氨酸激酶Src活性受到抑制，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，微管蛋白乙酰化缺失，影響微管的穩(wěn)定性，提示Myo9b具有RhoGAP活性，可以作為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)改變的信號(hào)分子，進(jìn)一步影響下游EMT過(guò)程。人類(lèi)支氣管上皮細(xì)胞的群體遷移時(shí)，使用RNA干擾技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)的Myo9a表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組，細(xì)胞間的黏附被破壞，新的細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)無(wú)法建立，導(dǎo)致細(xì)胞分散，說(shuō)明Myo9a對(duì)于細(xì)胞-細(xì)胞間黏附的建立及確保細(xì)胞群的群體遷移是必要的。缺乏Myo9a的細(xì)胞無(wú)法形成初始細(xì)胞連接，表型分散，常可導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合受阻。在細(xì)胞水平上敲減Myo9a基因可導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接閉合蛋白缺失，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏素及β-連環(huán)蛋白的細(xì)胞局限定位遭到破壞，促進(jìn)細(xì)胞的上皮表型改變。

2.4 多聚腺苷酸二磷酸核糖水解酶-1(poly ADP-ribose glycohydrolase，PARG1)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

PARG1是由ARHGAP29基因編碼一種GTP酶活化蛋白，其基因定位于人類(lèi)染色體1p22.1，具有RhoA的GAP結(jié)構(gòu)域，與RhoA具有很強(qiáng)的親和力。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中ArhGAP29的表達(dá)，RhoA/ROCK1表達(dá)下降，并伴隨間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低，細(xì)胞纖維化程度改善，提示ArhGAP29可能參與了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的EMT纖維化過(guò)程[20]。ArhGAP29可以與Rasip1結(jié)合，影響Rap1(Ras相關(guān)蛋白1)誘導(dǎo)的細(xì)胞播散[9]。Rap1是原癌基因Ras超家族成員之一，具有廣泛的細(xì)胞生物學(xué)功能, 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏附以及肌動(dòng)蛋白的重排，參與EMT的發(fā)展[21]。Rap1活化后，誘導(dǎo)Rasip1以及Radil-ArhGAP29復(fù)合物向細(xì)胞膜移動(dòng)，從而形成Rap1-Rasip1-Radil-ArhGAP29復(fù)合物，通過(guò)這種蛋白移位以及多聚體的形成，抑制Rho信號(hào)通路，促進(jìn)應(yīng)力纖維形成，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。細(xì)胞張力的維持對(duì)于增強(qiáng)細(xì)胞屏障功能同樣重要，環(huán)形肌動(dòng)蛋白束需要 AF6、Cdc42及Cdc42GEFs的協(xié)同作用，與Rap1-Rasip1-Radil-ArhGAP29復(fù)合物共同發(fā)揮維持細(xì)胞骨架穩(wěn)定的作用。

2.5 其他

FilGAP (ArhGAP24)是可以與細(xì)絲蛋白A結(jié)合的RhoGAP，其基因定位于人類(lèi)染色體4q22.1，缺乏FilGAP的細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，反之則細(xì)胞極性增加，遷移能力降低，表明FilGAP抑制細(xì)胞能動(dòng)性，增加細(xì)胞收縮及細(xì)胞極性。Rho家族小GTP酶對(duì)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞黏著結(jié)合帶形成非常必要。ARHGAP24可以通過(guò)STAT6-WWP2-p27信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；相反，抑制ARHGAP24可以通過(guò)活化β-連環(huán)素的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。HOX 反義基因RNA髓系1蛋白(HOTAIRM1)可以通過(guò)調(diào)控miR-106a-5p，促進(jìn)ARHGAP24的表達(dá)，進(jìn)一步抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[23]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilGAP可以促進(jìn)Madin-Darby canine kidney (MDCK)細(xì)胞間黏著結(jié)合帶的形成。RNA沉默技術(shù)下調(diào)FilGAP表達(dá)后，可以促進(jìn)MDCK細(xì)胞經(jīng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激后的播散和遷移。相反，過(guò)表達(dá)FilGAP會(huì)抑制細(xì)胞播散及遷移。

Cdc42 GTP酶活化蛋白(CdGAP/ArhGAP31)是富含絲氨酸及脯氨酸的GTP酶活化蛋白，可特異性激活Cdc42和Rac。其基因定位于人類(lèi)染色體13q13.33，CdGAP蛋白充滿帶電荷的氨基酸及絲氨酸殘基，并且具有PKC磷酸化區(qū)域和SH3結(jié)合位點(diǎn)。將CdGAP經(jīng)顯微鏡注射到血清饑餓培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞中，其可以抑制血小板源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的板狀偽足形成及緩激肽誘導(dǎo)的絲狀偽足的生成，影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu),這些偽足的形成均需要經(jīng)Cdc42 及 Rac介導(dǎo)。

Rich1 (ArhGAP17)屬于Cdc42及Rac1特異性RhoGAP，其基因定位于人類(lèi)染色體16p12.1。Rich1可以通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞CDC42/RAC1-PAK1-ERK1/2信號(hào)通路和調(diào)整纖維肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)特征來(lái)影響細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及黏著斑形成。Rich1對(duì)于細(xì)胞間緊密連接的維持非常重要，其可以結(jié)合細(xì)胞骨架蛋白Amot，通過(guò)細(xì)胞間緊密連接與胞內(nèi)蛋白的溝通來(lái)維持細(xì)胞連接的完整性，減少細(xì)胞遷移的發(fā)生。

3 問(wèn)題與展望

如何抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散及逆轉(zhuǎn)組織纖維化病變是目前較為棘手的臨床難題。EMT在腫瘤細(xì)胞侵襲及纖維化疾病的形成中起重要作用，很多研究者試圖通過(guò)調(diào)整EMT過(guò)程中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)及細(xì)胞連接來(lái)改善疾病預(yù)后。RhoGAP作為RhoGTP酶的重要調(diào)節(jié)因子，其對(duì)細(xì)胞骨架及細(xì)胞遷移、侵襲的影響已在多種疾病細(xì)胞系中得到證實(shí)[24]。但很多EMT及RhoGAP研究數(shù)據(jù)僅停留在體外細(xì)胞培養(yǎng)階段，缺乏體內(nèi)系統(tǒng)的評(píng)估。因此，EMT靶點(diǎn)藥物數(shù)據(jù)多為初步探究階段，需要更多的試驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證RhoGAP對(duì)EMT的影響及作用機(jī)制。相信隨著研究的不斷深入，RhoGAP有希望成為EMT的治療靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)及改變細(xì)胞遷移能力，逆轉(zhuǎn)或減輕EMT病理過(guò)程，從而干預(yù)腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，阻斷纖維化疾病的發(fā)展。