微管抑制劑在血管新生性疾病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

方思尹，劉 辰，吳晉暉

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科, 上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院 眼科，上海 200438

血管新生(angiogenesis)受多種細(xì)胞和因子調(diào)控，表現(xiàn)為血管基膜及血管外基質(zhì)降解, 內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，最后生成新血管的過(guò)程。正常的血管系統(tǒng)是一個(gè)嚴(yán)密的網(wǎng)絡(luò)，而病理性血管表現(xiàn)分布不均勻、形態(tài)不規(guī)則，周邊缺乏周細(xì)胞和適當(dāng)?shù)幕?。相比較于正常血管，新生血管不成熟且更加脆弱。在生理情況下, 血管新生對(duì)恢復(fù)血供和促進(jìn)傷口愈合起到積極作用，而病理性血管生成則是各種缺血性和炎性疾病的標(biāo)志。血管生成異常與70多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、眼部疾病和其他疾病等[1]。通過(guò)抑制新生血管生成或阻斷新生血管，治療血管生成異常相關(guān)疾病已成為研究熱點(diǎn)。本文綜述了微管抑制劑在新生血管性疾病中抑制血管生成的機(jī)制。

1 微管的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)作用

微管是真核細(xì)胞骨架的重要組成部分，由α和β微管蛋白的異源二聚體組裝成長(zhǎng)空心聚合物，寬25 nm，長(zhǎng)1～100 nm，異源二聚體被稱(chēng)為微管蛋白二聚體，簡(jiǎn)稱(chēng)為微管蛋白，可通過(guò)α、β-異源二聚體聚合與解聚合的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)揮作用。微管在生長(zhǎng)和收縮階段之間自動(dòng)切換的狀態(tài)，稱(chēng)為動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性[2]。除了在細(xì)胞有絲分裂中起作用外，微管還密切參與各種細(xì)胞生理活動(dòng)，例如，維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞器和囊泡的運(yùn)輸?shù)取?/p>

2 微管抑制劑及種類(lèi)

目前已知的微管抑制劑可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是促進(jìn)微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑，代表藥物為紫杉醇類(lèi)化合物；另一類(lèi)是抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚劑，代表藥物有長(zhǎng)春堿類(lèi)化合物和秋水仙堿類(lèi)化合物。1932年，首次報(bào)道了可口服的微管蛋白結(jié)合劑——秋水仙堿，這種藥物可以提高一組癌癥患者的短期生存率[3]。由于秋水仙堿的副作用較大，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年報(bào)道，微管抑制劑可抑制新生血管形成和破壞現(xiàn)有血管，對(duì)病理性新生血管內(nèi)皮有一定的選擇性[4]。相對(duì)來(lái)說(shuō), 新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架系統(tǒng)不完整，對(duì)此類(lèi)藥物較敏感[5]。將微管抑制劑作為新生血管性疾病的新治療靶點(diǎn)已引起人們重視，越來(lái)越多的高效低毒的微管抑制劑被合成, 其中一些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但其對(duì)新生血管的作用機(jī)制尚不清楚。

3 微管抑制劑抑制新生血管生成

3.1 通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能抑制新生血管生成

血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其功能依賴(lài)于多種細(xì)胞因子及基因表達(dá)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種血管生成的誘導(dǎo)劑，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，最終促進(jìn)血管生成。已證實(shí)在各種類(lèi)型的新生血管性疾病中VEGF過(guò)度表達(dá)，成為一種重要的抗血管生成的治療靶點(diǎn)。另c-Myc基因可以與VEGF協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其過(guò)度表達(dá)常見(jiàn)于各種腫瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等。

天然產(chǎn)物combretastatin A-4(CA-4)及其衍生物是一種極具研究意義的天然微管抑制劑，可通過(guò)抑制VEGF和c-Myc基因，抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖、遷移、及其有絲分裂過(guò)程。CA-4及其衍生物通常對(duì)VEGF基因有較高的抑制活性，其中化合物 L-Met可下調(diào)VEGF基因的表達(dá)超過(guò)55%。大多數(shù)衍生物對(duì)于c-Myc基因也有顯著作用，例Fmoc-L-Ala的衍生物，可將該基因表達(dá)降低22%。還有不少衍生物，如Fmoc-L-Ala、Fmoc-L-Phe及L-Thr對(duì)VEGF和c-Myc基因下調(diào)表達(dá)可超過(guò)60%[6]。另一種人工合成的CA-4衍生物CPU-XT-006也能有效抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增殖，并減少細(xì)胞內(nèi)VEGF的分泌，降低微血管的通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制新生血管生成[7]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種堿性蛋白質(zhì)，該因子具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和促進(jìn)血管生成的作用，與其特異性受體結(jié)合，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶，從而促進(jìn)細(xì)胞代謝和增殖。甲苯達(dá)唑(Mebendazole,MBZ)是一種微管解聚藥物能有效抑制bFGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞內(nèi)bFGF蛋白的分泌，從而抑制血管新生[8]。

Rho蛋白是一組低分子量GTPase的Ras超家族蛋白，具有GTP酶活性，在多種細(xì)胞中高表達(dá)，主要參與張力纖維形成和黏著斑復(fù)合體組裝，在細(xì)胞骨架重組調(diào)控方面起重要作用。RhoA是協(xié)調(diào)f -肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架中的微管相互作用的關(guān)鍵蛋白。CA-4在秋水仙堿位點(diǎn)與微管蛋白的結(jié)合可抑制微管蛋白聚合，激活RhoA。天然微管抑制劑Pretubulysin (PT)引起的微管分解亦可激活RhoA，激活肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的形成和收縮、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的連接分解和增加其通透性，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而發(fā)揮抑制新生血管的作用。磷酸化Combretastatin A4(CA4P)是CA-4的水溶性藥物形態(tài)，可激活RhoA/ROCK/MLC通路，促進(jìn)微管的分解，這與有其助于肌動(dòng)蛋白重構(gòu)和增加滲透性的報(bào)道相一致[9]。

微管抑制劑可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等功能，如名為9i[10]、7m[11]及28g[12]等微管抑制劑，對(duì)抑制HUVEC管狀結(jié)構(gòu)的形成、遷移和侵襲具有顯著作用，并在斑馬魚(yú)模型上其對(duì)新生血管生成的也有抑制作用。

3.2 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及阻滯細(xì)胞周期。

YMR-65是一種具有良好抗癌活性的微管蛋白抑制劑，能與微管蛋白的秋水仙堿結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[13]。合成類(lèi)微管抑制2f誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性[14]，經(jīng)過(guò)化學(xué)外殼裝載后的紫杉醇(paclitaxel，PTX)可有效抑制腫瘤血管，細(xì)胞凋亡率超過(guò)65%，能顯著減少血管的數(shù)量，導(dǎo)致腫瘤血管生長(zhǎng)受限[15]。

一種新的合成型微管抑制劑SAR of novel 3-arylisoquinolinones，與秋水仙堿作用類(lèi)似，能與微管秋水仙堿位點(diǎn)結(jié)合，抑制了微管蛋白聚合，有效地改變了微管組裝和拆卸的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞分裂暫停，細(xì)胞周期阻滯于 G2/M 期，并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，而抑制內(nèi)皮細(xì)胞管樣成形并進(jìn)一步破壞已成形的管樣結(jié)構(gòu)，抑制新生血管的生長(zhǎng)[16]。

HDAC抑制劑為一種新的雜交分子，可破壞微管網(wǎng)絡(luò)，將血管內(nèi)皮細(xì)胞阻滯于G2/M期，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位塌陷，有效抑制HUVEC管樣形成，增殖和遷移。在斑馬魚(yú)模型中顯示出抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移活性[17]。

3.3 多種機(jī)制聯(lián)合作用

TR-764是一種新型的微管蛋白聚合抑制劑，在 HUVEC和雞胚絨毛尿囊膜模型及兩種小鼠腫瘤模型上具有較強(qiáng)的抗血管生成活性。TR-764可與微管蛋白結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致毛細(xì)血管破裂、細(xì)胞通透性增加和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性降低。還可誘導(dǎo)Src和FAK去磷酸化，觸發(fā)Rho激酶和特定分子的信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致Src和FAK失活，并使VE-cadherin/β-catenin解偶聯(lián)的機(jī)制破壞黏附連接和局灶性黏連，并在低氧條件下顯著降低HIF-1α、抑制bFGF對(duì)促血管生成活性[18]。TR-764通過(guò)多種機(jī)制聯(lián)合，阻止血管發(fā)育和抑制新生血管生成。

MT189也是一種新型微管蛋白結(jié)合劑，在低氧或常氧條件下，可降低腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)和分泌。MT189可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2和下游Src的激活。MT189還通過(guò)抑制含有FAK、樁蛋白、紐蛋白和肌動(dòng)蛋白的局灶性黏連的翻轉(zhuǎn)來(lái)破壞內(nèi)皮細(xì)胞-基質(zhì)連接。抑制JNK后，可使得MT189介導(dǎo)的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化的抑制、JNK激活、VEGF表達(dá)和分泌的減少以及Src和FAK磷酸化的減少。這些結(jié)果表明，MT189可能通過(guò)JNK-VEGF /VEGFR2信號(hào)軸減少內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化來(lái)抑制血管生成[19]。

CYT997是一種合成化合物，可以抑制微管聚合，在體外具有高度有效的細(xì)胞毒性活性。CYT997將細(xì)胞周期阻滯在 G2/M期，并且激活Bcl-2磷酸化，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白B1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及自噬，還可通過(guò)增加HUVEC通透性破壞血管[20]。

許多微管抑制劑都可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，但其具體機(jī)制尚未明確。

4 微管抑制劑阻斷形成新生血管

病理性新生血管的特點(diǎn)是內(nèi)皮細(xì)胞增殖率高，缺乏周細(xì)胞，基底膜異常，血管通透性增加，從結(jié)構(gòu)上看，血管結(jié)構(gòu)混亂不完整。在未成熟的病理性血管中，肌動(dòng)蛋白微絲不發(fā)達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞形狀和血管的結(jié)構(gòu)完整性更依賴(lài)于微管。微管的破壞可能會(huì)影響肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架功能，導(dǎo)致病理性血管內(nèi)皮失去完整性，從而減少腫瘤組織的血流量。大多數(shù)微管抑制劑通過(guò)破壞細(xì)胞骨架和細(xì)胞間連接來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形狀的改變，可誘導(dǎo)腫瘤脈管系統(tǒng)發(fā)生快速血管阻塞和大量壞死[21]。

單劑量CA4P給藥后，腫瘤血流在1h內(nèi)減少，血管出現(xiàn)迅速、廣泛和不可逆的閉塞和出血性壞死，大部分微小血管損傷，滲透壓和組織間流體壓力增加，血管直徑顯著減小。血漿滲漏還可增加血液黏度，導(dǎo)致血流減少。另一個(gè)導(dǎo)致血管關(guān)閉的因素是通過(guò)接觸暴露的基底膜成分而激活血小板[22]。VE-cadherin是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性鈣黏蛋白，其功能是穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與鈣依賴(lài)性細(xì)胞間黏附。CA4P可以破壞VE-cadherin的結(jié)合，并抑制VE-cadherin/Akt途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。黏附體連接的破壞有助于內(nèi)皮細(xì)胞聚集，增加毛細(xì)血管中血流的幾何阻力和提高脈管系統(tǒng)滲透壓[22]。 C118P是新合成的另一種CA4類(lèi)似物，可影響HUVEC的微管動(dòng)力學(xué)和其骨架，破壞已建立的血管網(wǎng)絡(luò)，阻斷已成形的血管[23]。

5 微管抑制劑的雙重抗血管作用

微管抑制劑EHT 6706不僅抑制新生血管的形成，還破壞已形成的內(nèi)皮毛細(xì)血管。EHT 6706抑制VE-cadherin/β-catenin復(fù)合物的功能，影響新血管組裝和重塑過(guò)程。EHT 6706還可下調(diào)某些有利于血管生成的基因表達(dá)，如肝細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子 (hepatoma-derived growth factor，HGF)， 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFalpha)等基因；也可上調(diào)具有強(qiáng)效抗血管作用的基因表達(dá)，如ADAMTS9、COL4A1、FN1、TIMP2、NRP1、SPP1、Sema3F、PTPRM、PROX1和PGK1等[24]。

CA-4則可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的出芽和成管，從而抑制新生血管形成及破壞發(fā)育中的血管系統(tǒng)。CA4作用24 h后，導(dǎo)致發(fā)育的受精雞蛋絨毛尿囊膜的血管系統(tǒng)不可逆地閉塞，雞胚死亡率90%；其衍生物2e作用6 h后，可觀察到小血管和毛細(xì)血管的破壞并出血。另CA-4還可抑制血管生長(zhǎng)的關(guān)鍵步驟，即內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠上成管樣生長(zhǎng)[8]。C118P可抑制血管生成并破壞已建立的血管網(wǎng)絡(luò)。此外，還可以誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期停滯和凋亡[23]。

6 問(wèn)題與展望

對(duì)血管新生過(guò)程的進(jìn)一步探索可以更加深入地了解其復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床藥物的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)和思路，揭示微管抑制劑抑制血管機(jī)制，有望為日后的治療提供靶點(diǎn)。目前已有大量微管抑制劑顯示出其強(qiáng)大的新生血管治療作用，其中一部分已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。在眼科領(lǐng)域，微管抑制劑治療眼部新生血管性疾病仍存在空白。基礎(chǔ)研究應(yīng)用于臨床治療必須克服其作用效果受機(jī)體多個(gè)因素影響的障礙。