中性粒細(xì)胞在COVID-19發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展

王 亮，司 萍，沈永明，崔曉鳴

天津市兒童醫(yī)院/天津大學(xué)兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科，天津 300074

COVID-19是由SARS-CoV-2病毒引起，以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。多數(shù)COVID-19患者預(yù)后較好，少數(shù)病例可短時(shí)間內(nèi)快速進(jìn)展并惡化。病毒感染機(jī)體的過程中，免疫(固有免疫和適應(yīng)性免疫)應(yīng)答啟動(dòng)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生可溶性細(xì)胞因子或相應(yīng)的T或B淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)進(jìn)行機(jī)體防御。中性粒細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的第一道防線，被激活后可通過趨化、吞噬、脫顆粒作用以及形成一種特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)-中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)發(fā)揮功能。中性粒細(xì)胞還可以通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和細(xì)胞表面分子與其他免疫細(xì)胞交互作用。但在嚴(yán)重炎性反應(yīng)時(shí)中性粒細(xì)胞不可控地釋放抗微生物物質(zhì)或介導(dǎo)免疫抑制，在執(zhí)行防御功能的同時(shí)也破壞了隨后的機(jī)體免疫功能[2]。目前多項(xiàng)研究報(bào)道提示中性粒細(xì)胞以及NETs的生成與降解可能參與COVID-19的病理過程。現(xiàn)將COVID-19涉及的中性粒細(xì)胞以及NETs的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，進(jìn)而為COVID-19的防治提供新策略和新思路。

1 中性粒細(xì)胞數(shù)量

中性粒細(xì)胞是人類血液中含量最豐富的免疫細(xì)胞，是機(jī)體抵抗病原體感染的第一反應(yīng)者，可通過釋放黏附抗菌蛋白，蛋白水解酶以及活性氧殺滅病原體。并且其表面可表達(dá)多種趨化因子受體和補(bǔ)體受體，具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，自身免疫和急性損傷修復(fù)等功能。中性粒細(xì)胞數(shù)量與COVID-19疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。重癥患者COVID-19患者淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯升高[3]。COVID-19病人在第12天病情惡化之前，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在第11天升高，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)一直維持在較低水平[4]。并且年齡越大，中性粒細(xì)胞數(shù)量越多的COVID-19患者更易發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，甚至死亡[5]。COVID-19患者肺組織中有廣泛的中性粒細(xì)胞浸潤[6]。并且中性粒細(xì)胞激活物(IL-8和G-CSF)和效應(yīng)分子(抵抗素、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和肝細(xì)胞生長因子)是重癥COVID-19患者的早期生物標(biāo)志物，重癥COVID-19患者中一些未成熟和/或功能失調(diào)的中性粒細(xì)胞可能與肺部免疫失衡相關(guān)[7]。眾所周知，機(jī)體免疫調(diào)控是在多種免疫細(xì)胞的共同參與下完成，中性粒細(xì)胞作為非特異性免疫細(xì)胞可能在COVID-19疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，特別對于COVID-19患者由輕癥向重癥以及危重癥發(fā)展的影響值得進(jìn)一步深入研究。臨床工作中要特別注意中性粒細(xì)胞驟然升高的COVID-19患者，以免病情快速惡化。

2 中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值

中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)是近來新發(fā)現(xiàn)的反映全身炎性狀態(tài)的生物標(biāo)志物，其與多種疾病的發(fā)生與預(yù)后密切相關(guān)，且簡單易得而受到重視。NLR可以用來評(píng)估COVID-19患者的病情程度，有助于患者分級(jí)管理。相較于非ICU的COVID-19患者，入住ICU的患者淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，而中性粒細(xì)胞數(shù)量以及NLR明顯升高[8]。重癥COVID-19患者NLR更高表明COVID-19預(yù)后不良[9]。而對于合并糖尿病的COVID-19患者其NLR水平與疾病嚴(yán)重程度以及住院時(shí)間呈正相關(guān)[10]。總之，NLR的監(jiān)測可作為COVID-19進(jìn)展的臨床標(biāo)志物，有助于早期篩查危重型患者。

大部分COVID-19患者淋巴細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯降低，其中包括CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。輕型COVID-19患者的肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)大量CD8+T淋巴細(xì)胞，而在危重型COVID-19患者中，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群消失[11]，提示疾病早期CD8+T淋巴細(xì)胞高度克隆擴(kuò)增有助于病毒清除，出現(xiàn)輕度感染，但隨著疾病進(jìn)展加重，機(jī)體內(nèi)適應(yīng)性免疫應(yīng)答受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致機(jī)體抗病毒能力降低以及炎性反應(yīng)。而嚴(yán)重炎性反應(yīng)時(shí)中性粒細(xì)胞可以表達(dá)引起T細(xì)胞凋亡的表面蛋白而抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，因此COVID-19病程中性粒細(xì)胞與T細(xì)胞之間的作用聯(lián)系值得進(jìn)一步研究。中性粒細(xì)胞/CD8+T淋巴細(xì)胞比值對于判斷重型COVID-19患者預(yù)后以及疾病進(jìn)展具有重要意義[12]。而中性粒細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞比值與SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)陰時(shí)間有關(guān)[13]。中性粒細(xì)胞/CD4+T淋巴細(xì)胞比值升高表明機(jī)體免疫功能差，病毒清除時(shí)間延長?？紤]到COVID-19重癥患者中性粒細(xì)胞數(shù)量升高，淋巴細(xì)胞數(shù)量降低，故而NLR的差異性明顯，但NLR是否可以作為COVID-19死亡率的獨(dú)立預(yù)測因素仍需進(jìn)一步研究。

3 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)

NETs是由中性粒細(xì)胞受到刺激后產(chǎn)生的一種特殊的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由DNA，組蛋白以及一些胞質(zhì)蛋白分子構(gòu)成，包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 (neutrophil elastase，NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，組織蛋白酶G和其他一些抗菌蛋白。SARS-CoV-2能夠直接誘導(dǎo)NETs釋放，這種SARS-CoV-2誘導(dǎo)的NETs釋放是肽?；彼崦搧啺访?依賴的。并且COVID-19患者血漿NETs的濃度與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而重癥患者循環(huán)系統(tǒng)以及肺部感染浸潤的中性粒細(xì)胞能夠釋放高濃度的NETs[14]。SARS-CoV-2感染的患者血漿中NETs明顯增加，而有呼吸衰竭表現(xiàn)的患者NETs濃度更高[15]。COVID-19尸檢的微血管血栓中發(fā)現(xiàn)部分退化性的中性粒細(xì)胞，而這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與NETs一致[16]。而在轉(zhuǎn)錄水平上證實(shí)了COVID-19患者中存在與NETs相關(guān)信號(hào)通路的激活，其中一些可能與NK和T細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)，從而抑制抗病毒反應(yīng)[17]。NETs導(dǎo)致的血管阻塞不僅存在于COVID-19患者的肺組織，也存在于腎臟和肝臟，這意味著COVID-19患者，特別是重癥患者，其器官功能障礙與過度的NETs形成和血管損傷有關(guān)[18]。以上研究結(jié)果說明NETs參與COVID-19進(jìn)程，并發(fā)揮重要作用。

4 病理生理學(xué)機(jī)制

4.1 中性粒細(xì)胞募集

中性粒細(xì)胞的募集通常是趨化因子驅(qū)動(dòng)。SARS-CoV-2感染的人肺上皮細(xì)胞以及COVID-19患者血清中存在CXCL2和CXCL8的高表達(dá)[19]，而COVID-19患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)中也發(fā)現(xiàn)CCL2、CCL3、CCL4以及 CXCL10等細(xì)胞因子高表達(dá)[20]。在ICU的COVID-19患者其血漿中IL-2、IL-7、IL-10、CXCL10、G-CSF、CCL2、CCL3和TNF-α水平高于非ICU患者[21]?；罨姆闻菥奘杉?xì)胞能釋放TNF-α和IL-1β，從而使得肺泡中其他細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，進(jìn)一步激活炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞不斷遷移至肺部[22]。適度的細(xì)胞因子反應(yīng)有助于病毒的清除，而細(xì)胞因子過量時(shí)會(huì)引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，而這些細(xì)胞因子能夠招募更多的中性粒細(xì)胞集中到炎性灶，加劇炎性反應(yīng)，導(dǎo)致明顯的免疫病理損傷。

4.2 中性粒細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)物異常增加

在COVID-19病理進(jìn)程中，中性粒細(xì)胞相關(guān)的一些產(chǎn)物可能參與疾病的病理機(jī)制。COVID-19老年患者肺組織中抗氧化酶超氧化物歧化酶3的表達(dá)水平明顯降低[23]，這反映了機(jī)體氧化應(yīng)激程度加劇以及抗氧化失衡。活化的中性粒細(xì)通過“呼吸爆發(fā)”會(huì)釋放大量的ROS，如氧自由基和H2O2，而過度的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致COVID-19患者機(jī)體中細(xì)胞因子風(fēng)暴，血栓的形成以及T細(xì)胞抑制[24-26]。因此，抗氧化治療對于改善COVID-19患者T細(xì)胞的生存活性和功能，以及減少NETs的形成具有一定的療效。DNA 是NETs的主要結(jié)構(gòu)成分，用脫氧核糖核酸酶(DNase)處理，可以破壞NETs結(jié)構(gòu)完整性。一些病原體通過表達(dá)DNase以降解DNA纖維網(wǎng)，進(jìn)而逃避NETs的識(shí)別。SARS-CoV-2 膿毒癥患者血漿中游離DNA水平升高，而DNase水平顯著降低。通過對模擬SARS-CoV-2誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型外源性給藥發(fā)現(xiàn)，重組長效DNase能夠減少NETs的形成以及降低NF-κB激活和細(xì)胞因子水平，并且組織器官損傷標(biāo)志物水平明顯降低[27]。適當(dāng)DNase可以保護(hù)機(jī)體免受體內(nèi)釋放的不適量NETs對自身組織的破壞作用，但其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。NE是活化的中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶中的主要成分，也是NETs結(jié)構(gòu)重要組成部分。對于表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少癥以及肺損傷評(píng)分<2.5的COVID-19患者早期應(yīng)用NET抑制劑具有一定治療效果[28]，但其安全性有待進(jìn)一步探究。COVID-19血清中檢測到高水平游離DNA、DNA-MPO復(fù)合物和瓜氨酸組蛋白H3(Cit-H3)，其濃度與疾病的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性[15]，并且ARDS的發(fā)生與NETs形成增加有關(guān)[29]。這些與中性粒細(xì)胞相關(guān)密切的物質(zhì)在COVID-19病理進(jìn)程中可能發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，但對于這些物質(zhì)來源是中性粒細(xì)胞發(fā)揮生理功能時(shí)的釋放，還是伴隨NETs的形成而產(chǎn)生尚未完全知曉，但抑制或者減少這些物質(zhì)形成有望成為減緩COVID-19疾病進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)。

4.3 NETs與補(bǔ)體

通過對COVID-19患者肺部尸檢發(fā)現(xiàn)其具有獨(dú)特的血管損傷特征，包括血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)、血栓形成并伴有微血管病變。COVID-19患者血漿中NETs、組織因子(tissue factor,TF)活性和末端補(bǔ)體復(fù)合物(sC5b-9)的水平明顯升高，并且患者的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生高水平的TF，并形成攜帶活性TF的NETs[30]。NETs 含有高濃度的血栓源性TF可能是血栓形成的啟動(dòng)和持續(xù)必需條件。C3和C5抑制劑能夠抑制COVID-19患者的高炎性反應(yīng)狀態(tài)[31]。通過阻斷相應(yīng)的補(bǔ)體途徑，COVID-19患者表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，C-反應(yīng)蛋白，IL-6和血清LDH水平的急劇下降，淋巴細(xì)胞明顯升高以及NETs生成減少。對于COVID-19患者應(yīng)用針對人補(bǔ)體C5a分子的單克隆抗體藥物BDB-001注射液能特異性結(jié)合C5a，使C5a喪失結(jié)合受體的能力，從而抑制炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)[32]。這些結(jié)果提示補(bǔ)體和NETs參與機(jī)體不良的免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎性反應(yīng)和血栓性微血管病變，而針對補(bǔ)體-NETs-血栓軸為靶點(diǎn)的治療策略將為COVID-19提供新的選擇。

5 小結(jié)

中性粒細(xì)胞數(shù)以及NLR升高，不僅反映了COVID-19機(jī)體高炎性狀態(tài)，同時(shí)也可以作為疾病進(jìn)展的預(yù)警因子，臨床工作中要加以重視。盡管關(guān)于中性粒細(xì)胞以及NETs在COVID-19致病機(jī)制中發(fā)揮的作用尚未完全闡明，并且多數(shù)研究處在早期研究階段，但通過已有研究推斷，或許對于COVID-19而言，中性粒細(xì)胞是把“雙刃劍”，不僅發(fā)揮防御的作用，還可以阻礙其免疫功能，加劇炎性反應(yīng)，特別是NETs，當(dāng)其抑制機(jī)制失調(diào)或被過度激活時(shí),它可能會(huì)介導(dǎo)疾病的病理過程，這也為COVID-19治療方面的研究提供新的方向。目前仍然存在較多尚需解決的問題。通過進(jìn)一步的研究，希冀了解中性粒細(xì)胞以及 NETs在COVID-19進(jìn)程中的調(diào)控、功能和病理作用，最終實(shí)現(xiàn)在保持其免疫作用的前提下抑制其損傷屬性從而應(yīng)用于臨床治療。