高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物制備技術(shù)研究

蘇 情，韓 迪，2，田曉閩，3，龔魁杰，劉開(kāi)昌，郭玉秋，陳利容，王興亞

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.煙臺(tái)大學(xué)，山東 煙臺(tái) 264000；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266000；4.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

0 引言

玉米蛋白粉是玉米籽粒經(jīng)濕磨法工藝制得粗淀粉乳，再經(jīng)蛋白質(zhì)分離得到麩質(zhì)水，然后濃縮干燥而制得，又稱(chēng)“黃粉”[1]，作為玉米淀粉生產(chǎn)過(guò)程中最大的副產(chǎn)物，當(dāng)前得到廣泛研究。玉米醇溶蛋白是玉米中的主要儲(chǔ)藏蛋白，可以溶于60%～95%的乙醇-水溶液，玉米蛋白粉中醇溶蛋白占總蛋白質(zhì)的50%～70%[2-3]。玉米醇溶蛋白具有良好的成膜性、生物降解性、抗氧化性、黏結(jié)性和凝膠性等，使其在復(fù)合膜、包埋劑、乳化劑、生物活性肽等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[4-5]。研究表明[6]，酶解改性可以改善玉米醇溶蛋白的功能特性，張瑞等人[7]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶解處理后的分子量小于1 000 Da的蛋白短肽抗氧化性明顯增強(qiáng)，有利于擴(kuò)大醇溶蛋白的應(yīng)用范圍。

玉米黃色素是一種純天然的色素，有著極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不但有抗菌消炎、防治心血管疾病、降血脂、降血壓、抗突變等功效，而且還能夠抗衰老、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗癌、防癌。直接從玉米籽粒中提取玉米黃色素存在困難[8]，從玉米蛋白粉中共提取醇溶蛋白和黃色素，可以節(jié)約資源，減少醇溶蛋白、黃色素分別提取造成的環(huán)境污染。因此，基于玉米醇溶蛋白-黃色素共提取技術(shù)優(yōu)化，通過(guò)酶解處理制備高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物，能夠?yàn)橛衩赘碑a(chǎn)物深加工技術(shù)和高值化利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供；L-谷胱甘肽（還原型）、β-胡蘿卜素，上海源葉生物科技有限公司提供；其余試劑均為分析純。

AL104型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器-SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮公司產(chǎn)品；SHA-B型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器，天津賽得利斯公司產(chǎn)品；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；BACO-3E型真空冷凍干燥儀，德國(guó)Zirbus公司產(chǎn)品；液相色譜儀，安捷倫公司產(chǎn)品；Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白-黃色素提取條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取去淀粉的玉米蛋白粉3 g，中間條件控制為時(shí)間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶10，溫度60℃。分別測(cè)定溫度為20，40，60，80℃；時(shí)間為20，60，120，180，240 min；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，70%，80%，90%，95%；料液比為1∶3，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20對(duì)玉米醇溶蛋白-黃色素復(fù)合物含量的影響。分別利用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量，比色法測(cè)定黃色素含量（用β-胡蘿卜素做標(biāo)準(zhǔn)曲線）。

（2）正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)玉米醇溶蛋白和黃色素含量的四因素三水平的正交試驗(yàn)，選用L9（34）正交表進(jìn)行相應(yīng)的正交試驗(yàn)，計(jì)算每次試驗(yàn)醇溶蛋白或黃色素的含量，可以得到正交試驗(yàn)的最佳參數(shù)。

醇溶蛋白正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，黃色素正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表1 醇溶蛋白正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 黃色素正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.2 玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的制備

取適量1.2.1最佳條件提取的玉米醇溶蛋白-黃色素復(fù)合物，按料液比1∶20，pH值9.0，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g，溫度50℃，酶解2 h，100℃下滅酶10 min，冷卻后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，除去大分子物質(zhì)，上清液凍干，制備得到堿性蛋白酶改性玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物，產(chǎn)物標(biāo)記為“堿”。依據(jù)此方法，中性蛋白酶處理?xiàng)l件為pH值7.0，酶添加量3 000 U/g，溫度50℃，產(chǎn)物標(biāo)記為“中”。胰凝乳蛋白酶處理?xiàng)l件為pH值8.0，酶添加量10 000 U/g，溫度37℃，產(chǎn)物標(biāo)記為“胰”，堿性蛋白酶加中性蛋白酶復(fù)合處理組酶解順序?yàn)橄葔A性后中性，產(chǎn)物標(biāo)記為“堿+中”，堿性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復(fù)合處理組產(chǎn)物標(biāo)記為“堿+胰”。

1.2.3 醇溶蛋白含量測(cè)定方法

使用國(guó)標(biāo)GB 5009.5—2016方法測(cè)定醇溶蛋白含量。

1.2.4 黃色素含量測(cè)定方法

參考李曉玲等人[8]的方法測(cè)定黃色素含量。

1.2.5 玉米醇溶蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布測(cè)定

參考Chen K等人[9]的方法，采用高效液相色譜法測(cè)定玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布。

1.2.6 玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物DPPH清除率測(cè)定

參考劉速速等人[10]的方法，將酶解后的樣品配置成10 mg/mL的溶液，取稀釋液2 mL，加入濃度為0.1 mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，以谷胱甘肽作對(duì)照組。清除率計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

試中：Ac——用無(wú)水乙醇代替樣品液時(shí)的吸光度；

Aj——加樣品用無(wú)水乙醇代替DPPH時(shí)的吸光度；

Ai——加樣品與DPPH時(shí)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

溫度對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，其他條件一定時(shí)，隨著溫度的升高，提取出蛋白含量和黃色素含量均呈先增加后降低趨勢(shì)，且均在60℃時(shí)表現(xiàn)出最佳提取率。因此，醇溶蛋白和黃色素正交試驗(yàn)溫度因素均采用50，60，70℃這3個(gè)水平。

2.2 時(shí)間對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

時(shí)間對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

由圖2可知，其他條件一定時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取醇溶蛋白含量和黃色素含量均呈先增加后降低趨勢(shì)，且均在120 min時(shí)表現(xiàn)出最佳提取率。因此，醇溶蛋白和黃色素正交試驗(yàn)時(shí)間因素均采用60，120，180 min這3個(gè)水平。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

由圖3可知，其他條件一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取出蛋白含量呈先增加后降低趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)表現(xiàn)出最佳提取量，黃色素含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%時(shí)，黃色素含量最高，為0.18 mg/g。因此，醇溶蛋白正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)因素采用65%，75%，85%這3個(gè)水平；黃色素正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)因素采用75%，85%，95%這3個(gè)水平。

2.4 料液比對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

料液比對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)醇溶蛋白和黃色素含量的影響

由圖4可知，其他條件一定時(shí)，隨著料液比的增加，提取醇溶蛋白含量呈先增加后降低趨勢(shì)，在料液比為1∶10時(shí)表現(xiàn)出最佳提取量，為1 654.42 mg。黃色素含量隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，黃色素提取率為最高，為0.193 mg/g。因此，醇溶蛋白正交試驗(yàn)料液比因素采用1∶8，1∶10，1∶12這3個(gè)水平；黃色素正交試驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)因素采用1∶8，1∶10，1∶12這3個(gè)水平。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

醇溶蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表3 醇溶蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，對(duì)于醇溶蛋白的影響因素程度大小順序?yàn)榱弦罕取狄掖俭w積分?jǐn)?shù)〉溫度〉時(shí)間，即溫度70℃，時(shí)間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶12。

黃色素正交試驗(yàn)結(jié)果分析黃色素見(jiàn)表4。

由表4可知，對(duì)于色素影響程度大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)〉料液比〉時(shí)間〉溫度，即溫度60℃，時(shí)間180 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶12。

表4 黃色素正交試驗(yàn)結(jié)果分析黃色素

綜合考慮醇溶蛋白與色素的影響因素，由于色素含量很低，制定最佳條件仍然以醇溶蛋白為主導(dǎo)，最終確定提取條件為溫度70℃，時(shí)間120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶12。在此條件下，提取出來(lái)的醇溶蛋白的含量為1 811.6 mg，提取率可達(dá)60.73%，黃色素提取量可達(dá)到0.37 mg/g，均保持較高水平。

2.6 玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布

玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布見(jiàn)圖5。

圖5 玉米醇溶蛋白短肽的分子量分布

利用蛋白酶法獲得不同分子量分布的蛋白水解物，是提高玉米醇溶蛋白抗氧化活性的常用方法[11]。根據(jù)液相色譜結(jié)果得到了玉米醇溶蛋白具體分子量分布范圍。如圖5所示，經(jīng)蛋白酶處理的玉米醇溶蛋白短肽的分子量范圍基本分布在1 000 Da以下。有研究表明[12]，分子量在1 000 Da以下的低聚肽，抗氧化性較強(qiáng)，且極易被人體吸收。根據(jù)李艷紅[13]的研究，多肽分子量在500～1 000 Da時(shí)，抗氧化性更明顯。因此，根據(jù)圖5，玉米醇溶蛋白短肽含量在500～1 000 Da的百分比的結(jié)果可知，不同蛋白酶處理組抗氧化性高低排序?yàn)橐取祲A+胰〉堿+中〉中〉堿。

2.7 玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的DPPH自由基清除率

玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的DPPH自由基清除率見(jiàn)圖6。

由圖6可看出，樣品質(zhì)量濃度均為10 mg/mL時(shí)，谷胱甘肽的DPPH自由基清除率為93.94%，玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的DPPH自由基清除率均低于谷胱甘肽，其中堿+胰組DPPH自由基清除率最高，達(dá)到84.10%，除胰組之外，抗氧化活性結(jié)果與2.6結(jié)果一致。因此，經(jīng)堿性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復(fù)合酶解處理玉米醇溶蛋白-黃色素復(fù)合物為制備高抗氧化性玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的最佳酶解法。

圖6 玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物的DPPH自由基清除率

3 結(jié)論

從玉米蛋白粉中共提取玉米醇溶蛋白-黃色素的最佳條件為溫度70℃，時(shí)間120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，料液比1∶12，玉米醇溶蛋白提取率可達(dá)60.73%，黃色素提取量可達(dá)到0.37 mg/g。為進(jìn)一步提升共提物抗氧化活性，采用堿性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復(fù)合酶解方法，制備高抗氧化活性玉米醇溶蛋白短肽-黃色素復(fù)合物，DPPH自由基清除率達(dá)到84.10%。下一步需要繼續(xù)開(kāi)展復(fù)合物更多功能活性研究，促進(jìn)玉米蛋白粉綜合利用。