耐鹽堿土曲霉SYAT-1 的分離鑒定及抑制植物病原真菌特性研究

王鳳婷 王巖 孫穎 崔文婧 喬凱彬 潘洪玉 劉金亮

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062）

土壤鹽漬化嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及資源環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，中國是鹽堿地大國，現(xiàn)有鹽堿土約3 600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%［1］。不合理開墾荒地、灌溉農(nóng)業(yè)措施不當(dāng)、農(nóng)藥化肥過度使用、設(shè)施土壤栽培等都會導(dǎo)致土壤次生鹽漬化的形成，同時還會加劇植物病蟲害的發(fā)生［2-3］。鹽堿地資源可持續(xù)利用對國家生態(tài)環(huán)境建設(shè)和后備耕地資源開發(fā)具有重要的戰(zhàn)略意義，利用生態(tài)友好且高效的途徑改良鹽堿地，是當(dāng)前推動農(nóng)業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境恢復(fù)的重要舉措［4］。

鹽堿地作為具有獨特土壤理化性質(zhì)的極端生態(tài)系統(tǒng)，存在大量耐（嗜）鹽微生物，這些微生物由于長期在鹽堿環(huán)境中共存與進化，形成了極為特殊的生物學(xué)特性，并產(chǎn)生具有特殊生物活性的物質(zhì)，因此具有重要的利用和開發(fā)價值［5］。目前，隨著耐（嗜）鹽堿微生物資源發(fā)掘，人們開始將這些嗜鹽耐堿菌應(yīng)用于高鹽堿環(huán)境中的治理。在利用微生物改良鹽堿土的過程中，為了最大化發(fā)揮可利用微生物的可持續(xù)性和環(huán)境友好性，對這些微生物進行深入研究尤為必要。大多數(shù)嗜鹽真菌生活在海鹽水體、海濱和高鹽濃度的內(nèi)陸陸地土壤中，有些耐（嗜）鹽堿曲霉屬（Aspergillus）及其有性態(tài)（Eurotium）真菌具有耐鹽性，但目前發(fā)現(xiàn)的耐（嗜）鹽堿曲霉還比較少［6-8］。

生物防治是植物病害防治的重要措施之一，目前已有木霉菌、解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、沙雷氏菌、鏈霉菌等多種微生物對植物病原菌拮抗作用的相關(guān)報道［9-11］。生物菌劑可以減少或部分替代化學(xué)農(nóng)藥的使用，既能有效防治植物病害，又可避免化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來的負(fù)面效應(yīng)。

土曲霉（Aspergillus terreus）是一種廣泛存在于陸地環(huán)境和海洋環(huán)境中的真菌，能夠產(chǎn)生丁內(nèi)酯類、土震素類、木脂素類、雜萜類等特征代謝產(chǎn)物，具有耐（嗜）鹽、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降低膽固醇、抑制α-葡萄糖苷酶、β-淀粉酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰膽堿酯酶等活性［12］。目前尚未發(fā)現(xiàn)土曲霉拮抗植物病原真菌的報道。

本研究從吉林省松原市典型蘇打鹽堿地分離到1 株耐鹽堿土曲霉SYAT-1，通過形態(tài)特征觀察和ITS-rDNA 序列分析，對該菌株分類地位進行了鑒定，并對該菌株不同pH 生長特性、耐鹽性、拮抗植物病原真菌活性和潛在致病性進行研究，以期為利用微生物改良鹽堿土和植物病害生物防治提供新的菌株資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 分離菌株的土壤樣品采自吉林省松原市典型蘇打鹽堿地（123°97′-124°02′E，44°03′-45°02′N）。選取該地高度鹽堿化地塊，取土壤表層2 cm 以下土壤，裝入已滅菌處理的玻璃瓶，帶回實驗室置于4℃低溫冰箱中備用。供試植物病原真菌6種，包括核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、玉米小班病菌（Cochliobolus heterostrophus）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae），均由吉林大學(xué)有害生物綜合防治研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂20 g/L，121℃濕熱滅菌20 min。PDA選擇性培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基中加入10% NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），調(diào)節(jié)pH為8.0-9.0。

真菌基因組提取試劑盒、PCR 擴增試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，普通DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、DL2000 DNA marker、PMD18-T 克隆載體、T4 DNA 連接酶、PCR 引物等試劑均購自上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離及篩選 采用稀釋涂布法分離菌株。分別稱取10 g 鹽堿土壤樣品放入裝有90 mL 無菌水的250 mL 錐形瓶中，180 r/min 搖床振蕩1 h，靜置后得到樣品混合液。樣品混合液分別稀釋10 倍、100 倍、1 000 倍3 個梯度，取0.1 mL 稀釋液均勻涂布于選擇性培養(yǎng)基上，每梯度3 個重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取菌落形態(tài)差異明顯的真菌菌落進行平板劃線法純化獲得純培養(yǎng)物，純化過后的菌株轉(zhuǎn)接至含10% NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的PDA 培養(yǎng)基斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 將分離純化得到的菌株采用點接法接種到新的PDA 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6 d，觀察菌落形態(tài)。用挑針挑取菌落表層菌絲，制成臨時玻片，顯微觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲形態(tài)。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 菌株基因組DNA 提取按照真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（上海生工生物公司）使用說明進行。利用ITS-rDNA 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），按 照Taq PCR Mix（上海生工生物公司）使用說明進行PCR 擴增，PCR 反應(yīng)條件參考文獻［13］。測序由上海生工生物公司完成，將獲得的ITS-rDNA 序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫Blast 進行比對，核苷酸序列同源性比較和分析采用DNASTAR Lasergene17.0.2.1 軟件，利用MEGA 7.0軟件中Maximum Likelihood 法構(gòu)建24 種曲霉屬真菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4 菌株不同pH 生長特性測定 在28℃將菌株等量菌餅分別接種到pH 7.0-12.0 PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8 d 觀察菌落生長情況并測量不同pH 培養(yǎng)基上菌落直徑。

1.2.5 菌株耐鹽性測定 配制梯度NaCl 含量的PDA培養(yǎng)基，其鹽濃度由10 mg/mL 增加到20 mg/mL，每級增加2.5 mg/mL，以不添加NaCl 的PDA 培養(yǎng)基為對照。將等量的菌餅接種于培養(yǎng)基中心位置，在28℃，最適pH 值條件下培養(yǎng)24 d觀察菌落生長情況，并測量不同鹽濃度的培養(yǎng)基上菌落直徑。同樣，配制NaHCO3濃度分別為0、2 和4 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基，在28℃最適pH 值條件下培養(yǎng)10 d 觀察菌落生長情況，并測量不同鹽濃度的培養(yǎng)基上菌落直徑。

1.2.6 菌株拮抗植物病原真菌測試 采用平板對峙培養(yǎng)法測定分離菌株對核盤菌、禾谷鐮孢、灰葡萄孢、玉米小班病菌、玉米大斑病菌和稻瘟病菌等植物病原真菌的拮抗作用［14］。在直徑為9 cm PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，相距4.5 cm 兩點（距離培養(yǎng)皿中心分別為2.25 cm）分別接種直徑為0.5 cm 的分離菌株和植物病原菌株圓形菌餅，以只接種植物病原真菌的PDA 培養(yǎng)基為對照。每個處理設(shè)置3 次重復(fù)，于25℃恒溫培養(yǎng)7 d，測量病原菌菌落半徑，并計算抑菌率。

抑菌率（%）=［（對照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/ 對照組菌落半徑］×100%

1.2.7 菌株潛在致病性測試 分別將分離菌株和核盤菌菌餅接種到大豆、煙草和番茄葉片，每種植物接種3 個葉片，先保濕24 h，再于正常條件下培養(yǎng)3 d 后觀察葉片發(fā)病癥狀。將分離菌株和玉米大斑病菌孢子懸浮液（孢子濃度為1×106個/mL）接種玉米葉片，以20%吐溫水為對照，先保濕24 h，再于正常條件下培養(yǎng)3 d 后觀察葉片發(fā)病癥狀。

2 結(jié)果

2.1 菌株SYAT-1的分離

本研究從吉林省松原市典型蘇打鹽堿地采集土樣12 份，采用稀釋涂布法分離并純化獲得21 株真菌菌株（表1），經(jīng)篩選獲得一株耐鹽堿抗植物病原真菌的菌株并編號為SYAT-1。

表1 采集與分離的真菌菌株Table 1 Collected and isolated fungal strains

2.2 菌株SYAT-1的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)鑒定 篩選得到的菌株SYAT-1 在PDA 平板上28℃條件下培養(yǎng)6 d 后，形成白色略帶土黃色絨毛狀密集菌絲體，呈圓形或近圓形，邊緣不整齊，中心稍隆起。分生孢子梗直柱狀，頂端膨大呈球形頂囊，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；叫忻芗陧斈疑习氩?，分生孢子為單胞，球形或近球形（圖1）。

圖1 菌株SYAT-1 形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristics of strain SYAT-1

2.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定 對純化的菌株提取DNA 進行PCR 擴增ITS-rDNA 片段，經(jīng)序列測定分析表明，片段大小為541 bp，在NCBI 上用Blastn軟件與GenBank 中己知的基因序列進行同源性比較，菌株SYAT-1 與其他23 株己報道的曲霉屬菌株的同源性達70.2%-100%，與土曲霉（A. terreus）（KT899793.1, MH047280.1）菌株的同源性高達100%（圖2）。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，菌株SYAT-1 與A. terreus（KT899793.1, MH047280.1） 組成一進化簇。

圖2 基于ITS-rDNA 核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on ITS-rDNA nucleotide sequences

綜合以上形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，該菌株為土曲霉（A. terreus）。將該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 21021。

2.3 菌株SYAT-1不同pH生長特性測定

在28℃不同pH 的培養(yǎng)基中菌株SYAT-1 開始生長的時間不同，培養(yǎng)1 d 后pH 7.0-10.0 都長出菌落，2 d后pH 11.0和pH 12.0長出菌落。在pH 7.0-12.0的PDA 培養(yǎng)基上均可以生長，表明菌株SYAT-1 可適應(yīng)的pH 范圍為pH 7.0-12.0。菌株SYAT-1 在不同pH 的PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d 的生長曲線表明，其生長最適pH 范圍為7.0-9.0（圖3）。

圖3 菌株SYAT-1 在不同pH 下生長Fig. 3 Growth of strain SYAT-1 at different pH

2.4 菌株SYAT-1耐鹽性測定

菌株SYAT-1 在梯度NaCl 含量的PDA 培養(yǎng)基上，在28℃，最適pH 值條件下培養(yǎng)24 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在28℃下菌株SYAT-1 在0-17.5 mg/mL NaCl PDA 培養(yǎng)基上均能生長，但在20 mg/mL NaCl PDA 培養(yǎng)基上不能生長。其中菌株在無NaCl PDA 培養(yǎng)基上生長最快，隨著鹽濃度增加菌落生長緩慢（圖4）。

圖4 菌株SYAT-1 28℃不同濃度NaCl 濃度生長情況Fig. 4 Growth of strain SYAT-1 at 28℃ with different concentrations of NaCl

在28 ℃最適pH 值條件下培養(yǎng)10 d，菌株SYAT-1 在2、4 mg/mL NaHCO3的PDA 培養(yǎng)基均能生長，其中菌株在不含NaHCO3的 PDA 培養(yǎng)基上生長最快，隨著鹽濃度增加菌落生長緩慢（圖5）。綜合菌株SYAT-1 在梯度NaCl 和NaHCO3含量的PDA培養(yǎng)基生長情況，該菌株屬于耐高鹽特性的真菌。

圖5 菌株SYAT-1 28℃不同濃度NaHCO3 下生長情況Fig. 5 Growth of strain SYAT-1 at 28℃ with different concentrations of NaHCO3

2.5 菌株SYAT-1拮抗植物病原真菌分析

通過菌株SYAT-1 對6 種不同植物病原真菌菌株的離體抑菌率測定，結(jié)果表明，菌株SYAT-1 對供試植物病原真菌均有一定的抑制效果，抑菌率為21.57%-50.59%，具有廣譜抑制作用，其中對玉米大斑病菌抑菌率最高，為50.59%，顯著高于對其他病原真菌的抑菌率（P<0.05）（圖6，表2）。

表2 菌株SYAT-1 對6 種植物病原真菌的抑菌率Table2 Inhibition rates of strain SYAT-1 against six plant pathogenic fungi

圖6 菌株SYAT-1 對不同病原真菌的拮抗效果Fig. 6 Antagonistic effect of strain SYAT-1 against different pathogenic fungi

2.6 菌株SYAT-1潛在致病性測試

菌株SYAT-1 接種大豆、煙草、番茄和玉米葉片潛在致病性測試結(jié)果（圖7）顯示，菌株SYAT-1和核盤菌菌餅接種后，保濕培養(yǎng)24 h 再正常培養(yǎng)3 d 后，接種核盤菌的葉片出現(xiàn)不同程度壞死病斑，而菌株SYAT-1 均無明顯病斑出現(xiàn)。菌株SYAT-1 和玉米大斑病原菌孢子懸浮液接種到玉米葉片上，保濕24 h 再正常培養(yǎng) 3 d 后，接種玉米大斑病菌部位產(chǎn)生枯死斑，而接種菌株SYAT-1 和20% Tween-20水的部位均無明顯病斑。因此，可以明確菌株SYAT-1 對以上 4 種供試植物無潛在的致病性。

圖7 菌株SYAT-1 潛在致病性測試Fig. 7 Potential pathogenicity test of the strain SYAT-1

3 討論

近年來，隨著耐（嗜）鹽堿微生物資源的發(fā)掘和利用，通過微生物改良鹽堿地的方法越來越多。鹽堿環(huán)境中的微生物在長期進化過程中形成了獨特適應(yīng)性和生物學(xué)特性，因此成為微生物改良鹽堿地的首選［5，15］。本研究從吉林省松原市典型蘇打鹽堿地土壤中分離到1 株耐鹽堿真菌菌株SYAT-1，該菌株在pH 7.0-12.0、0-17.5 mg/mL NaCl 及0-4 mg/mL NaHCO3的PDA 培養(yǎng)基均能生長，顯示出耐高鹽堿特性，為利用微生物改良鹽堿土提供菌株資源。大多數(shù)嗜鹽真菌生活在海洋和高鹽陸地土壤中，大量關(guān)于生物多樣性和生理學(xué)的研究都集中在表征上。研究表明曲霉屬（Aspergillus）及其有性態(tài)（Eurotium）真菌具有耐（嗜）鹽堿特性［6］，但目前報道的耐（嗜）鹽堿曲霉屬真菌相對較少。Kis-Papo 等［7］從死海及周邊環(huán)境中分離得到的黑曲霉（A. niger）和雜色曲霉（A. versicolor）在純死海海水中可分別存活3 周和8 周。劉曉丹等［16］從曬鹽場鹽池周邊野生植被上分離得到的耐鹽曲霉具有極強的耐鹽性，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達31%的極端環(huán)境中也能生長。鄭曉梅等［17］從青島海邊鹽土土樣中篩選得到1 株黑曲霉（A. niger），能夠分泌有機酸，具有較好耐鹽能力，在鹽堿地改良中具有較好的應(yīng)用潛力。李學(xué)平等［18］從黃河三角洲鹽堿化根際土壤中篩選到1 株解磷塔賓曲霉（A. tubingensis）。這些耐鹽堿曲霉屬真菌的研究為微生物改良和利用提供理論基礎(chǔ)和寶貴資源。

在利用微生物改良鹽堿土方面，只靠單一功能的微生物并不能解決問題，應(yīng)挖掘和開發(fā)兼具多種功能的微生物。目前，土曲霉真菌的研究多數(shù)都是集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，研究其次生代謝產(chǎn)物抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等功能和利用［12］，在抗植物病原物方面的研究還未見報道。本研究從鹽堿土中分離的土曲霉真菌SYAT-1 對植物病原真菌有很好的抑制效果，為鹽堿地作物真菌病害的生物防治奠定基礎(chǔ)。植物病害生物防治具有綠色、安全、無污染等優(yōu)勢，可有效減少化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的影響，是目前極具應(yīng)用潛力的防治措施之一。目前關(guān)于曲霉屬真菌防治植物病原物的報道多集中在海洋曲霉抗菌活性的研究，海洋曲霉屬是海洋真菌中抑制植物病原真菌的優(yōu)勢屬之一［9,19］，已報道的具有抗植物病原真菌活性的海洋曲霉有短棒曲霉（A. clavatonanicus）MF-13［20］、雜色曲霉（A. versicolor）D5［19］、煙曲霉（A.fumigatus）D17［19］、曲 霉（Aspergillussp.）D20［19］、文氏曲霉（A. wentiiEN-48）［21］、阿拉巴馬曲霉（A.alabamensis）［22］、聚多曲霉（A. sydowii）［22］和構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）［22］等。除了海洋曲霉外，李祝等［23］發(fā)現(xiàn)黑曲霉能拮抗植物病原菌，并創(chuàng)制了黑曲霉菌劑新產(chǎn)品。這些曲霉真菌為微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥的研發(fā)提供重要的先導(dǎo)化合物來源。

曲霉屬真菌的部分種是人體、動物和植物重要的致病菌，如黃曲霉（A. flavus）侵染糧食作物、食品和飼料引起霉變，產(chǎn)生黃曲霉毒素［24］；黑曲霉（A.niger）是棗果霉?fàn)€病的優(yōu)勢致病菌［25］。關(guān)于土曲霉（A. terreus）研究多集中于次生代謝用于臨床重要藥物研發(fā)方面［12］，未見其對植物具有致病性的報道。本研究獲得土曲霉真菌SYAT-1，對供試4 種作物無潛在致病性，綜合其抗病原真菌特性，該菌株在鹽堿地作物真菌病害生物防治中具有潛在應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究從典型蘇打鹽堿地土壤中分離到1 株耐鹽堿真菌菌株SYAT-1，鑒定為土曲霉（A. terreus）。該菌株在堿性（pH 7.0-12.0）、0-17.5 mg/mL NaCl及0-4 mg/mL NaHCO3的PDA 培養(yǎng)基均能生長。該菌株抑菌普廣，對玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和灰葡萄孢等植物病原真菌均有抑制作用，抑菌率21.57%-50.59%。該菌株對植物無潛在的致病性。