過表達(dá)CaCP1 提高轉(zhuǎn)基因煙草對鹽脅迫的敏感性

杜清潔 周璐瑤 楊思震 張嘉欣 陳春林 李娟起 李猛 趙士文肖懷娟 王吉慶

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，鄭州 450002；2. 河南省鋤禾園林草業(yè)服務(wù)有限公司，鄭州 450000）

辣椒（Capsicum annuumL.）是一類重要的蔬菜作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。隨著辣椒設(shè)施栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，復(fù)種指數(shù)高、大量使用化肥、土壤蒸發(fā)快等不利因子的影響，造成土壤鹽漬化嚴(yán)重，迫使辣椒植株遭受鹽脅迫，最終影響該產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

前人研究結(jié)果表明，土壤次生鹽漬化可破壞植物活性氧（reactive oxygen species, ROS）的動態(tài)平衡，引起植物營養(yǎng)缺乏、氧化脅迫和離子失衡等一系列問題，已成為限制設(shè)施園藝作物正常生長發(fā)育的重要環(huán)境脅迫因子之一［1-2］。Varga 等［3］發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到鹽脅迫時，抗氧化酶系統(tǒng)保護(hù)細(xì)胞免受過量產(chǎn)生的ROS 的傷害；Cappetta 等［4］和M?ller 等［5］研究發(fā)現(xiàn)植物中蛋白酶通過水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多肽分子，調(diào)節(jié)植物受脅迫下的ROS 信號傳導(dǎo)，保證植物在鹽脅迫下的生長發(fā)育。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下植物的蛋白酶活性顯著增加［6-7］。半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteases, CPs）是植物蛋白酶的一個重要家族，研究發(fā)現(xiàn)其在蛋白質(zhì)的降解和調(diào)節(jié)ROS水平中起著至關(guān)重要的作用［8-9］。Deng 等［10］發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下，苜蓿的MtCP77在ROS 積累、PCD 和根瘤衰老過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Rodríguez-Herva 等［11］研究表明，煙草半胱氨酸蛋白酶HopN1 可以有效減少鹽脅迫下葉綠體中ROS 的積累。

目前，CPs 家族基因的功能在辣椒中研究較少，前期研究初步發(fā)現(xiàn)沉默辣椒中的CaCP1可以提高辣椒的耐鹽性［12］，但CaCP1穩(wěn)定遺傳后的功能未進(jìn)一步研究。本研究通過對CaCP1啟動子5′端缺失GUS 表達(dá)載體的瞬時表達(dá)試驗，分析CaCP1在鹽脅迫下的主要轉(zhuǎn)錄活性片段。將辣椒CaCP1進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，以T3代轉(zhuǎn)基因植株為材料，分析其在鹽脅迫下的功能，為提高辣椒的抗鹽性提供潛在的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒品種為‘B12’（var.grossum（L）. Sendt），用于CaCP1的cDNA 序列和啟動子序列的克隆，煙草‘本氏’品種（Nicotiana benthamiana）用于CaCP1啟動子的瞬時表達(dá)，煙草‘百日紅’品種（NicotianatabacumL.）用于CaCP1的遺傳轉(zhuǎn)化，以上材料均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施栽培研究課題組提供和保存。

1.2 方法

1.2.1CaCP1啟動子GUS 表達(dá)載體構(gòu)建及其煙草瞬時表達(dá) 構(gòu)建CaCP1啟動子5′端缺失GUS 表達(dá)載體，將基因的轉(zhuǎn)錄起始位點指定為-1，從辣椒基因庫中獲得上游區(qū)域（2 086 bp，-2 086--1 bp），利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/PlantCARE /html/）預(yù)測CaCP1啟動子的逆境順式作用元件。根據(jù)順式作用元件的位置，將CaCP1啟動子片段分為4 段（-2 086、-1 540、-980 和-410--1 bp），分別設(shè)計包含EcoR Ⅰ和SalⅠ酶切位點的擴(kuò)增引物（表1），將其分別與植物表達(dá)載體pCAMBIA 1381-GUS（圖1-A）連接。經(jīng)雙酶切驗證后，送上海生工生物公司測序。

用凍融法將p1381、p1381-35S 和CaCP1啟動子質(zhì)粒（p1381-P1、p1381-P2、p1381-P3 和p1381-P4）分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101［13］。將含有不同長度啟動子片段的轉(zhuǎn)化菌液，用無菌注射器以全葉片注射方式接種6-8 周齡的本氏煙草葉片（除生長點的葉片），置于人工氣候箱，18℃黑暗培養(yǎng)2 d，具體方法參照Xu 等［14］和Yang 等［15］。

1.2.2CaCP1植物超表達(dá)載體PVBG2307-CaMV35SCaCP1 的構(gòu)建及其煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 設(shè)計包含XbaI和KpnI 酶切位點的引物（表1），PCR 擴(kuò)增得到完整CaCP1的ORF 序列，將其與PVBG2307-GFP 連接，構(gòu)建PVBG2307-CaMV35S-CaCP1植物表達(dá)載體（圖1-B），用凍融法將PVBG2307-CaMV35S-CaCP1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101［11］。用葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，具體方法參照Yin 等［16］和Hoekema 等［17］。

圖1 載體示意圖Fig. 1 Schematic of vectors

表1 本文中的引物堿基序列Table 1 Primer base sequences used in this study

1.2.3 瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)基因煙草植株的鹽脅迫處理本氏煙草暗培養(yǎng)2 d，150 mmol/L NaCl 溶液澆透基質(zhì)，對照煙草不做任何處理，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)正常生長，24 h 后取樣，一部分鮮樣直接進(jìn)行GUS 染色，另取一份葉片液氮速凍后-80℃保存，用于GUS的定量表達(dá)。

為研究鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草植株的影響，將T3轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株均播種于基質(zhì)中，待長至兩葉一心，從基質(zhì)中拔出洗凈根系后轉(zhuǎn)入1/4 霍格蘭氏營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)至6-8 片真葉時，分別加入200 mmol/L NaCl 溶液進(jìn)行脅迫處理，觀察葉片的表型變化，并在處理0、1、6 和12 d 后收集第3、4 節(jié)位的葉片，一部分樣品液氮速凍后-80℃保存，用于測定煙草脅迫相關(guān)基因的定量表達(dá)或生理相關(guān)指標(biāo)（SOD、POD 和CAT 活性，以及脯氨酸和MDA的含量），一部分鮮樣用于葉綠素含量、相對含水量和電導(dǎo)率的測定。試驗設(shè)置3 個重復(fù)。

1.2.4 煙草葉片GUS 組織化學(xué)染色及GUS定量分析 分別取3 片注射含有不同長度CaCP1啟動子菌液的煙草葉片，剪切成細(xì)條（1-3 mm）混合，加入GUS 染色液（Coollaber 公司），完全浸沒樣品，30℃黑暗過夜。將葉片轉(zhuǎn)至75%乙醇中，68℃水浴脫色，期間更換4-5 次洗脫液，直至陰性對照材料呈白色。以注射含有不同長度CaCP1啟動子菌液的煙草葉片為材料，提取RNA，根據(jù)GUS片段設(shè)計定量引物，運用實時熒光定量PCR 分析GUS的表達(dá)量。

1.2.5 總RNA 提取、cDNA 第一鏈的合成和RTqPCR 分析 按照Trizol 試劑盒（TaKaRa, Japan）說明書提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMKit 的說明書合成cDNA 第一鏈。用ddH2O 稀釋其濃度為50-60 ng/μL，用于CaCP1的RT-qPCR 分析。利用2-ΔΔCT閾值比較法計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因株系鹽脅迫下的生理相關(guān)指標(biāo)測定和脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析 參考Arkus 等［18］方法測定葉綠素含量，參考Guo 等［19］方法測定丙二醛（malonaldehyde, MDA）含 量，參 考Sade 等［20］方法測定葉片的相對含水量（RWC），參照Zhou等［21］方法測定煙草葉片的電解質(zhì)滲透率（EC）。參考Irigoyen 等［22］方法測定脯氨酸含量。分別參考Zhang 等［23］、Beauchamp 等［24］、Ranieri 等［25］方法測定CAT 含量、SOD 含量和POD 含量。

利用RT-qPCR 方法檢測煙草脅迫相關(guān)基因NtCAT、NtSOD、NtAPX、NtLEA5、NtNHX1、NtPOX2、NtP5CS1和NtSOS1的表達(dá)，以NtActin為內(nèi)參基因，引物如表1 所示。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 運用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS7.5 軟件進(jìn)行方差分析，用SigmaPlot 14.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 CaCP1啟動子順式作用元件分析

為了研究CaCP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性，鑒定CaCP1起始密碼子上游2 086 bp 啟動子序列中的順式調(diào)控元件，并利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。生物信息學(xué)分析表明，該區(qū)域存在一些在不同植物中已知的調(diào)節(jié)逆境和防御基因表達(dá)的順式作用元件。這些元件包括4 個響應(yīng)鹽脅迫的順式作用元件GT-1、5個響應(yīng)干旱脅迫的順式作用元件MYC、7 個響應(yīng)光反應(yīng)的順式作用元件Box4 和G-box、1 個參與防御和脅迫響應(yīng)的順式作用元件TC-rich repeats。除了含有與脅迫相關(guān)的順式作用元件，CaCP1啟動子序列中含有與激素有關(guān)的順式作用元件，2 個脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABRE、1 個水楊酸反應(yīng)元件TCAelement 和1 個生長素響應(yīng)元件TGA-element。此外，17 個啟動子增強(qiáng)區(qū)域的順式作用元件CAAT-box 分布在整個CaCP1啟動子區(qū)域中（圖2）。

利用辣椒基因組序列信息克隆CaCP1的2 086 bp 啟動子序列，根據(jù)CaCP1啟動子中預(yù)測的相關(guān)作用元件，構(gòu)建不同長度啟動子片段的重組載體（圖2），為尋找CaCP1啟動子序列中響應(yīng)鹽脅迫的區(qū)域而進(jìn)行啟動子5′片段缺失試驗。

圖2 CaCP1 啟動子順式作用元件分析Fig. 2 cis-elements analysis in the promoter regions of CaCP1

2.2 CaCP1啟動子5′缺失表達(dá)載體的瞬時表達(dá)

將含有不同長度啟動子片段表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，對不同轉(zhuǎn)基因植株的煙草葉片進(jìn)行染色以及GUS的表達(dá)量進(jìn)行檢測（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性對照植株1381-35s 葉片經(jīng)GUS 染色后表現(xiàn)為深藍(lán)色，并呈現(xiàn)極高的GUS表達(dá)水平，P2、P3 和P4 在未經(jīng)處理后GUS 染色后表現(xiàn)出藍(lán)色，且P4 的GUS表達(dá)水平略高于陰性對照。鹽處理后，P1、P2、P3 和P4 的煙草葉片經(jīng)GUS 染色后均表現(xiàn)出藍(lán)色，且藍(lán)色程度高于對照，P2、P3 和P4 的GUS表達(dá)水平均明顯高于對照。其中，P4 的煙草葉片藍(lán)色最深，且P4 的GUS表達(dá)水平是陰性對照的11 倍。

圖3 CaCP1 啟動子活性分析Fig. 3 Activity analysis of promoter of CaCP1

綜上所述，CaCP1啟動子不同區(qū)段均可響應(yīng)鹽脅迫，但其P4 啟動子片段對鹽脅迫的響應(yīng)最為強(qiáng)烈，故P4 區(qū)段可能對于辣椒鹽脅迫反應(yīng)過程中CaCP1的轉(zhuǎn)錄激活有重要作用。

2.3 35S-CaCP1轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的表型分析

為進(jìn)一步研究CaCP1對鹽脅迫的響應(yīng)作用，構(gòu)建過表達(dá)載體PVBG2307-CaMV35S-CaCP1轉(zhuǎn)化煙草植株。用200 mmol/L NaCl 溶液處理T3代轉(zhuǎn)基因煙草和野生型株系（圖4）。在未處理前，35S-CaCP1-5-2-5、35S-CaCP1-19-6-17 和WT 表型無差異。鹽處理6 d 后，三者葉片均出現(xiàn)皺縮，下層葉片有黃化現(xiàn)象，且35S-CaCP1-5-2-5、35S-CaCP1-19-6-17 株系的葉片萎蔫和黃化程度較重。鹽處理10 d 后，轉(zhuǎn)基因株系除最上部的幼葉呈綠色外，其他葉片均變?yōu)辄S色，且下部葉片邊緣已出現(xiàn)壞死癥狀。對照植株的葉片皺縮，下部老葉呈黃色，而上部葉片依然保持綠色。結(jié)果表明，CaCP1過表達(dá)煙草株系對鹽脅迫響應(yīng)更敏感。

圖4 鹽處理后35S-CaCP1 轉(zhuǎn)基因煙草的表型Fig. 4 Phenotypes of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants after salt treatment

2.4 35S-CaCP1轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫下葉綠素、MDA、相對含水量和電導(dǎo)率的變化

鹽脅迫處理0、6 和12 d 時，分析35S-CaCP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因和野生型葉片的葉綠素、MDA、相對含水量和電導(dǎo)率的變化（圖5），處理前，除35S-CaCP15-2-5 株系的電導(dǎo)率顯著高于野生型外，其余指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因和野生型間無顯著性差異。隨著鹽脅迫處理時間的延長，轉(zhuǎn)基因和野生型株系葉片的葉綠素含量和相對含水量均逐漸降低，且轉(zhuǎn)基因株系降低幅度顯著大于野生型。MDA 和電解質(zhì)滲漏率呈上升趨勢，且轉(zhuǎn)基因株系的上升幅度顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因株系間的葉綠素、MDA、相對含水量和電導(dǎo)率無顯著性差異。

圖5 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉(zhuǎn)基因和野生型株系的葉綠素含量、MDA 含量、相對含水量和電導(dǎo)率Fig. 5 Chlorophyll, MDA, relative water content and electrical conductivity of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants under salt stress

2.5 CaCP1轉(zhuǎn)基因植株鹽脅迫下抗氧化酶和脯氨酸含量的變化

為進(jìn)一步分析鹽脅迫對CaCP1超表達(dá)的影響，測定轉(zhuǎn)基因和野生型葉片在0、6 和12 d 后的抗氧化酶和脯氨酸含量（圖6）。處理前，轉(zhuǎn)基因植株葉片CAT 活性顯著低于野生型，SOD 活性顯著高于野生型，且2 個轉(zhuǎn)基因株系無顯著性差異。與0 d 時比較，隨著鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系和野生型的CAT 活性顯著下調(diào)，12 d 后分別下調(diào)1.38、1.35 和1.58倍。野生型的SOD 活性在鹽處理6 d 時上調(diào)，12 d下調(diào)，轉(zhuǎn)基因株系的SOD 活性一直顯著下調(diào)，鹽處理12 d 后，分別下調(diào)5.12 和3.37 倍，且轉(zhuǎn)基因株系的CAT 和SOD 活性降低幅度大于野生型。轉(zhuǎn)基因株系和野生型POD 活性隨著鹽處理而逐漸增加，且轉(zhuǎn)基因株系上調(diào)的幅度顯著高于野生型，尤其在12 d 時，高于對照2.54 和2.64 倍。

圖6 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉(zhuǎn)基因和野生型株系的CAT、SOD、POD 酶活性和脯氨酸含量Fig. 6 CAT activity, SOD activity, POD activity, and proline content of 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants after salt treatment

處理前，轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片的脯氨酸含量無差異，35S-CaCP1-15-2-5 轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片的脯氨酸含量在鹽處理6 d 時增加，12 d 減少，但35S-CaCP1-15-2-5 轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量變化的程度顯著低于野生型，且35S-CaCP1-19-6-17 轉(zhuǎn)基因葉片的脯氨酸含量在鹽處理后一直上調(diào)，且在12 d 顯著高于野生型。

2.6 鹽脅迫下CaCP1轉(zhuǎn)基因植株抗氧化酶基因的表達(dá)水平變化

為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因和野生型煙草中的抗氧化酶活性在鹽脅迫下的變化，運用RT-qPCR 測定株系中抗氧化酶基因NtCAT、NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達(dá)水平（圖7）。與0 h 時野生型的表達(dá)水平相比，鹽處理24 h 后，野生型株系的NtCAT、NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達(dá)水平分別上調(diào)1.37、10.76、96.34 和11.55 倍，轉(zhuǎn)基因株系的NtCAT的表達(dá)水平分別下調(diào)0.59 和0.77 倍，而NtSOD、NtAPX和NtPOX2的表達(dá)水平分別上調(diào)5.17 和6.38 倍、12.52和37.87 倍、5.17 和6.93 倍。NtCAT在 轉(zhuǎn) 基 因 株系中的抑制程度大于野生型，NtSOD、NtAPX和NtPOX2在轉(zhuǎn)基因株系中的上調(diào)量顯著低于野生型。

圖7 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉(zhuǎn)基因和野生型株系抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)變化Fig. 7 Expression profiles of antioxidant-related genes in 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants and wild plants after salt treatment

2.7 鹽脅迫下CaCP1轉(zhuǎn)基因植株脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平變化

為了進(jìn)一步分析鹽脅迫下CaCP1轉(zhuǎn)基因植株的受脅迫程度，檢測野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中的脅迫相關(guān)基因NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽處理24 h 后，野生型植株中的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1均呈現(xiàn)大幅度的上調(diào)表達(dá)，分別上調(diào)5.36、5.82、288.05 和17.08 倍，轉(zhuǎn)基因煙草中的NtLEA5和NtP5CS1的表達(dá)也顯著增強(qiáng)，分別上調(diào)1.35 和2.68 倍、40.42 和137.82 倍，但上調(diào)幅度顯著小于野生型。轉(zhuǎn)基因煙草中的NtNHX1和NtSOS1表達(dá)出現(xiàn)小幅度的上調(diào)，分 別 為1.77 和1.50 倍、3.43 和4.10 倍。鹽 處 理后，轉(zhuǎn)基因株系的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1的表達(dá)水平都顯著低于野生型（圖8）。

圖8 鹽脅迫下35S-CaCP1 轉(zhuǎn)基因和野生型株系脅迫相關(guān)基因的相對表達(dá)量變化Fig. 8 Relative expression profiles of stress-related genes in 35S-CaCP1 transgenic tobacco plants and wild plants after salt treatment

3 討論

在植物中，CPs 參與鹽脅迫。如擬南芥AtRD21A和AtRD19A，在鹽脅迫的誘導(dǎo)下表達(dá)量增高［26］。在NaCl 處理的豌豆幼苗中，Cyp15a的轉(zhuǎn)錄水平增加［27］。在鹽脅迫下，小麥PLCP 基因（TaCP）表達(dá)上調(diào)［28］。擬南芥中SPCP2的過表達(dá)增強(qiáng)了對鹽脅迫的抗性［29］。水稻中的CPs 基因LOC_Os01g73980、LOC_Os02g27030 和LOC_Os05g01810 的表達(dá)也被鹽脅迫高度激活［30］。在之前的研究中，鹽脅迫可促進(jìn)CaCP1顯著上調(diào)表達(dá)［12］，為了研究辣椒在鹽脅迫下如何調(diào)控CaCP1的表達(dá)，本研究首先克隆了CaCP1的2 086 bp 啟動子，并在其中識別了幾個順式調(diào)控元件，這些元件被預(yù)測會響應(yīng)信號分子和環(huán)境脅迫。隨后，對CaCP1啟動子進(jìn)行了缺失分析，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時表達(dá)，確定鹽脅迫應(yīng)答的主要啟動子區(qū)域。本研究獲得的瞬時表達(dá)結(jié)果顯示，NaCl 處理顯著誘導(dǎo)CaCP1啟動子的缺失片段P2、P3 和P4，且啟動子缺失片段P4 的GUS定量高于其他缺失片段。表明410 bp（P4）段可能含有非生物脅迫誘導(dǎo)的順式作用元件。在CaCP1啟動子中發(fā)現(xiàn)了4 個GT-1 motif，它是一個參與響應(yīng)鹽脅迫順式作用元件［31］。結(jié)果表明，啟動子缺失片段P4 上的GT-1 motif 可能對于調(diào)控CaCP1在鹽脅迫下的表達(dá)發(fā)揮主要作用。

為了更好地了解CaCP1的功能，用T3代CaCP1過表達(dá)煙草轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鹽處理，并測定其葉綠素含量和相對含水量發(fā)現(xiàn)，CaCP1轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系葉片的葉綠素和相對含水量均顯著低于野生型。前人研究得知葉綠素含量和相對含水量與植株的受損傷程度成反比［32］，本研究結(jié)果表明，過表達(dá)CaCP1加劇了植株在鹽脅迫下的損傷程度?；谵D(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，缺失或過表達(dá)CPs 基因，如AtCEP1、HvPAP14等能誘導(dǎo)植物光合基因表達(dá)變化［33-34］。此外，細(xì)胞質(zhì)中的CPs 影響葉綠素含量［35］。MDA 一般用于評價植物高鹽脅迫下ROS 介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化程度［36］。鹽處理下，CaCP1轉(zhuǎn)基因株系和野生型的MDA 和電解質(zhì)滲漏率呈上升趨勢，且轉(zhuǎn)基因株系的上升幅度顯著高于野生型。結(jié)果表明，CaCP1過表達(dá)提高植株脂質(zhì)過氧化程度，即脅迫程度增加。這與HpXBCP3的過表達(dá)可增加雨生紅球藻對NaCl 脅迫的敏感性一致［37］。

脯氨酸在植物遭受土壤鹽分引起的高滲透脅迫時起著保護(hù)滲透的作用，據(jù)報道NtP5CS1參與了脯氨酸在鹽脅迫下的生物合成［38］。鹽處理6 d后，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量顯著低于野生型，而NtP5CS1在鹽處理24 h 的表達(dá)量低于野生型，而鹽處理12 d 后，轉(zhuǎn)基因株系的脯氨酸含量略高于野生型，證明CaCP1基因提高了植株對鹽脅迫的敏感性。

在處理前和鹽脅迫下，CaCP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株ROS 清除酶活性（CAT、SOD 和POD）與野生型相比有極大的差異。其中轉(zhuǎn)基因株系的CAT 和SOD活性顯著低于野生型，POD 活性顯著高于野生型。鹽脅迫對CAT、POD、SOD 等抗氧化酶均有顯著的提高作用，表明清除活性氧是棉花耐鹽機(jī)制的重要組成部分［39］，但是楝樹幼苗的POD 活性呈上升趨勢并且隨著鹽濃度的增加而下降［40］，推測是由于POD 既能消除ROS，也可以促進(jìn)ROS 的生成而引起的［41］。此外，在CaCP1過表達(dá)植株中，NtCAT、NtAPX、NtSOD和NtPOD2等抗氧化酶基因的低表達(dá)會降低這些酶的活性，從而減弱對鹽脅迫的耐受性。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中CaCP1的過表達(dá)主要導(dǎo)致活性氧清除基因/酶CAT 和SOD 水平降低，提高CaCP1過表達(dá)植株對鹽脅迫的敏感性。

當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，許多信號通路被激活，如逆境應(yīng)答基因SOS、NHX1、P5CS和LEAs的表達(dá)［42-45］。AlSRG1轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫或滲透脅迫之后，NtSOS1和NtNHX1的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，提高了AlSRG1轉(zhuǎn)基因煙草的抗性［46］。干旱和鹽脅迫下，與野生型相比，NtP5CS1、NtSOS1和NtNHX4的表達(dá)水平上調(diào)，TaGF14b轉(zhuǎn)基因煙草通過調(diào)節(jié)逆境應(yīng)答基因表達(dá)改善非生物脅迫的耐受性［47］。NtLEA5和NtP5CS1高度上調(diào)表達(dá)也提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽性［48-49］。本研究中，轉(zhuǎn)基因植株的NtLEA5、NtNHX1、NtP5CS1和NtSOS1等脅迫相關(guān)基因在鹽脅迫下的表達(dá)量顯著低于野生型，說明CaCP1的過表達(dá)降低了植株的抗鹽性。

4 結(jié)論

CaCP1的啟動子缺失片段-410- -1 bp 對于調(diào)控CaCP1在鹽脅迫下的表達(dá)具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，CaCP1的過表達(dá)提高植株對鹽脅迫的敏感性，CaCP1在調(diào)節(jié)植物鹽脅迫應(yīng)答方面起重要作用。