杧果Fe-S 簇裝配基因MiISU1 的生物學(xué)功能

崔吉潔 蔡文波 莊慶輝 高愛平 黃建峰 陳亞輝 宋志忠，

（1. 魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院 山東省高校作物高產(chǎn)抗逆分子模塊育種重點實驗室，煙臺 264025；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所，?？?571100；3. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

鐵（Fe）是植物維持正常生命活動所必需的微量礦質(zhì)元素之一，在植物生長發(fā)育、花的開放、果實品質(zhì)和產(chǎn)量方面起重要作用［1-3］，土壤缺鐵抑制植物生長，降低果實產(chǎn)量，影響果實品質(zhì)［4-6］。目前，相關(guān)研究集中在生理生化層面，果樹鐵素營養(yǎng)與代謝的分子機制尚不清楚。因此，研究果樹鐵素營養(yǎng)與代謝的分子基礎(chǔ)具有重要的科學(xué)意義。

鐵硫簇（Fe-S cluster）是鐵硫蛋白的活性部位，F(xiàn)e-S 簇的組裝是一個高度復(fù)雜和協(xié)調(diào)的過程，需要多種功能性蛋白參與且有序進行［7-10］。Fe-S 簇裝配機制是植物鐵素營養(yǎng)和鐵代謝的核心環(huán)節(jié)，在植物的生命過程中具有至關(guān)重要的作用［2,8-11］。研究表明，植物鐵硫蛋白存在于質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等亞細(xì)胞器官中，直接參與光合作用、呼吸作用、氮同化、氨基酸和嘌呤代謝、植物激素合成和DNA 修復(fù)等多種重要生命過程［7-9,11-14］。硝酸還原酶（nitrite reductase, NIR）在葉綠體中氮的同化過程中起重要作用，烏頭酸酶（aconitase, ACO）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase, SDH）直接參與線粒體中糖代謝的檸檬酸循環(huán)［2,8-9］。植物中，一個典型的Fe-S 簇裝配過程可分為2 個階段：第一階段，即S 和Fe 結(jié)合在支架蛋白上形成Fe-S 簇；第二階段，將Fe-S 簇轉(zhuǎn)移到靶蛋白，整個裝配過程涉及到鐵供體（FH）、硫供體（NFS）、支架蛋白（SUFB、SUFC、SUFD、NFU、NBP35 等）及轉(zhuǎn)運蛋白（SUFA、ISA、INDL、GRX、HSCA）等40 多個功能蛋白參與［8-9,12-15］。

目前，模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中Fe-S 簇裝配機制及其調(diào)控的分子機理研究的最為透徹，在不同的亞細(xì)胞器官中確定了3 種Fe-S 簇裝配機制，即質(zhì)體硫調(diào)動（sulfur mobilization, SUF）、線粒體Fe-S 簇裝配（iron-sulfur cluster, ISC）和細(xì)胞質(zhì)Fe-S 簇裝配（cytosolic iron-sulfur cluster assembly,CIA），其中，質(zhì)體SUF 和線粒體ISC 兩種機制均以獨立的方式運行，而細(xì)胞質(zhì)CIA 機制中Fe-S 簇的裝配依賴于線粒體完成［8-9,15］。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者圍繞植物Fe-S 簇裝配機制開展的研究主要集中在擬南芥［8-9］、水稻（Oryza sativa）［16］和大豆（Glycine max）［17］等一年生模式植物。果樹中Fe-S 簇裝配機制的研究極少，僅在桃（Prunus persica）［18-19］和葡萄（Vitis vinifera）［20］中克隆了Fe-S 簇裝配相關(guān)基因，杧果（Mangifera indica）Fe-S 簇裝配的分子機制依然未知。參與線粒體ISC 裝配機制的基因有20 余個，其中，ISU1在水稻［16］、桃［19］和葡萄［20］中表達(dá)量最高。然而，有關(guān)ISU1生物學(xué)功能的研究僅在擬南芥中有報道［9,11］，其他作物ISU1的生物學(xué)功能依然未知。

本研究以二倍體‘桂熱82’杧果（Mangifera indica）為材料，克隆參與線粒體ISC 裝配機制的關(guān)鍵基因MiISU1，明確其在杧果不同組織部位的組織特異性表達(dá)模式，及其在嫁接幼苗中對缺鐵和高鐵毒害的響應(yīng)特征，為研究杧果Fe-S 簇裝配機制及熱帶作物鐵素營養(yǎng)與代謝的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物品種資源研究所提供的五年生‘桂熱82’杧果和一年生嫁接幼苗，野生型擬南芥Col-0、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株和植物表達(dá)載體pHB 為魯東大學(xué)農(nóng)林工程研究院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 利用一年生‘桂熱82’嫁接幼苗，按照Liang 等［16］和Song 等［19］方法，以1/2 MS 液體培養(yǎng)基為對照，進行缺鐵（0 mmol/L）和高鐵毒害（50 mmol/L FeNa-EDTA）處理。

1.2.2 生理生化分析 利用電子天平稱量植株生物鮮重；參照Song 等［19,21-22］方法，植物材料烘干后利用HNO3-HClO4法消解，通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀ICP-AES（IRIS Advantage, Thermo Electron, USA）測定鐵含量。根據(jù)Liang 等［16］和Song 等［19］方法測定ACO 活性，利用中國南京建成生物工程研究所研發(fā)的檢測試劑盒進行NiR 和SDH活性測定［16-17,19］。根據(jù)Song 等［19,22］方法進行葉綠素的提取，新鮮葉片浸泡在95%乙醇中，置于4℃黑暗過夜，收集上清液，利用BioRad SmartSpec 3000 吸光度分光光度計（Wadsworth, Illinois, USA）測量總?cè)~綠素含量。試驗設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，每次選用20 棵擬南芥幼苗。

1.2.3 杧果MiISU1的克隆 以擬南芥ISU1 氨基酸序列為參考序列，在杧果基因組數(shù)據(jù)庫［23］中檢索可能的杧果MiISU1 同源蛋白。運用Pfam（http：//pfam.xfam.org/search）在線服務(wù)器預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域。在杧果基因組數(shù)據(jù)庫獲得杧果MiISU1的CDS 序列（coding sequence），設(shè)計上下游引物，提取‘桂熱82’嫁接苗葉片的RNA，通過PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）合成第一鏈cDNA 作為模板，利用Prime STARTMHS DNA聚合酶（TaKaRa，大連）擴增目的基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹建立 利用ClustalX 2.0.13 軟件對杧果、桃、蘋果（Malus domestica）、草莓（Fragaria vesca）、葡萄、柑橘（Citrus sinensis）、擬南芥、鹽芥（Thellungiella salsuginea）、短柄草（Brachypodium distachyon）、白楊（Populus trichocarpa）、番茄（Solanum lycopersicum）、大豆和水稻13 種植物同源家族蛋白分別進行氨基酸序列比對，利用MEGA 7.0 中的鄰接法（neighbor-joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析遺傳進化關(guān)系。

1.2.5 實時熒光定量PCR 分析 利用NCBI/Primer-BLAST 在線服務(wù)器，設(shè)計杧果MiISU1特異性表達(dá)引物（上 游 引物：5′-AACATCTTTCTCTGCCTCCG-3′，下游引物：5′-GCATCAGCAGCCTTCTCAAT-3′），以杧果Actin為內(nèi)參［24-25］，通過ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀檢測杧果MiISU1的組織特異性表達(dá)特征及其對脅迫處理的響應(yīng)差異。熒光染料使用SYBR Green（TaKaRa，大連），反應(yīng)體系參照商品說明書的描述，反應(yīng)程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40 個循環(huán)；72℃ 10 s。每個反應(yīng)進行3 次生物學(xué)重復(fù)，在ABI 7500 PCR 儀獲得相應(yīng)的Ct 值，經(jīng)內(nèi)參基因Actin均一化處理，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量［16,19,24-25］。

1.2.6 超表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的創(chuàng)制 設(shè)計構(gòu)建重組表達(dá)載體引物（上游引物序列：5′-GACGGATC CATGCTGAGACTCGCTTCAAAG-3′，下劃線為BamHI限制性酶切位點；下游引物序列：5′-GAGTCTAGA TCAAGCATCAGCAGCCTTCTC-3′，下劃線為XbaI 限制性酶切位點），擴增ISU1的CDS 片段，利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，大連）連接ISU1和植物表達(dá)載體pHB（實驗室保存）［24-25］，獲得重組質(zhì)粒pHBMiISU1，并進行雙酶切驗證。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法，將重組質(zhì)粒pHB-MiISU1轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0，分別在含有5 和10 mg/L 潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基平板上篩選T1代陽性抗性苗，通過PCR 驗證陽性植株，隨機收獲編號#6 的轉(zhuǎn)基因擬南芥進行后續(xù)生理表型分析。收獲#6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的T3代種子，在1/2 MS 固體培養(yǎng)基上播種，萌發(fā)3 d 后，取20 棵幼苗轉(zhuǎn)移到缺鐵的1/2 MS 固體培養(yǎng)基中處理5 d 時觀察植株生長情況，共進行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 13.0（SPSS Chicago，美國）對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，杧果幼苗在脅迫處理與對照條件2 個獨立樣品間進行t檢驗（*P<0.05，**P<0.01）。

2 結(jié)果

2.1 杧果ISU1的鑒定與克隆

參考擬南芥ISU1 氨基酸序列，在杧果基因組數(shù)據(jù)庫中檢索到1 個杧果同源蛋白MiISU1，Pfam 預(yù)測其含有NifU-like N terminal domain 功能結(jié)構(gòu)域，編碼屬于線粒體ISC 裝配機制的支架蛋白Scaffold。以‘桂熱82’葉片RNA 反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，克隆獲得一條525 bp 的片段，命名為杧果MiISU1。

2.2 植物ISU同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

氨基酸序列比對結(jié)果（圖1）表明，杧果、桃、蘋果、草莓、葡萄、柑橘、擬南芥、鹽芥、短柄草、白楊、番茄、大豆和水稻13 種植物ISU1 同源蛋白的序列一致性高達(dá)79.12%，并在多處結(jié)構(gòu)域區(qū)段高度一致，暗示該蛋白在不同物種進化過程中的功能較為保守。

圖1 13 種植物ISU1 同源蛋白氨基酸序列一致性分析Fig. 1 Amino acid sequence identity analysis of ISU1 homologs from 13 plant species

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果（圖2）表明，13 種不同科屬植物ISU 同源蛋白之間的遺傳進化距離差異較大，漆樹科杧果MiISU1 和蕓香科柑橘ISU1 緊密聚在一起，兩者之間的遺傳距離最近，禾本科水稻和短柄草ISU 同源蛋白不同成員之間傾向于聚在一起，十字花科擬南芥和鹽芥ISU 同源蛋白不同成員之間緊密地聚在一起，薔薇科草莓、桃和蘋果ISU 同源蛋白傾向于緊密聚在一起。

圖2 13 種植物ISU 同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of ISU homologs from 13 plant species

2.3 杧果MiISU1的表達(dá)模式分析

實時熒光定量PCR 分析結(jié)果（圖3）表明，杧果MiISU1在五年生‘桂熱82’新生葉片、新生韌皮部、新生根、花蕾期花朵、盛開期花朵、幼果和成熟果實中均有表達(dá)，且表達(dá)水平差異較大，ISU1在杧果幼果中的表達(dá)量最高，其次是成熟果實、盛開期花朵、花蕾期花朵和新生葉片，在新生根和新生韌皮部中的表達(dá)量較低。

圖3 杧果MiISU1 的組織特異性表達(dá)分析Fig. 3 Tissue-specific expression analysis of MiISU1 gene in mango

2.4 杧果MiISU1對不同鐵素供應(yīng)的差異響應(yīng)

以嫁接一年的‘桂熱82’幼苗為材料，通過實時熒光定量PCR 分析杧果MiISU1對不同鐵素水平供應(yīng)的響應(yīng)特征，結(jié)果（圖4）表明，與對照相比，缺鐵處理顯著抑制了MiISU1在一年生杧果嫁接幼苗根中的表達(dá)量，莖和葉片中的表達(dá)量沒有顯著變化，而高鐵毒害顯著增強了MiISU1在整株幼苗不同組織中的表達(dá)量。

圖4 杧果MiISU1 對不同鐵素供應(yīng)條件的響應(yīng)差異Fig. 4 Differential responses of MiISU1 gene to different Fe supplies in mango tissue culture seedlings

2.5 杧果MiISU1的功能初析

構(gòu)建重組表達(dá)載體pHB-MiISU1（圖5-A），創(chuàng)制異源超表達(dá)杧果MiISU1的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，篩選獲得8 個T1代陽性株系，PCR 驗證均獲得一條525 bp 的MiISU1目的基因條帶（圖5-B）。隨機選取#6 號陽性株系，以其T3代種子進行生長表型和不同鐵素脅迫處理。

圖5 超表達(dá)MiISU1 轉(zhuǎn)基因擬南芥創(chuàng)制及驗證Fig. 5 Generation and verification of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings

與對照相比，缺鐵處理顯著抑制了擬南芥植株的生長，并降低了植株鐵素富集能力和NiR、ACO和SDH 等鐵硫蛋白的酶活力（圖6 和表1）。在對照條件下，植株生長5 d 時，T3代轉(zhuǎn)基因株系的生長情況顯著好于野生型，地上部、地下部的生物鮮重顯著高于野生型，T3轉(zhuǎn)基因株系葉片NiR、ACO和SDH 酶活均顯著高于野生型，葉綠素含量沒有顯著差異（圖6-A 和表1）。在缺鐵脅迫條件下，植株生長5 d 時，T3代轉(zhuǎn)基因株系和野生型的葉片均發(fā)生失綠，而T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥根部的生長情況顯著好于野生型，T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥根部生物鮮重、葉片葉綠素含量、ACO 和SDH 酶活力均顯著高于野生型，而地上部生物鮮重和NiR 酶活力沒有顯著差異（圖6-B 和表1）。在高鐵毒害條件下，植株生長5 d時，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的生長均枯萎死亡。此外，在對照和缺鐵處理條件下，T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥整株的鐵含量均顯著高于野生型（表1）。以上結(jié)果表明，MiISU1在擬南芥中超表達(dá)有效增強了轉(zhuǎn)基因株系的生長情況，并通過增強轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)育近而提升了對缺鐵脅迫的耐受能力。

表1 轉(zhuǎn)基因擬南芥缺鐵處理5 d 的生理分析Table 1 Physiological analysis of transgenic Arabidopsis seedlings under Fe depletion for 5 d

圖6 超表達(dá)MiISU1 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析Fig. 6 Phenotype analysis of MiISU1 over-expression transgenic Arabidopsis seedlings

3 討論

鐵是果樹生長發(fā)育最為重要的微量元素之一，與果樹生長、果實品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)［2-6,11］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵處理顯著抑制了擬南芥植株的生長、葉綠素合成、鐵素富集能力和NiR、ACO 和SDH 等鐵硫蛋白的酶活力，這些結(jié)果與水稻［16］、大豆［17］和桃［19］中的報道是一致的，再次驗證鐵是果樹生長發(fā)育過程中必不可少的微量元素。

生物界中Fe-S 簇裝配機制是高度復(fù)雜的，不管是原始生物還是真核生物，其Fe-S 簇裝配機制一直是非常保守和穩(wěn)定的［9,11,26］。本研究從漆樹科植物杧果中鑒定了1 個參與線粒體ISC 裝配機制的MiISU1基因，其編碼產(chǎn)物與已報道植物ISU 同源蛋白的氨基酸序列一致性非常高（79.12%），在多個區(qū)域片段的氨基酸序列完全一致，暗示杧果Fe-S 簇裝配機制與模式植物一樣，也是高度保守的。特別地，本研究僅在杧果基因組中鑒定到1 個ISU 家族蛋白，這一現(xiàn)象與蘋果、桃、草莓和葡萄一致［18-20］，而水稻、短柄草和番茄中含有2 個ISU 同源蛋白（ISU1和ISU2）［16］，擬南芥、鹽芥中含有3 個ISU 家族蛋白（ISU1-3）［8-9,11］。此外，Léon 等［26］發(fā)現(xiàn)擬南芥AtISU3的表達(dá)水平很低，該基因可能沒有功能或是假基因。因此，推測植物線粒體ISC 裝配機制中的非功能性ISU 支架蛋白在長期進化過程中更容易發(fā)生丟失，多年生果樹作物鐵代謝過程中可能利用更少數(shù)量的功能性ISU 支架蛋白。

本研究所選擇的13 種不同科屬植物中，杧果MiISU1 和柑橘ISU1 之間的遺傳距離最近，同屬于薔薇科的桃、草莓和蘋果ISU1 同源蛋白緊密聚集在一起，3 種禾本科植物短柄草、水稻和大豆的ISU同源蛋白傾向于聚在一起，而十字花科植物擬南芥和鹽芥含有最多的ISU 蛋白成員，其同源蛋白分別兩兩緊密聚在一起，這些結(jié)果表明，同一科屬或近屬植物的ISU 同源蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上的遺傳距離更近，在長期進化過程中更傾向于擁有相同或相近的生物學(xué)功能。因此，研究杧果ISU1 蛋白功能可能為揭示漆樹科作物ISU1 生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

杧果MiISU1在幼果果實中的表達(dá)水平最高，這一發(fā)現(xiàn)與桃［18-19］和葡萄［20］中ISU1的表達(dá)情況基本一致，與水稻［16］和大豆［17］略有不同，這兩種植物ISU1均在地上部顯著表達(dá)。值得注意的是，杧果、桃和葡萄均屬于典型的果樹作物，暗示在果實形成初期可能需要更多的功能性ISU1 支架蛋白參與線粒體ISC 裝配機制。此外，杧果MiISU1在幼苗不同部位對鐵素供應(yīng)情況的響應(yīng)存在差異，缺鐵脅迫顯著降低了幼苗根中MiISU1的表達(dá)水平，而高鐵毒害顯著增強了整株幼苗中MiISU1的表達(dá)水平，推測MiISU1 可能在杧果根中鐵素代謝與營養(yǎng)方面也發(fā)揮重要作用，且受鐵素供應(yīng)水平的調(diào)控。

擬南芥AtISU1 作為支架蛋白與分子伴侶HSCB相互作用，參與線粒體ISC 裝配機制［11,26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)MiISU1有效改善了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鐵素富集能力、葉綠素合成和關(guān)鍵鐵硫蛋白的酶活力，并通過增強轉(zhuǎn)基因植物根系發(fā)育而提升了缺鐵脅迫的耐受能力。因此，推測MiISU1在擬南芥中超表達(dá)后可能會積極調(diào)動前期在1/2 MS 完全培養(yǎng)基中萌發(fā)時所積累的有限的鐵，特別是在缺鐵脅迫條件下，積極調(diào)動轉(zhuǎn)基因株系根部盡可能地從鐵素匱乏環(huán)境中富集更多的鐵，用于維持植株基本的光合作用和必須依賴鐵的關(guān)鍵鐵硫蛋白的活性，諸如線粒體內(nèi)直接參與三羧酸循環(huán)的SDH 和間接參與檸檬酸異構(gòu)化作用的ACO，均與糖類、脂類和氨基酸密切相關(guān)的代謝通路，進而有效抵抗缺鐵不利環(huán)境對植物的迫害作用。與此同時，本研究證實不管是對照條件或缺鐵脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的鐵含量、ACO和SDH 酶活力均顯著高于野生型。因此，揭示杧果MiISU1 的功能為研究漆樹科植物ISU1 同源蛋白的生物學(xué)功能奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從杧果中分離并鑒定了MiISU1，其在幼果中的表達(dá)量最高；超表達(dá)MiISU1顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長情況、鐵素富集水平、葉片葉綠素含量、硝酸還原酶、烏頭酸酶和琥珀酸脫氫酶的酶活力，并通過增強轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)育近而提升了對缺鐵脅迫的耐受能力。