高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳對蛋白結(jié)構(gòu)及抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響

齊寶坤 王 琪 鐘明明 廖 一 孫禹凡

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

0 引言

豆乳的穩(wěn)定性和抗氧化活性并不理想，并且含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANF)影響其為人體提供營養(yǎng)健康[1]，包括熱穩(wěn)定性ANF植酸(PA)、大豆球蛋白(11S)、β-伴大豆球蛋白(7S)、低聚糖等和熱不穩(wěn)定性ANF胰蛋白酶抑制劑(TI)、脲素酶(UA)、抗維生素因子、致甲狀腺腫素、大豆凝集素(SBA)。其中，脲酶作為抗?fàn)I養(yǎng)因子組分的一種，是無毒的酰胺酶類物質(zhì)，易分解成含氮化合物進(jìn)一步產(chǎn)生氨，導(dǎo)致氨中毒或引起機(jī)體中氨代謝紊亂；大豆凝集素約占大豆蛋白質(zhì)的3%，是一種高度抗消化的糖蛋白；致甲狀腺素是由硫代葡萄糖苷形成的，這種物質(zhì)會引起甲狀腺腫大；脂肪氧化酶(LOX)又稱為抗維生素因子，約占大豆蛋白的1%，催化脂肪氧化將脂溶性維生素和胡蘿卜素破壞，引發(fā)維生素缺乏；胰蛋白酶抑制劑是一種高分子蛋白質(zhì)，大豆約含30 mg/g，嚴(yán)重影響消化過程；植酸與金屬離子(如鈣、鎂、鋅、銅和鐵)形成螯合物降低礦物質(zhì)的生物利用度；大豆抗原蛋白主要存在于11S和7S中，會引起動物機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在會導(dǎo)致食物利用率低、生長性能下降，甚至引發(fā)疾病[2]。因此為了提高大豆的營養(yǎng)價值，鈍化大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子(ANF)含量具有重要的現(xiàn)實意義。

近20年來對去除大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子的相關(guān)研究十分廣泛，研究方法包括熱處理和非熱處理物理手段、浸泡萌發(fā)、發(fā)酵、蛋白酶解改性、糖基化修飾及pH值調(diào)控化學(xué)方法等改變大豆蛋白的空間結(jié)構(gòu)和分子特性，進(jìn)一步影響 ANF 活性并對其功能性質(zhì)進(jìn)行研究。文獻(xiàn)[3]研究高壓均質(zhì)與酶法聯(lián)合改性對大豆蛋白抗原性及結(jié)構(gòu)的影響；文獻(xiàn)[4]采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別水解脫脂豆粕，并采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)測定其抗原活性。文獻(xiàn)[5]進(jìn)行酶促交聯(lián)處理，采用?；D(zhuǎn)移酶MTGase催化谷氨酰胺和賴氨酸殘基之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，導(dǎo)致共價蛋白質(zhì)交聯(lián)[6]，促使大豆交聯(lián)成高分子量聚合物，蛋白質(zhì)氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起抗原表位的隱藏或掩蓋進(jìn)而抑制了11S和7S的抗原性。此外，酶法改性蛋白可以提高抗氧化劑活性，文獻(xiàn)[7]利用堿性蛋白酶制備大豆蛋白活性肽對抗氧化活性研究；文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理提高了酶的水解效率，在高壓下水解可以增加小肽的產(chǎn)量，獲得的水解物具有更高的生物活性。綜上所述，目前關(guān)于酶改性抑制大豆蛋白抗原性的研究較多，但對酶解豆乳蛋白結(jié)構(gòu)和分子特性的改變與大豆中ANF及其功能特性的影響研究相對較少。

因此，本文以不同均質(zhì)壓力預(yù)處理的豆乳作為底物，分別采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶進(jìn)行水解，研究高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與ANF的影響，通過豆乳前后溶解性、水解度和粒徑、Zate電位、儲存穩(wěn)定性、豆乳微觀結(jié)構(gòu)、線性表位、二三級結(jié)構(gòu)的改變，對比分析豆乳抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的差異，以揭示高壓均質(zhì)輔助蛋白酶解豆乳過程中鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農(nóng)99)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；木瓜蛋白酶(酶活力為8.0×105U/g)，堿性蛋白酶(酶活力為2.0×105U/g)，菠蘿蛋白酶(酶活力為3.5×105U/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；植酸鈉、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)標(biāo)準(zhǔn)品、苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基苯胺(BAPNA)、乙二胺四乙酸，購買于北京化工試劑廠；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ATS-BASIC 100型高壓均質(zhì)機(jī)，德國ATS儀器公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛世(上海)儀器有限公司；LGJ-18 型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DYY-6D 型電泳儀，北京市六一儀器廠；FL8500 型熒光分光光度計，美國 Perkiin Elmer 公司；ALPHA-T 型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Bruker公司；TU-1901型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1工藝流程

工藝流程如下：大豆→篩選→清洗→浸泡(料液比3 g/mL、12 h)→冷榨磨漿(料液比6 g/mL)→過濾→高壓均質(zhì)(30～120 MPa)預(yù)處理→酶解(酶最適溫度、加酶量0.2%、保持豆乳自然pH值6.5)→噴霧干燥→過篩→成品。

1.3.2高壓均質(zhì)輔助蛋白酶解豆乳工藝

取適量新鮮冷榨豆乳，等量分裝，采用不同均質(zhì)壓力(30、70、90、100、120 MPa)預(yù)處理，每個樣品均質(zhì)3遍，再等量加入不同酶水解處理(堿性蛋白酶 E1、木瓜蛋白酶 E2、菠蘿蛋白酶 E3)，加酶量參照文獻(xiàn)[3]。本實驗酶與底物質(zhì)量百分比為0.2%，酶解溫度采用酶的最適反應(yīng)溫度(E1：50℃；E2：55℃；E3：45℃)，水解時間為 20 min。

1.3.3溶解度測定

將水解物在室溫(20℃)下攪拌1 h，最后在20℃和9 000g下離心20 min。上清液中的蛋白質(zhì)含量通過Pierce BCA Protein Assay 試劑盒測量，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。溶解度表示為存在于上清液中蛋白含量A1與樣品總蛋白質(zhì)含量A2的百分比。氮溶解指數(shù)(NSI)計算公式為

(1)

1.3.4水解度測定

參考文獻(xiàn)[9]的方法，以絲氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)，采用鄰苯二甲醛(OPA)法測定，取160 mg OPA(純度97%)溶于4 mL 無水乙醇，加入 0.2 g的SDS(十二烷基硫酸鈉)、7.620 g的硼砂、0.175 g DTT(二硫蘇糖醇，純度99%)去離子水定容200 mL?；靹虮芄獗４妗?00 μL樣品與3.0 mL的OPA試劑混勻靜置2 min后，在340 nm下測定吸光度。水解度計算公式為

(2)

式中h——水解過程中，每克豆乳蛋白被斷裂的肽鍵數(shù)，mmol/g

htot——大豆蛋白總肽鍵數(shù)，取7.8 mmol/g

1.3.5粒徑、電位測定

采用Mastersizer 2000型粒度儀測定豆?jié){的粒徑分布。將樣品稀釋到合適倍數(shù)，設(shè)置顆粒折射率為1.46，分散劑折射率為1.33，吸收參數(shù)為0.001，測定溫度為25℃，平衡時間為2 min，計算3次重復(fù)試驗得到的平均值。

1.3.6十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，使用 SDS-PAGE法分析豆乳樣品中抗原蛋白以及 ANF組分分子量的分布模式。此方法采用 5% 的濃縮膠和 12% 的分離膠，在甘氨酸電極緩沖液進(jìn)行跑膠，將豆乳樣品用純水稀釋為合適倍數(shù)，并與樣品緩沖液(含 5% β-巰基乙醇)按照體積比3∶1混合并在100℃加熱約10 min，上樣量為10 μL。

1.3.7傅里葉變換紅外光譜測定

參照文獻(xiàn)[11]的方法，對酶解豆乳蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，傅里葉變換紅外光譜儀檢測參數(shù)為波數(shù)4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次。使用 Peak Fit V4.12 軟件分析二級結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.8熒光光譜測定

參考文獻(xiàn)[12]的方法，利用FL8500型熒光光度計測定豆乳蛋白的本征發(fā)射熒光光譜。將新制備的豆乳用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.1～7.4)稀釋至合適濃度，發(fā)射光譜儀的激發(fā)波長為290 nm，在300～400 nm掃描發(fā)射光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫均為5 nm。

1.3.9抗?fàn)I養(yǎng)因子測定

1.3.9.1脲酶活性測定

UA活性參照文獻(xiàn)[13]的方法：將1.0 g樣品與50 mL尿素溶液(在50 mL 0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.0)中加入1 g尿素)35℃攪拌40 min。UA 活性表示為 pH值的變化。

1.3.9.2胰蛋白酶抑制劑活性測定

根據(jù)文獻(xiàn)[14]對TI活性進(jìn)行測定。稱取1 g豆乳于50 mL Tris 緩沖液(0.05 mol/L，pH值8.2)中，恒溫?fù)u床(150 r/min，25℃，3 h)，7 000 r/min離心10 min，保留上清液。一個胰蛋白酶單位(1TU)被定義為10 mL反應(yīng)混合物(2 mL等分試樣、2 mL胰蛋白酶溶液、5 mL BAPNA溶液和1 mL乙酸溶液)在410 nm處增加0.01個吸光度單位?？?fàn)I養(yǎng)因子TI活性計算公式為

(3)

式中U0——豆乳樣品中胰蛋白酶活力量

U——生豆乳中胰蛋白酶活力量

1.3.9.3脂肪氧化酶活性測定

將2 g樣品與100 mL磷酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH值6.5)攪拌120 min，然后離心(10 000g，在20℃下1 h)，測定收集的上清液中的LOX活性提取物。將10 mL上清液與5.0 mL(0.2 mol/L硼酸鈉緩沖液(pH值9.0)和 0.02 mol/L亞油酸)混合。用234 nm處吸光度計算LOX活性[15]，脂肪氧化酶(LOX)活性計算公式為

(4)

式中A1——豆乳樣品在234 nm處吸光度

A2——生豆乳在234 nm處吸光度

1.3.9.4植酸測定

參照文獻(xiàn)[16]采用三氯化鐵比色法測定 PA 含量。以植酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品建立 PA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，取 1.000 g 豆乳樣品，加入 50 mL 1.2% HCl，10% Na2SO4混合溶液于離心管中攪拌均勻，靜置浸提2 h，選擇離心機(jī)7 000 r/min，離心30 min，取全部上清液在4℃保存。取3.0 mL樣品液于25 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，上清液即為測定液，加入1 mL 0.2% 磺基水楊酸-0.02%FeCl3作為顯色劑，渦旋混勻；不含樣品溶液，即為比色空白溶液?？瞻滓赫{(diào)零，在500 nm波長下測定吸光度。通過PA標(biāo)準(zhǔn)曲線查出PA含量。

1.3.9.5大豆凝集素測定

取10 mL豆乳樣品，置于100 mL燒杯中，加入20 mL 0.85% NaCl 溶液，混勻，放入冰箱4℃浸提48 h，期間每隔6 h搖動1次。浸提完成的樣品在10 000 r/min、4℃離心 20 min，取上清液于-10℃保存待用。按照購買的大豆凝集素 ELISA試劑盒(96孔)中的使用說明書進(jìn)行實驗。

1.3.9.6ELISA法測定大豆抗原蛋白含量

取10 mL待測樣品，加入 20.0 mL、0.03 mol/L的 Tris-HCl(pH值8.0，含有 0.01 mol/L β-巰基乙醇)緩沖液中，置于恒溫?fù)u床 28℃、180 r/min浸泡1 h，再經(jīng)過7 000 r/min離心 15 min，取上清液 4.0℃ 保存?zhèn)溆肹17]。

抗原活性檢測：按照購買的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白 ELISA試劑盒(96孔)中的使用說明書進(jìn)行實驗。在酶標(biāo)板中加入 50 μL 稀釋樣、50 μL 的抗體工作液，37℃ 溫育 0.5 h；棄液后加洗滌液 200 μL 洗滌 4 次；加入HPR標(biāo)記二抗 100 μL，37℃ 溫育30 min；棄液洗滌 4 次，加入 100 μL 混勻的顯色液，37℃ 溫育 15 min，最后加入終止液 50 μL，輕晃混勻后，立即于酶標(biāo)儀 450 nm 處讀取吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算抗原蛋白含量，抗原蛋白抑制率計算公式為[17]

(5)

式中A′1——生豆乳中抗原蛋白含量

A′2——樣品中抗原蛋白含量

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果取3次平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用IBM SPSS 25軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性水平為P<0.05。采用 Image Lab 軟件分析SDS-PAGE圖譜，采用 Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)輔助酶解對豆乳溶解性和水解度影響

溶解性是影響豆乳蛋白功能和結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，由圖1a可知，高壓均質(zhì)預(yù)處理過程中，豆乳的NSI 隨著均質(zhì)壓力的增大呈上升趨勢，當(dāng)均質(zhì)壓力為100 MPa時，豆乳蛋白的NSI最高，為81.6%，這可能是均質(zhì)處理可以將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，親水基團(tuán)暴露，蛋白分子表面疏水基團(tuán)分子間相互作用減小，增加了豆乳蛋白的水合作用。高壓均質(zhì)輔助酶解處理使豆乳的NSI進(jìn)一步增加，這是因為高壓均質(zhì)處理促進(jìn)酶與底物蛋白質(zhì)充分接觸，酶解導(dǎo)致豆乳蛋白肽鍵斷裂，暴露更多可電離氨基和羧基，從而提高其溶解性[18]。其中，100 MPa高壓均質(zhì)預(yù)處理條件下，E1、E2和E3豆乳NSI分別為88.1%、91.9%和90.8%，表明E2對豆乳蛋白的識別度高于E1和E3，酶解效果最佳。

圖1 高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳的NSI和DH

水解度(DH)是衡量豆乳酶解程度的重要標(biāo)準(zhǔn)[19]。圖1b顯示了不同均質(zhì)壓力下3種酶解豆乳的DH變化，高壓均質(zhì)預(yù)處理增加了豆乳的水解度，當(dāng)均質(zhì)壓力增加到100 MPa時 DH 達(dá)到最大，這可能是高壓均質(zhì)的機(jī)械作用使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，暴露更多蛋白酶結(jié)合位點，有效提高了酶解效率。結(jié)果顯示3種酶解豆乳DH從大到小依次為 E2、E3、E1，E2 酶解豆乳的 DH 最大值為 8.24%，這可能是因為 E2 的酶活力較高，E2 的酶切位點是精氨酸、賴氨酸、甘氨酸的羧基端，與豆乳的特異性較高。當(dāng)豆乳中更多的蛋白質(zhì)發(fā)生降解時，ANF 組分同時也被降解，達(dá)到降低豆乳 ANF 的作用。DH 反映了酶的作用效果進(jìn)而揭示了大豆 ANF 組分的變化關(guān)系[20]。

2.2 粒徑、電位分析

豆乳的粒徑分布能反映豆乳中顆粒的大小和均勻性。如圖2(圖中圖例數(shù)字零表示生豆乳，下同)所示，生豆乳的粒徑分布在460 nm左右。采用 E1、E2、E3 酶解處理后，導(dǎo)致豆乳粒徑增大，大顆粒體積向右偏移至600、700、620 nm左右。隨著均質(zhì)壓力的增加粒徑開始減小，100 MPa 時體積分布向左移動至 300 nm 左右，達(dá)到最佳狀態(tài)，粒徑與蛋白質(zhì)的溶解度和酶解程度直接相關(guān)，即當(dāng)形成較小的豆乳顆粒時，蛋白質(zhì)具有更好的溶解性，這種現(xiàn)象更有利于蛋白質(zhì)的降解，從而達(dá)到較高的 DH。電位是判斷豆乳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，豆乳顆粒越小則電勢絕對值越大，粒子之間的排斥力越大，使系統(tǒng)越穩(wěn)定。如圖2顯示，與生豆乳對比高壓均質(zhì)處理和酶解豆乳均使蛋白質(zhì)表面帶電荷量顯著增加，這可能由于蛋白顆粒之間產(chǎn)生較大的靜電斥力，導(dǎo)致蛋白的帶電荷量增多從而使豆乳體系更加穩(wěn)定[21]。

圖2 高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳的粒徑和電位

2.3 表觀穩(wěn)定性及微觀形態(tài)的分析

圖3為豆乳在高倍顯微鏡下的微觀形態(tài)圖，可以看出蛋白質(zhì)顆粒直徑較大并容易聚集，分散性較差，由以上結(jié)果可知 E2 酶解豆乳的 DH 較高，因此進(jìn)一步觀察不同均質(zhì)壓力下 E2 酶解豆乳的微觀變化。120 MPa-未加酶豆乳與生豆乳相比，結(jié)構(gòu)變得松散，但顆粒大小并未發(fā)生明顯變化，E2 水解使豆乳顆粒尺寸明顯減小，30 MPa-E2豆乳的粒徑減小，但液滴分散并不均勻；隨著均質(zhì)壓力繼續(xù)增加，70 MPa-E2豆乳的分散性逐漸變好，100 MPa-E2豆乳蛋白顆粒尺寸達(dá)到最小并且液滴分散很均勻，當(dāng)壓力增加至120 MPa時，蛋白顆粒出現(xiàn)集聚現(xiàn)象形成一簇條形或球形的狀態(tài)，這說明均質(zhì)壓力過大使豆乳蛋白受到劇烈的碰撞剪切，誘導(dǎo)蛋白分子重新結(jié)合導(dǎo)致少量蛋白出現(xiàn)堆積現(xiàn)象。說明適當(dāng)壓力處理(100 MPa)能夠促進(jìn)酶解豆乳中蛋白質(zhì)肽鏈的斷開，產(chǎn)生更多小分子多肽，從而改變豆乳蛋白的線性表位與結(jié)構(gòu)特性。

圖3 豆乳顯微結(jié)構(gòu)圖

圖4(圖中0～7分別表示生豆乳，水解豆乳(E1、E2、E3)，100 MPa輔助(未加酶、E1、E2、E3)水解豆乳；a～c表示100 MPa輔助(E1、E2、E3)豆乳粉)是豆乳在4℃條件下貯藏30 d的表觀圖像，可以看出生豆乳產(chǎn)生了比較明顯的沉淀，并伴有少量脂肪上浮的“乳析”現(xiàn)象產(chǎn)生[22]。經(jīng)100 MPa均質(zhì)處理豆乳則無明顯沉淀產(chǎn)生。E1、E2、E3酶解豆乳在儲藏30 d時間內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的分層現(xiàn)象，但明顯低于未處理豆乳。采用高壓均質(zhì)100 MPa輔助 E1、E2、E3 酶解，結(jié)果顯示無明顯沉淀和分層現(xiàn)象，說明高壓均質(zhì)輔助酶解可明顯提高豆乳體系穩(wěn)定性。此外，不同蛋白酶水解使豆乳粉的色澤發(fā)生改變，可以看出 E3 豆粉顯淡黃色，顏色較 E1和 E2 豆粉略深，所有豆粉顆粒較細(xì)且品質(zhì)較好。

圖4 豆乳儲存穩(wěn)定性及豆粉表觀圖

2.4 高壓均質(zhì)輔助蛋白酶解豆乳對大豆蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1SDS-PAGE電泳分析

豆乳中的ANF組分主要有11S、7S和SBA等。7S的抗原表位主要在α′、α和β這3個亞基上，11S的抗原表位存在于酸性亞基A和堿性亞基B兩條肽鏈上，SBA以四聚體糖蛋白的形式存在于大豆中，亞基的分子量為30 kDa[23]。由圖5(圖中M表示marker；圖5a中1～6表示0、30、70、90、100、120 MPa輔助 E1 水解；圖5b中1～7分別表示生豆乳，30、70、90、100、120 MPa輔助 E2 水解，120 MPa-未水解；圖5c中1～6分別表示生豆乳，30、70、90、100、120 MPa輔助E3水解)可知，與生豆乳相比，隨著均質(zhì)壓力增大，豆乳蛋白與3種酶作用效果顯著增強(qiáng)，豆乳蛋白水解度提高，分解產(chǎn)生大量小分子量肽段或氨基酸[24]。研究表明，高壓均質(zhì)輔助酶解使豆乳蛋白的7S和11S亞基去除效率較高，α′和α條帶在較低均質(zhì)壓力條件則消失，表明大分子蛋白亞基條帶首先被酶解成小分子亞基，隨著均質(zhì)壓力提高至100 MPa時，β、A和B亞基條帶進(jìn)一步變淺或消失，表明此時豆乳蛋白被進(jìn)一步分解。通過豆乳蛋白的分子量分布結(jié)果得出這3種蛋白酶對抗原蛋白的抑制作用從大到小依次為E2、E3、E1，對SBA的抑制作用從大到小依次為E2、E3、E1。相比之下E2對豆乳蛋白的特異性較高，此外，適當(dāng)高壓均質(zhì)壓力(100 MPa)可以促進(jìn)蛋白酶的水解作用，對大豆抗?fàn)I養(yǎng)蛋白亞基組分起到良好的降解作用。

圖5 酶解豆乳SDS-PAGE圖譜

2.4.2蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

圖6 豆乳蛋白紅外光譜圖

利用Peak Fit擬合圖譜計算，得出二級結(jié)構(gòu)含量如表1所示，采用E1、E2、E3處理后α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量呈減少趨勢，β-轉(zhuǎn)角含量呈增加趨勢，E3所得產(chǎn)物α-螺旋含量最少，E2 對 β-折疊的影響較大，可能由于E2水解作用較強(qiáng)能將蛋白內(nèi)部的 β-折疊破壞導(dǎo)致減少，E1 水解使無規(guī)則卷曲含量最少；100 MPa 預(yù)處理輔助 E1、E2、E3 處理促進(jìn)了二級結(jié)構(gòu)的變化趨勢，這可能是由于均質(zhì)處理使其疏水位點暴露，增加了酶解效果，使豆乳中高級結(jié)構(gòu)解聚，肽鏈被打斷。通過對二級結(jié)構(gòu)含量的分析發(fā)現(xiàn)蛋白酶解后的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量降低，從而使ANF表位尤其是抗原蛋白表位被掩蓋，這與文獻(xiàn)[26]的結(jié)果相一致。

表1 豆乳蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量

2.4.3熒光光譜分析

圖7為高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳的熒光光譜圖?？梢钥闯觯谷榈臒晒鈴?qiáng)度顯示最高，3種酶水解豆乳的最大吸收峰發(fā)生紅移且熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，并隨著均質(zhì)壓力增加熒光吸收繼續(xù)減少，這可能是由高壓均質(zhì)處理導(dǎo)致豆乳蛋白分子部分解折疊造成的，使蛋白柔性增加，三級結(jié)構(gòu)變得更加舒展，色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，增加了酶的識別度，酶解后出現(xiàn)紅移現(xiàn)象說明蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域局部改變，發(fā)色基團(tuán)(如色氨酸殘基)所處環(huán)境由非極性向極性轉(zhuǎn)化[27]，因此豆乳的極性增加從而吸收峰發(fā)生紅移同時也使豆乳的基態(tài)更加穩(wěn)定。這些結(jié)果表明，高壓均質(zhì)改變了豆乳蛋白的空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了酶的水解作用，并一定程度上破壞抗原蛋白的構(gòu)象表位，從而影響了ANF組分的活性，文獻(xiàn)[28]研究表明，植物蛋白ANF多存在于其親水區(qū)域，酶解后導(dǎo)致疏水區(qū)域暴露，11S、7S和SBA蛋白親水區(qū)域表位被掩蓋或破壞，從而可能達(dá)到降低豆乳ANF的效果。

圖7 高壓均質(zhì)輔助酶解豆乳的熒光光譜圖

2.5 抗?fàn)I養(yǎng)因子分析

圖8顯示，未酶解豆乳隨著均質(zhì)壓力的增加 ANF 呈減少趨勢，當(dāng)壓力為120 MPa 時豆乳中的11S、7S、PA、SBA、TI、LOX 的抑制率達(dá)到最大，實驗結(jié)果分別為 14.37%、24.68%、38.05%、23.13%、32.69%、23.7%。高壓均質(zhì)處理使豆乳中 ANF 減少，這可能是因為高壓均質(zhì)處理使豆乳蛋白分子被降解以及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而破壞或改變了 ANF 組分的抗原表位，壓力越大就會使更多 ANF 蛋白表位被破壞。此外，PA 的失活機(jī)制還與高壓均質(zhì)觸發(fā)了大豆內(nèi)部植酸酶的活性有關(guān)，植酸酶可以去除豆乳中的植酸鹽成分，從而使 PA 含量降低[29]。這表明了高壓均質(zhì)預(yù)處理豆乳對 ANF 具有一定的抑制作用。

圖8 高壓均質(zhì)輔助酶解對抗?fàn)I養(yǎng)因子抑制率

高壓均質(zhì)輔助 E1、E2、E3 酶解處理對 ANF 的影響如圖8所示，實驗結(jié)果表明，所有酶水解對 ANF 組分均具有良好的降解效果，其抑制率隨著均質(zhì)壓力(0～100 MPa)的增大呈不斷增加的趨勢，當(dāng)壓力超過 100 MPa 時變化趨勢逐漸平緩甚至減少。這表明了適度的均質(zhì)壓力預(yù)處理，可以使豆乳蛋白柔性增加，結(jié)構(gòu)更加舒展，促進(jìn)了蛋白酶對豆乳蛋白的水解作用，從而使豆乳ANF含量逐漸降低，但隨著壓力繼續(xù)增大，蛋白發(fā)生重新凝聚，反而不利于蛋白酶的作用，因此選擇最佳均質(zhì)壓力為100 MPa[30]。其中熱不穩(wěn)定性ANF會受溫度的影響，高壓均質(zhì)過程中產(chǎn)生的熱量以及蛋白酶在沸水中的滅活處理，這都影響了UA、TI、SBA 和 LOX的活性。UA受熱極易失活，實驗結(jié)果也表示所有酶水解豆乳中的UA均呈陰性；酶水解對 TI、SBA 和 LOX 組分也具有顯著的抑制效果(P<0.05)，尤其是 E2 和 E3 抑制率顯著高于E1，其中100 MPa-E2對 TI、SBA 和 LOX 的抑制率可達(dá)到 83.94%、70.4% 和 80.72%。E2 和 E3 對 PA 的抑制結(jié)果相近，最大抑制率為 72.26%，E2對 11S 和 7S 的抑制率高于E1和E3，這與豆乳蛋白的DH結(jié)果一致，即DH越大，高分子量蛋白顆粒的降解效果越好，對 ANF抑制作用越強(qiáng)。豆乳蛋白二級結(jié)構(gòu)中 α-螺旋和 β-折疊含量的減少，三級結(jié)構(gòu)中疏水區(qū)域減少，以及電泳圖譜顯示 E2 水解豆乳中的 11S 和 7S 蛋白亞基條帶最淺，都表明了 E2 對 ANF 組分的抑制效果最好。ELISA 結(jié)果也驗證了 E2 對 11S 和 7S 抑制率高于E1和E3，100 MPa-E2 水解對 11S 和 7S 的抑制率為 51.28% 和 57.83%。綜上所述，高壓均質(zhì)處理通過改變豆乳蛋白的結(jié)構(gòu)在一定程度上抑制了豆乳蛋白的ANF活性，但并未完全消除，這歸因于物理處理只是破壞了豆乳蛋白的構(gòu)象表位。此外，E2 水解豆乳中的ANF含量小于 E1 和 E3，E2 對 7S和 11S 的抑制作用較強(qiáng)，由此得出高壓均質(zhì) 100 MPa-E2 酶解豆乳對 ANF 抑制作用達(dá)到最佳效果。

3 結(jié)束語

對高壓均質(zhì)-蛋白酶解降低豆乳ANF工藝進(jìn)行研究，結(jié)果表明，經(jīng)100 MPa高壓均質(zhì)預(yù)處理輔助E2酶解豆乳的NSI和DH最大，豆乳的粒徑均勻穩(wěn)定，沉淀率變小，儲存穩(wěn)定性較好，并且蛋白質(zhì)顆粒呈現(xiàn)均勻分散狀態(tài)。同時改變了豆乳蛋白的分子量分布，7S、11S以及SBA蛋白亞基發(fā)生降解；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有ANF表位的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)減少；蛋白熒光吸收強(qiáng)度降低并呈現(xiàn)紅移現(xiàn)象，三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；通過測定豆乳中的脲酶呈陰性，其中100 MPa-E2所得豆乳中的ANF含量最少，因此得出E2對豆乳中ANF的抑制作用最強(qiáng)。