氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖的生物合成研究進(jìn)展

劉歆璐，陳馮千芮，張嘉頎，李建承，王鵬超,2*

1(東北林業(yè)大學(xué) 奧林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)2(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040)

氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)作為D型葡萄糖的重要衍生物之一，由葡萄糖的2號(hào)位羥基被氨基取代而形成[1]。GlcN及其多種衍生物是各類多糖的組成成分，在保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)都起到重要作用[2]。GlcN和軟骨素作為蛋白多糖的合成底物，已經(jīng)被開發(fā)用于治療骨關(guān)節(jié)炎，其中結(jié)晶硫酸葡萄糖胺被證明可以廣泛應(yīng)用于臨床治療老年人群的關(guān)節(jié)疾病[3]。其次，以GlcN和(N-acetylglucosamine，GlcNAc)為單體組成的殼寡糖還可以作為化妝品成分起到改善皮膚抗氧化的作用[4]。在分子水平中，GlcN可以通過改變游離核苷酸含量，阻斷信號(hào)通路等方式實(shí)現(xiàn)抗氧化和抗炎活性，從而有效對(duì)抗多種癌細(xì)胞[5]。GlcNAc還能夠在多個(gè)生物體中引發(fā)形態(tài)和脅迫相關(guān)刺激的反應(yīng)[6]。除此之外，GlcN的衍生物GlcNAc在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫耐受和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中都具有重要的生物學(xué)意義[7]。

由于GlcN和GlcNAc的廣泛用途，如何經(jīng)濟(jì)、綠色的獲取GlcN和GlcNAc被廣泛的研究。傳統(tǒng)方法包括化學(xué)水解法和酶水解法?；瘜W(xué)水解法主要是通過對(duì)甲殼素或幾丁質(zhì)實(shí)現(xiàn)去乙?；徒饩鄯磻?yīng)合成產(chǎn)物GlcN和GlcNAc。酶水解法通常是利用內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和β-N-乙酰氨基己糖苷酶分解幾丁質(zhì)而合成GlcNAc單體。這兩種方法存在成本較高、不穩(wěn)定、原材料供應(yīng)有限和容易被污染等問題[8-9]。利用基因工程改造的微生物合成GlcN和GlcNAc具有高質(zhì)量和高滴度的優(yōu)點(diǎn)并有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[10]。通過對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等微生物進(jìn)行基因工程改造，轉(zhuǎn)入不同的表達(dá)質(zhì)粒，從而篩選出最優(yōu)的表達(dá)體系[11]，這類具有代表性的生物合成方法已被廣泛研究并取得了一定的研究成果。

GlcN和GlcNAc生物合成前體源于果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，F(xiàn)ru-6-P)，是糖酵解中的關(guān)鍵底物，經(jīng)過轉(zhuǎn)氨基合成氨基葡萄糖-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)，再轉(zhuǎn)乙?；铣蒒-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(N-acetylglucosamine-6-P，GlcNAc-6-P)，其大量合成與細(xì)胞的生長(zhǎng)存在天然的矛盾；與此同時(shí)，以E.coli和B.subtilis為底盤菌株存在GlcN和GlcNAc的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑，可將其轉(zhuǎn)化為Fru-6-P進(jìn)一步被代謝。天然狀態(tài)下GlcN和GlcNAc的生物合成受到細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控。目前，GlcN和GlcNAc的生物合成優(yōu)化主要包括3個(gè)思路(圖1)：(1)GlcN 和GlcNAc合成途徑的優(yōu)化，通過對(duì)合成途徑酶的篩選、過表達(dá)和競(jìng)爭(zhēng)性代謝途徑的抑制提高產(chǎn)量；(2)關(guān)鍵合成酶基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控，通過GlmS合酶與sRNA實(shí)現(xiàn)微生物生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的動(dòng)態(tài)調(diào)控；(3)菌株、關(guān)鍵酶的適應(yīng)性進(jìn)化，將產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)耦聯(lián)模擬自然進(jìn)化方式獲得有較高產(chǎn)物合成水平的突變個(gè)體。本文將以微生物發(fā)酵為背景，通過分析現(xiàn)有研究中典型基因元件的功能，從以上3個(gè)方面介紹目前GlcN和GlcNAc生物合成的研究進(jìn)展，并對(duì)生物合成GlcN及GlcNAc的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展前景進(jìn)行展望。

a-加強(qiáng)表達(dá)合成途徑中的關(guān)鍵基因并敲除相關(guān)基因以阻斷旁路途徑和減少中心代謝分流；b-利用B. subtilis來源glmS核酶對(duì)GlmS的反饋調(diào)控，sRNA對(duì)E. coli的glmS基因mRNA穩(wěn)定性的影響；c-通過隨機(jī)突變和高通量篩選獲得具有高產(chǎn)性狀的菌株

1 GlcN合成途徑概述

在代謝工程改造中，GlcN和其衍生物GlcNAc的合成通路被人們廣泛研究，其中以E.coli和B.subtilis為典型代表[2]。在E.coli天然合成GlcN的通路中，葡萄糖為底物在ptsG的轉(zhuǎn)運(yùn)作用下利用磷酸化丙酮酸生成葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，Glc-6-P)。Glc-6-P再經(jīng)過變構(gòu)形成GlcN產(chǎn)物前體Fru-6-P。GlcN合成酶由glmS編碼，在谷氨酰胺的協(xié)助下，可以將Fru-6-P轉(zhuǎn)變?yōu)镚lcN-6-P[12]。值得注意的是，E.coli胞外空間的磷酸酶可以實(shí)現(xiàn)去磷酸化作用，但目標(biāo)產(chǎn)物GlcN的分泌機(jī)制仍待研究。除此之外，在GlcN合成通路中許多中間代謝產(chǎn)物會(huì)參與部分糖酵解代謝途徑或細(xì)胞壁的合成，是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的重要組成部分[8]。

B.subtilis天然合成GlcN的通路與E.coli類似，但編碼相同作用酶的具體基因略有不同。例如：在B.subtilis中葡萄糖是在glck編碼的葡萄糖激酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化，生成葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)[13]。其次，在E.coli和B.subtilis的GlcNAc合成中，通常都需要人工外源引入GNA1，其編碼的乙酰基轉(zhuǎn)移酶可以使GlcN-6-P在乙酰輔酶A作用下生成GlcNAc-6-P，從而達(dá)到減輕GlcN對(duì)宿主細(xì)胞抑制的作用。后續(xù)再次利用磷酸酶，實(shí)現(xiàn)去磷酸從而生成目標(biāo)產(chǎn)物GlcNAc[14]。需要注意的是進(jìn)行工程改造后的B.subtilis以GlcNAc合成為主，其中部分工程菌株發(fā)酵合成GlcNAc已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化[15]。

2 GlcN和GlcNAc合成途徑的優(yōu)化

2.1 增強(qiáng)GlcN合成途徑

目前，研究者已對(duì)GlcN代謝途徑、代謝過程中涉及的酶及對(duì)應(yīng)的編碼基因進(jìn)行了深入研究[16]。人工改造優(yōu)化工程菌的GlcN合成途徑是目前研究的主要方向。

GlcN在生物體內(nèi)通過氨基己糖途徑合成(圖1-a)，其中，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFPT)所催化的反應(yīng)是氨基己糖途徑的第一步[17]。在原核生物中該轉(zhuǎn)氨酶(以下簡(jiǎn)稱GlmS合酶)由glmS基因編碼，能以谷氨酰胺作為氨基供體催化Fru-6-P生成GlcN-6-P，是GlcN合成途徑中第一個(gè)限速反應(yīng)[12, 18]。DENG等[19]將含有g(shù)lmS基因的載體(pT7lac-glmS)轉(zhuǎn)化到E.coli7101-17中，將GlcN水平提高到75 mg/L，比利用天然GlcN合成途徑的野生型E.coli提高了15倍。此外，該反應(yīng)的逆反應(yīng)由nagB編碼的一種氨基葡萄糖脫氨酶催化，該酶在酸性條件下脫氨反應(yīng)酶活性較高，負(fù)責(zé)將GlcN-6-P轉(zhuǎn)化為Fru-6-P，但是NagB在偏堿性條件下轉(zhuǎn)氨酶活性較高，可催化Fru-6-P合成GlcN-6-P[20]。王珊珊等[21]嘗試將重組載體pET15B-nagB轉(zhuǎn)化入E.coliRosetta，pH=9.0的發(fā)酵條件下GlcN產(chǎn)量提高至對(duì)照菌的2.1倍，證明NagB在特定條件下可以促進(jìn)GlcN-6-P的合成。

然而，在正常的代謝合成中GlcN-6-P無法大量積累[17]。主要原因是GlcN-6-P是GlmS的有效競(jìng)爭(zhēng)反饋抑制劑(KI=380 μmol/L，KI/Km=0.6)[12]。在B.subtilis中，由于glmS核酶的存在，GlmS合酶的合成同樣受到GlcN-6-P的反饋抑制。為了緩解GlcN-6-P的抑制，DENG等[14]采用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)glmS基因進(jìn)行篩選，獲得了一種抗性glmS基因，降低GlcN-6-P濃度對(duì)GlmS酶生產(chǎn)的影響。在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)下，其中最好的E.coli突變株2123-54過度表達(dá)突變glmS基因產(chǎn)生了6 g/L GlcN，比產(chǎn)量為75 mg/L的野生型E.coli2123-12菌株高20倍。

此外，實(shí)驗(yàn)室改造通常將glmS基因與乙酰轉(zhuǎn)移酶基因GNA1共表達(dá)。GNA1可以將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到GlcN-6-P上，催化其轉(zhuǎn)化為GlcNAc-6-P，最終生成GlcN的衍生物GlcNAc[22]。GlcNAc性質(zhì)穩(wěn)定，在酸性條件下可水解為GlcN。但E.coli、谷氨酸棒桿菌谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)和B.subtilis均不存在GNA1基因[23]。因此，異源表達(dá)GNA1和構(gòu)建高表達(dá)glmS和GNA1通路是目前常見的策略。DENG等[14]將釀酒酵母(ScGNA1)、白色念珠菌(CaGNA1)和擬南芥(AtGNA1)的GNA1基因克隆到表達(dá)載體pET24d，轉(zhuǎn)化入E.coli7107-18中以合成GlcNAc，以葡萄糖為碳源，在補(bǔ)充酵母提取物和核糖的情況下用IPTG誘導(dǎo)，最終表達(dá)有ScGNA1的菌株GlcNAc水平達(dá)到11.7 g/L[14]。同年，DENG等[19]將含有nagB和GNA1的載體(pT7lac-nagB, PT7lac-GNA1)轉(zhuǎn)化入glmS缺失菌株中，其GlcNAc產(chǎn)生水平與含有g(shù)lmS(pT7lac-glmS*54)和GNA1(pT7lac-GNA1)菌株一致，證明GNA1的過表達(dá)在決定NagB催化反應(yīng)的方向和效率中起到了關(guān)鍵作用。以葡萄糖為碳源并在乳糖誘導(dǎo)下，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到24.0 g/L[19]。陳欣[24]將重組質(zhì)粒pET28(a)-glmS-GNA1轉(zhuǎn)化入E.coliATCC 25947 (DE3)，在TB培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為100 g/L，甘油體積分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，GlcNAc發(fā)酵產(chǎn)量為24.15 g/L。丁振中等[25]將pET24(a)-glmS-GNA1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E.coliBL21，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在葡糖質(zhì)量濃度為150 g/L，甘油質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，GlcNAc發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到31.2 g/L。在B.subtilis中，LIU等[10]將pxylA-glmS-GNA1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入B.subtilis168，在木糖的誘導(dǎo)下GlcNAc水平為240 mg/L。

2.2 阻斷旁路途徑

要實(shí)現(xiàn)GlcN的高效合成，需要在強(qiáng)化GlcN合成的同時(shí)阻斷GlcN降解途徑，弱化中心代謝和肽聚糖合成通路，盡最大可能降低旁路對(duì)葡萄糖的消耗。在B.subtilis中，NagR作為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，由nagP和nagAB調(diào)節(jié)基因組成。前者負(fù)責(zé)GlcNAc的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，后者編碼GlcNAc-6-P的脫乙?；负虶lcN-6-P的脫氨酶，進(jìn)而促進(jìn)生成Fru-6-P。而細(xì)胞內(nèi)的GlcNAc-6-P的含量可以對(duì)NagR的抑制活性進(jìn)行自主調(diào)節(jié)，從而控制UDP-GlcNAc合成通路的表達(dá)[26]。由于UDP-GlcNAc作為底物合成肽聚糖的通路與合成GlcN和GlcNAc通路形成競(jìng)爭(zhēng)，在工程改造中敲除UDP-GlcNAc合成通路相關(guān)基因可以作為提高產(chǎn)量的方式[8]。LIU等[10]敲除重組菌B.subtilis168-glmS-GNA1中nagP和nagAB，經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵，GlcNAc產(chǎn)量從240 mg/L提高至5.19 g/L。相同的敲除思路可以應(yīng)用在E.coli的GlcN和GlcNAc的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中。GlcN和GlcNAc可以分別通過由manXYZ編碼的甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和nagE編碼的乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)再次進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而影響產(chǎn)物在培養(yǎng)液的積累[27]。陳欣[24]運(yùn)用Red同源重組技術(shù)敲除重組菌E.coli-glmS-GNA1中的nagE與manX，研究其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)GlcN的影響。在敲除nagE與manX后，GlcN產(chǎn)量從24.15 g/L提高至93.0 g/L。這表明nagE與manX基因的敲除可顯著降低GlcN與GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高GlcN 與GlcNAc在胞外的累積量。

由于GlcN的生物合成直接與中心碳代謝競(jìng)爭(zhēng)前體供應(yīng)，細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的葡萄糖消耗嚴(yán)重限制了GlcN的產(chǎn)量。其中Fru-6-P是GlcN合成的關(guān)鍵前體，在糖酵解過程中也起著重要作用。其向代謝中心碳的碳流動(dòng)是由葡萄糖合成GlcN途徑產(chǎn)量低的主要原因。pfkA基因編碼酶具有Fru-6-P的激酶活性，負(fù)責(zé)催化Fru-6-P合成果糖1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate，fbp)[28]。MA等[29]敲除pfkA基因，以甘油/葡萄糖為碳源并引入glpK突變體提高甘油的利用率，以甘油作為碳源供細(xì)胞生長(zhǎng)，葡萄糖為底物合成目標(biāo)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了混合碳源合成GlcNAc。所得菌株GLALD-7在5 L生物反應(yīng)器中使用混合m(甘油)∶m(葡萄糖)=1∶8，碳源生產(chǎn)GlcNAc達(dá)到179.7 g/L。

3 GlcN和GlcNAc動(dòng)態(tài)調(diào)控的優(yōu)化

3.1 glmS核酶的動(dòng)態(tài)調(diào)控

在B.subtilis中，GlmS酶可催化Fru-6-P形成GlcN-6-P[30]，由響應(yīng)GlcN-6-P濃度的glmS核酶對(duì)glmS基因進(jìn)行順式調(diào)控[31]。glmS核酶是一段小RNA序列，存在于GlmS mRNA的5′UTR中，可以特異性識(shí)別GlcN-6-P并與其結(jié)合[32]，激活內(nèi)部磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對(duì)GlmS mRNA的5′UTR進(jìn)行切割，在編碼區(qū)上游暴露出5′—OH從而使mRNA被細(xì)胞內(nèi)RNA酶降解，形成反饋抑制[33]。研究表明由于glmS核酶的作用，在GlcN-6-P不存在的條件下glmS基因的mRNA的自發(fā)降解速率比無核酶調(diào)控時(shí)快1 000倍以上，在GlcN-6-P存在的條件下，glmS核酶對(duì)GlcN-6-P濃度的增加呈線性反應(yīng)，代謝物濃度增加10倍，核酶功能增加10倍[34]。因此，glmS核酶對(duì)GlcN-6-P的負(fù)反饋抑制是B.subtilis生產(chǎn)GlcN水平較低的原因之一。

為了提高細(xì)胞內(nèi)GlcN-6-P積累，牛騰飛[35]敲除glmS核酶，同時(shí)在glmS基因上游整合一段trp終止子和強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P43的序列，增強(qiáng)glmS基因表達(dá)的同時(shí)解除glmS核酶的反饋抑制，使B.subtilis重組菌S-5G的GlcNAc產(chǎn)量由9.2 g/L提升至12.2 g/L，比初始菌株轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒得到的重組菌株N6-G的產(chǎn)量9.2 g/L提升了3 g/L，轉(zhuǎn)化率由0.106 g/g提高到0.167 g/g[36]。此外，MARTICK等[37]發(fā)現(xiàn)核酶引發(fā)mRNA自切割的機(jī)制不僅存在于原核生物，同樣也存在于真核生物中。LEE等[38]使用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為實(shí)驗(yàn)材料，通過改造glmS核酶，將其置于編碼胞嘧啶脫氨酶的FCY1基因后，構(gòu)建人造核糖開關(guān)作為篩選高產(chǎn)GlcN-6-P菌株的標(biāo)志。在氟胞嘧啶存在條件下，高產(chǎn)GlcN-6-P的菌株由于glmS核酶對(duì)FCY1基因的抑制體現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，篩選出的高產(chǎn)GlcN-6-P的菌株比原始菌株生長(zhǎng)速率最高相差2倍以上，生物量相差5倍以上。

3.2 sRNA對(duì)代謝通路的影響

GlmS合成GlcN-6-P，可以啟動(dòng)細(xì)胞外被膜的生物合成[39]。在E.coli中，glmS的表達(dá)受到sRNA GlmY和GlmZ的反饋控制(圖1-b)[40]。這兩個(gè)sRNA高度相似，但只有GlmZ是直接激活因子，可以在Hfq蛋白的輔助下與glmS基因進(jìn)行堿基配對(duì)，激活glmS的轉(zhuǎn)錄[40]。GlmZ的豐度由RNase的配體蛋白R(shí)apZ(原YhbJ)在衰減水平上控制[41]。當(dāng)GlcN-6-P充足時(shí)，GlmZ被RapZ結(jié)合，并被RNaseE切割失活[42]。當(dāng)GlcN-6-P不足時(shí)，RapZ通過相互作用刺激雙組分系統(tǒng)QseE/QseF的磷酸化，激活glmY的表達(dá)[43]。而GlmY則通過保護(hù)GlmZ免受RapZ切割而間接激活glmS的表達(dá)[40]。GlmY和GlmZ兩種RNA的相互作用被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)GlmS的合成以適應(yīng)細(xì)胞的需要，即實(shí)現(xiàn)GlcN-6-P的穩(wěn)態(tài)[42]。

GlmS是E.coli的GlcN合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，sRNA對(duì)glmS基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為增強(qiáng)GlcN 和GlcNAc合成途徑提供了新的的思路。KALAMORZ等[44]和URBAN等[45]分別發(fā)現(xiàn)，GlmZ和GlmY可以直接或間接調(diào)節(jié)GlmS的合成，因此過表達(dá)其中任何一種RNA都會(huì)導(dǎo)致glmS轉(zhuǎn)錄本和GlmS蛋白的積累。REICHENBACH等[46]研究表明，在yhbJ(RapZ)突變體中，glmS高效表達(dá)。此外，編碼多聚(A)聚合酶PAP-I的pcnB的突變可以導(dǎo)致glmSmRNA的大量積累，從而導(dǎo)致GlmS的過量生產(chǎn)。DURICA等[47]觀察到GlmZ的5′裂解產(chǎn)物(GlmZ*)在RapZ過量生產(chǎn)時(shí)不斷積累。由于GlmZ*保留了綁定RapZ所需的所有元素。因此，GlmZ*可以取代全長(zhǎng)的GlmZ，來抵消RapZ的切割。用sRNA嵌合體在體內(nèi)模擬GlmZ*，嵌合體在體內(nèi)的表達(dá)抑制了內(nèi)源性GlmZ的加工，導(dǎo)致GlmS合成的中度上調(diào)。這一機(jī)制可能有助于調(diào)整一個(gè)強(qiáng)大的glmS基礎(chǔ)表達(dá)水平。由此，可以設(shè)計(jì)與glmS調(diào)控相關(guān)的sRNA改造策略，以期為高產(chǎn)GlcN及其廣泛應(yīng)用提供支持。

4 定向進(jìn)化策略在GlcN合成中的應(yīng)用

GlcN的生物合成能力偏低、對(duì)產(chǎn)物耐受能力較差是影響產(chǎn)量水平提升的主要原因。盡管目前工業(yè)生產(chǎn)上使用的菌株已遠(yuǎn)遠(yuǎn)突破上述水平，其中大都經(jīng)過系統(tǒng)的代謝工程技術(shù)改造和發(fā)酵優(yōu)化控制。由于GlcN代謝通路的復(fù)雜性和基因工程技術(shù)的局限性，我們對(duì)基因組中能夠提高GlcN產(chǎn)量的基因往往是難以預(yù)測(cè)和改造的，因此采用定向進(jìn)化的策略來提高GlcN產(chǎn)量也是近年來的新興熱點(diǎn)[48]。研究者們利用易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)誘變等方法誘導(dǎo)E.coli的GlcN通路發(fā)生隨機(jī)突變，推動(dòng)整體培養(yǎng)環(huán)境的性狀向某一方向改變，進(jìn)而篩選獲得耐受性提升、高產(chǎn)GlcN的E.coli突變株(圖1-c)[49-50]。

徐敏[51]以綠色木霉內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因作為起始材料，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建突變體庫(kù)，通過定向進(jìn)化策略和高通量篩選得到有9個(gè)堿基突變的菌株MECH118，其酶活力是原始菌株的1.81倍。LEE等[38]利用glmS核酶的切割活性，對(duì)編碼胞嘧啶脫氨酶的FCY1基因的mRNA進(jìn)行切割，使高產(chǎn)GlcN-6-P的菌株在氟胞嘧啶存在的條件下有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而GlcN-6-P產(chǎn)量不足的菌株生長(zhǎng)受到抑制，以此來篩選高產(chǎn)GlcN-6-P的菌株。YANG等[11]采用連續(xù)易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)glmS進(jìn)行非理性改造，提升了GlmS對(duì)于產(chǎn)物的耐受性，通過高通量篩選方法從2 700余株克隆的文庫(kù)中篩選獲得一株高產(chǎn)GlcN的突變株，經(jīng)三輪突變后，GlcN產(chǎn)量由初始的2.84 g/L提高到3.57 g/L，相比出發(fā)菌株提高了19%，為進(jìn)一步提升E.coli發(fā)酵合成GlcN能力奠定基礎(chǔ)。馬文龍[52]通過基于易錯(cuò)PCR的關(guān)鍵酶CeGNA1在丙酮酸壓力下的定向進(jìn)化協(xié)同異源脲酶調(diào)控表達(dá)，篩選得到突變體CeGNA1-Q155V/C158G，使關(guān)鍵酶CeGNA1在丙酮酸壓力下催化性能達(dá)到1.25 s-1μM-1，將GlcNAc產(chǎn)量提高到20.6 g/L。同時(shí)，結(jié)合特異性啟動(dòng)子Phag調(diào)控脲酶表達(dá),通過尿素的可控利用緩控胞內(nèi)pH，使GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到25.6 g/L[52]。徐小芳等[53]在B.subtilis采用定向進(jìn)化策略改造CeGNA1，解除底物GlcN-6-P對(duì)重組CeGNA1的抑制作用，使GlcN產(chǎn)量明顯提高。MENGHIU等[30]開發(fā)了一個(gè)高通量篩選幾丁質(zhì)酶活性的系統(tǒng)。在E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中克隆和表達(dá)了地衣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶chiA基因，并利用易錯(cuò)PCR方法生成了突變文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)突變體，其活性比野生型ChiA提高超過2倍。菌株的定向進(jìn)化使高產(chǎn)菌株能夠在特定環(huán)境下存活并不斷繁殖，最終成為優(yōu)勢(shì)菌種被篩選測(cè)序，已成為近年來研究高產(chǎn)菌株的新熱點(diǎn)。

5 總結(jié)與展望

GlcN是糖蛋白、蛋白多糖和糖胺聚糖的基本氨基單糖成分，是人體內(nèi)所有氨基糖的生化前體。同時(shí)，由于GlcN及其乙?；苌颎lcNAc在治療疾病、生產(chǎn)食品和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域具有很大潛力，開發(fā)其經(jīng)濟(jì)高效的工業(yè)化生產(chǎn)越來越受到人們的關(guān)注。利用生物合成手段獲得高產(chǎn)GlcN和GlcNAc的菌株對(duì)其工業(yè)化規(guī)模化生產(chǎn)具有重要意義，具有良好的應(yīng)用前景。目前，通過合成途徑的增強(qiáng)和競(jìng)爭(zhēng)性途徑的阻斷,GlcN的生物合成已取得了可喜的進(jìn)展(表1)。由于GlcN的生物合成涉及葡萄糖攝取、關(guān)鍵底物Fru-6-P在糖酵解與GlcN合成之間的分配、以及細(xì)胞氮平衡等多個(gè)復(fù)雜生理過程，考慮到代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和整體性，進(jìn)一步提高GlcN和GlcNAc的產(chǎn)量存在瓶頸。而轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的動(dòng)態(tài)調(diào)控策略以及隨機(jī)突變和高通量篩選為GlcN的生物合成優(yōu)化賦予的新的動(dòng)力。這些策略的應(yīng)用可以有效平衡細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，進(jìn)一步的篩選獲得潛在的對(duì)GlcN和GlcNAc合成有利的關(guān)鍵靶點(diǎn)。綜上，GlcN和GlcNAc合成要充分利用合成生物學(xué)的工具，合理利用代謝途徑中關(guān)鍵基因和動(dòng)態(tài)調(diào)控元件，實(shí)現(xiàn)代謝流的有效分配，并結(jié)合定向進(jìn)化的策略，以期望獲得高效生產(chǎn)GlcN和GlcNAc的菌株。

表1 微生物發(fā)酵產(chǎn)GlcN及GlcNAc的14種合成策略及來源