一株源自長(zhǎng)壽老人的嗜酸乳桿菌PBIL2-003的分離鑒定及特性與功能評(píng)價(jià)

張化朋，李鳳娟，張顏廷，劉虹，莊金麗，劉敬蘭，王靜

(山東鳳凰生物科技股份有限公司，山東 泰安，271000)

益生菌是指食用一定量后對(duì)機(jī)體健康有益的活的微生物，它們能夠通過自身的繁殖代謝、調(diào)節(jié)微生物群的結(jié)構(gòu)、發(fā)揮益生作用[1]。研究證實(shí)，腸道菌群是維持機(jī)體消化、代謝、免疫等重要生命活動(dòng)平衡的重要因素[2]。免疫是人體健康的基石，機(jī)體免疫功能失調(diào)可能會(huì)引起過敏、炎癥、腫瘤或易受到病原微生物感染等健康問題。研究顯示，腸道菌群通過腸相關(guān)淋巴組織影響免疫系統(tǒng)的發(fā)展和調(diào)節(jié)，腸相關(guān)淋巴組織是機(jī)體抵御病原體、病毒和其他有害微生物的一道重要防線[3]。研究結(jié)果顯示，益生菌可通過增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，提高機(jī)體抗氧化功能并降低炎癥水平，調(diào)控免疫細(xì)胞活性和增強(qiáng)細(xì)胞吞噬功能等多種方式調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)機(jī)體健康[4]。乳酸桿菌、雙歧桿菌等通過發(fā)酵腸道中不易消化的成分產(chǎn)生短鏈脂肪酸等有益代謝產(chǎn)物，降低腸道pH值，促進(jìn)黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、降低炎癥、提高腸道的穩(wěn)定性[5-6]。乳酸菌菌種資源豐富，廣泛存在于動(dòng)植物、空氣、土壤等環(huán)境中，其中在動(dòng)物體內(nèi)和傳統(tǒng)發(fā)酵食品中尤為豐富。長(zhǎng)壽人群作為一個(gè)特殊群體，研究顯示，其腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)存在顯著差異，腸道菌群豐度增加，具有更高的多樣性，其中一些潛在的有益菌的豐度仍隨著年齡而富集[7-9]。本研究擬從長(zhǎng)壽老人糞便中分離篩選益生菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的理化特性、抗逆性及安全性分析，以及小鼠體內(nèi)免疫功能和調(diào)節(jié)腸道菌群的評(píng)價(jià)，以期開發(fā)新的益生菌菌種資源，為功能性益生菌菌株的產(chǎn)業(yè)化研究及應(yīng)用提供性能優(yōu)良、安全的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)昆明小鼠(18±2)g(合格證：NO.370726200100423072)，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；MRS固體培養(yǎng)基、EMB瓊脂(伊紅美藍(lán)瓊脂)、BEA瓊脂(疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂(胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂)培養(yǎng)基、脫纖維綿羊血，青島海博生物技術(shù)有限公司；濃鹽酸、異丙醇、2-巰基乙醇，均為試劑純，濟(jì)南天泰化工有限公司；NaCl、K2HPO4、氫氧化鈉、碳酸鈉、谷氨酰胺、乳酸鋰、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽，均為試劑純，天津凱通試劑公司；豬膽鹽、胃蛋白酶、胰酶、RPM1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]、Hank’s液、青霉素、鏈霉素、藥敏片，北京索萊寶試劑公司；YAC-1細(xì)胞，深圳市豪地華拓生物科技有限公司；乙基苯基聚乙二醇(NONIDET P40，NP40)，上海躍騰生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺，山西普德制藥有限公司；印度墨汁，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F50酶標(biāo)儀，Infinite公司；CX21FS1電子生物顯微鏡，Olympus公司；ML204電子分析天平，Mettler Toledo公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BPN-50CH二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CL5高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；BCD-256 WDGH型冰箱，青島海爾股份有限公司；SJ-CJ-2D超凈工作臺(tái)，蘇潔凈化設(shè)備有限公司；BHC-1300-A2生物安全柜，蘇州通潔凈化科技有限公司；LDZX-75KBS高壓滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海雷磁科學(xué)儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離與鑒定

采集一位山東煙臺(tái)市百歲健康老人的新鮮糞便，用無菌取樣瓶封好后置入冰盒內(nèi)，無菌條件下取糞便中部1 g樣品至100 mL帶玻璃珠的滅菌生理鹽水中，180 r/min搖勻30 min后，移液管吸取1～2 mL搖勻的混懸液于滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧富集培養(yǎng)24 h后，用無菌接種針蘸取培養(yǎng)液在含3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基劃線，37 ℃厭氧恒溫靜置培養(yǎng)48 h后，挑取培養(yǎng)基上具有明顯透明圈的單菌落，接種到MRS斜面上培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。純化菌株送檢中科院微生物研究所進(jìn)行菌株生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析鑒定。

1.3.2 抗逆性與安全性分析

耐酸耐膽鹽評(píng)價(jià)：將分離篩選獲得的菌株活化后，接種于滅菌的液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，按4%轉(zhuǎn)接量分別接種于pH 2.0和含0.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))膽鹽的滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，分別于0、1、2 h取菌懸液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株耐酸耐膽鹽能力[10]。

人工胃液配制及菌株耐受性檢測(cè)：準(zhǔn)確量取20 mL的1 mol/L鹽酸加蒸餾水調(diào)節(jié)pH值為2.5，加入胃蛋白酶(1 g/100mL)，充分溶解后，用孔徑為0.22 μm濾膜過濾除菌即可。菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種于模擬胃液中，在37 ℃條件下培養(yǎng)0.5、1、2 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以0 h活菌數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率[11]。

人工腸液配制及菌株耐受性檢測(cè)：參照關(guān)小鶯等[11]方法改進(jìn)。取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水適量溶解，將兩液混合后加水稀釋至1 000 mL。菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種于模擬腸液中，在37 ℃條件下培養(yǎng)2、4、6、8 h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以0 h活菌數(shù)為對(duì)照，計(jì)算存活率。

藥敏試驗(yàn)：將純化的菌體劃線取單菌落，懸于3 mL生理鹽水中，并調(diào)整菌體濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。用棉簽均勻涂布MRS培養(yǎng)基表面，用滅菌鑷子取不同藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)18～24 h后取出，通過測(cè)量抑菌圈直徑，確定菌株對(duì)不同抗生素的敏感程度[12]。

1.3.3 體內(nèi)功能評(píng)價(jià)

體內(nèi)功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法參考保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2003]42號(hào))。

1.3.3.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體重(20±2) g，每組40只，預(yù)飼7 d后，進(jìn)行灌胃給藥處理；實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組(某品牌增強(qiáng)免疫力保健食品，主要活性成分為1.1 g/100g總皂苷、0.3 g/100g粗多糖)和3個(gè)菌粉組，具體給藥劑量見表1，連續(xù)給藥30 d?？瞻讓?duì)照組除外，在第20天連續(xù)2 d小鼠腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)進(jìn)行免疫抑制造模處理，連續(xù)灌胃30 d后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理及指標(biāo)檢測(cè)[13-14]。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及處理方式

1.3.3.2 免疫器官指數(shù)測(cè)定

末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，稱量小鼠體重，采用斷頸處死小鼠后，解剖取小鼠脾臟和胸腺，去除粘連組織，濾紙吸干后稱重，免疫臟器指數(shù)計(jì)算如質(zhì)量公式(1)所示：

(1)

1.3.3.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

小鼠實(shí)驗(yàn)期滿，無菌取出脾臟，置于盛有Hank′s液的平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)篩過濾，1 000 r/min離心5 min，用Hank′s液清洗兩次，棄清液，收集細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，保證活細(xì)胞比例≥95%，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL備用。

脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)：將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入至24孔培養(yǎng)板中1 mL/孔，取一孔加75 μL 7.5 μg/mL的ConA液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)68 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液及50 μL濃度為 5 mg/mL 的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻至完全溶解紫色結(jié)晶后分裝至96孔板，然后用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定光密度值(OD)，添加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.3.3.4 小鼠血清凝血素的測(cè)定

小鼠血清凝血素的測(cè)定采用血凝法，取脫纖維綿羊血，用生理鹽水洗滌離心(1 000 r/min，5 min)3次，將壓積脫纖維綿羊血細(xì)胞用生理鹽水配成2%(體積分?jǐn)?shù))的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進(jìn)行免疫，5 d后，摘除眼球取血，37℃水浴30 min使血清析出，離心(3000 r/min，10 min)收集血清。

取微量血凝板，每孔加100 μL血清，用生理鹽水倍比稀釋血清，再加入100 μL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))SRBC懸液，混勻，加蓋后于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，觀察血球凝集程度。血清凝集程度按照5級(jí)(0～4級(jí))記錄，按照公式(2)計(jì)算抗體積數(shù):

抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn)

(2)

式中:1，2，3……n代表倍比稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別。

1.3.3.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，稱量小鼠體重，從小鼠尾靜脈注射印度墨汁(100 mL/kg，生理鹽水稀釋4倍)，注入墨汁2 min和10 min后，用毛細(xì)管從眼眥靜脈取血20 μL，立即吹打至2 mL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Na2CO3溶液中，用Na2CO3溶液作空白對(duì)照，測(cè)定600 nm處光密度值。同時(shí)處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干血污后精確稱重。按照公式(3)～公式(4)計(jì)算吞噬指數(shù)A:

(3)

(4)

式中：OD1為注射墨汁后2 min(t1)光密度值；OD2為注射墨汁后10 min(t2)光密度值。

1.3.3.6 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK細(xì)胞)活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用Hank′s液清洗3次，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。

效應(yīng)細(xì)胞制備：無菌取出脾臟，置于盛有Hank′s液的平皿中，通過磨碎處理，制備單細(xì)胞懸液，過濾后用Hank′s液離心(1 000 r/min，10 min)處理清洗2次，加入滅菌水裂解紅細(xì)胞，再加入Hank′s液進(jìn)行離心處理，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，用1%(體積分?jǐn)?shù))冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)，保證活細(xì)胞比例≥95%，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。

NK細(xì)胞活性測(cè)定，取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL，加入到U型96孔培養(yǎng)板中，作為反應(yīng)孔，自然釋放孔依次加100 μL靶細(xì)胞和培養(yǎng)液，最大釋放孔依次加100 μL靶細(xì)胞和1%(體積分?jǐn)?shù))NP40，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心(1 500 r/min，5 min)處理，每孔吸取100 μL加入到平底96孔培養(yǎng)板中，加入100 μL乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)基質(zhì)液，室溫反應(yīng)5 min，后加入30 μL 1 mol/L的鹽酸溶液，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定光密度值(OD)。按照公式(5)計(jì)算NK細(xì)胞活性：

(5)

1.3.3.7 腸道菌群測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剖殺后，無菌條件下取盲腸糞便，精確稱取1 g置于100 mL生理鹽水中，37 ℃恒溫?fù)u床振蕩，采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行梯度稀釋，選擇合適梯度接種于不同細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基：EMB瓊脂、BEA瓊脂、BBL瓊脂、LBS瓊脂、TSC瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)后以菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)等鑒定計(jì)數(shù)菌落，分別計(jì)算出每克濕便中腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，檢驗(yàn)方法采用t檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即差異顯著，P<0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離與鑒定結(jié)果

通過鑒定分析，分離出的菌株屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，末端呈圓形，兼性厭氧菌，在pH 4.5～9.5生長(zhǎng)，最適pH 6.5左右，接觸酶和氧化酶陰性，γ溶血。菌體呈長(zhǎng)桿狀或者呈對(duì)狀，兩端鈍圓，不產(chǎn)生芽孢(圖1)；在MRS瓊脂培養(yǎng)基中呈乳白色、半透明狀圓形小菌落、邊緣不規(guī)則。

圖1 菌株的顯微鏡檢圖(×4 000)

菌體API 50CH系統(tǒng)鑒定如表2所示，該菌種屬于同型發(fā)酵乳酸菌，能夠發(fā)酵果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖。通過菌株細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA基因序列、pheS基因序列等綜合分析，該菌株鑒定結(jié)果為嗜酸乳桿菌，命名為嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)(簡(jiǎn)稱L2-003)。

表2 菌株L2-003 API 50CH系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.2 抗逆性與安全性

菌株L2-003耐酸耐膽鹽結(jié)果顯示：在pH 2.0條件下，2 h內(nèi)存活率>20%；在0.3%膽鹽濃度下，2 h內(nèi)存活率>20%，具有較好的耐酸耐膽鹽能力(表3)。

表3 菌株L2-003在pH 2.0及0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中存活率

菌株L2-003在人工胃液中存活率見表4，菌株L2-003在人工胃液中0.5、1、2 h時(shí)的存活率分別為61.18%、54.25%、50.24%，存活率較高，具有較好的耐人工胃液能力，與菌株L2-003具有較好的耐酸特性結(jié)果相符。

表4 菌株L2-003耐受人工胃液存活率

如表5所示,菌株L2-003具有較好的耐酸和耐膽鹽特性，能夠有效通過胃液和膽鹽，并可在人工腸液環(huán)境中較好的存活并增殖。

表5 菌株耐受人工腸液存活率

對(duì)益生菌菌株的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)與分析，對(duì)于益生菌制品的安全性十分必要。菌株篩選過程中，應(yīng)選擇對(duì)常用抗菌藥物敏感的菌株，以減少耐藥性傳遞的安全隱患。選用常見的30種抗生素進(jìn)行耐藥性測(cè)定，參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，結(jié)果見表6，菌株L2-003僅對(duì)復(fù)方新諾明和阿米卡星有抗性，對(duì)慶大霉素中度敏感，對(duì)其余27種抗生素均敏感，說明菌株L2-003對(duì)抗生素耐藥譜較窄，具有較高的安全性。

表6 菌株L2-003對(duì)抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 動(dòng)物體內(nèi)功能評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 小鼠免疫指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)控實(shí)驗(yàn)小鼠的生長(zhǎng)情況及狀態(tài)，結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)期中各實(shí)驗(yàn)組小鼠生長(zhǎng)狀況較好，體征及狀態(tài)無不良變化，未出現(xiàn)明顯疾病及死亡情況，表明菌株L2-003對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠無明顯毒性作用。

小鼠免疫檢測(cè)結(jié)果見表7，造模處理后，模型組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)，說明使用環(huán)磷酰胺進(jìn)行免疫抑制造模成功。與模型組相比，陽性組、中劑量和高劑量菌株L2-003給藥組，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著高于模型組。付彥君等[15]研究報(bào)道乳酸菌可通過促進(jìn)小鼠胸腺和脾臟等免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫功能。本研究結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組與中高劑量L2-003組可通過促進(jìn)小鼠免疫器官的發(fā)育，改善免疫抑制劑造模后小鼠的免疫功能；ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與模型組相比，光密度差值具有顯著性差異(P<0.01)，說明免疫抑制劑環(huán)磷酰胺顯著降低了小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力；陽性組、中劑量和高劑量L2-003菌株組光密度差值顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量組淋巴細(xì)胞增殖能力接近陽性對(duì)照組，說明一定劑量L2-003菌株可顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖；空白對(duì)照組與模型組相比，抗體積數(shù)具有顯著性差異(P<0.05)，說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠的抗體分泌能力；中劑量和高劑量L2-003菌株組抗體水平顯著高于模型組，說明一定劑量L2-003菌株可以有效促進(jìn)小鼠血清凝血素的分泌，增強(qiáng)小鼠機(jī)體體液免疫能力。

表7 不同處理小鼠脾臟和胸腺臟器指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖活性、血清凝血素、碳廓清指數(shù)、NK細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)是通過小鼠尾靜脈注射墨汁，在不同時(shí)間測(cè)定小鼠的血液光密度值，在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，計(jì)算吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力，來反映單核吞噬細(xì)胞對(duì)外來異物的吞噬功能，進(jìn)一步體現(xiàn)機(jī)體的免疫能力[16]。小鼠碳廓清吞噬指數(shù)結(jié)果顯示，與模型組相比，空白對(duì)照組對(duì)墨汁吞噬能力具有顯著性差異(P<0.01)，說明免疫抑制劑顯著降低了小鼠吞噬細(xì)胞的吞噬能力；與模型組相比，L2-003低劑量和中劑量組吞噬指數(shù)增加，但沒有顯著性差異；與模型組相比，L2-003高劑量組顯著差異(P<0.05)，免疫抑制小鼠的細(xì)胞吞噬能力顯著增強(qiáng)。

NK細(xì)胞由骨髓中的淋巴干細(xì)胞分化而來，可直接殺傷病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和異體細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞殺傷后，活細(xì)胞胞漿內(nèi)的LDH可以透過細(xì)胞膜，釋放到胞外，進(jìn)一步反應(yīng)生成紫紅色化合物，可在酶標(biāo)儀490 nm比色測(cè)定，計(jì)算獲得NK細(xì)胞活性，獲得機(jī)體非特異性免疫水平。小鼠NK細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，免疫抑制模型組小鼠NK細(xì)胞活性顯著降低；與模型組相比，陽性對(duì)照組、中劑量組小鼠NK細(xì)胞活性顯著提升(P<0.05)，高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

2.3.2 小鼠腸道菌群檢測(cè)

小鼠盲腸內(nèi)菌群計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果見表8，與空白對(duì)照組相比，通過免疫抑制劑處理，小鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量極顯著降低(P<0.01)，雙歧桿菌數(shù)量顯著降低(P<0.05)，腸桿菌和腸球菌無顯著性變化，產(chǎn)氣莢膜梭菌顯著增高(P<0.05)，說明通過造模處理后，小鼠腸道菌群平衡被破壞；通過不同組給藥處理后，與模型組相比，陽性對(duì)照組和低劑量L2-003活菌處理組對(duì)小鼠腸道乳酸桿菌、腸桿菌、腸球菌無顯著影響。3個(gè)劑量L2-003活菌處理組雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，中劑量組乳酸桿菌顯著增加，差異顯著(P<0.05)；高劑量組乳酸桿菌數(shù)量顯著增加，差異極顯著(P<0.01)；與模型組相比，低劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌、中高劑量組腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，顯著下降(P<0.05)。一定劑量的L2-003可通過促進(jìn)有益菌、抑制有害菌增殖，起到調(diào)節(jié)和平衡腸道菌群的作用。

表8 小鼠腸道菌群測(cè)定結(jié)果 單位：lgCFU/g

綜上，嗜酸乳桿菌L2-003可有效改善免疫抑制小鼠腸道菌群，增強(qiáng)免疫器官指數(shù)及免疫細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，提高免疫細(xì)胞活性，提高機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫水平，在中高劑量體現(xiàn)出更高的免疫增強(qiáng)活性。說明菌株L2-003可順利通過胃腸消化道進(jìn)入機(jī)體并發(fā)揮益生作用，與生理生化和耐受特性結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

研究篩選食品可用益生菌菌株特性及其體內(nèi)功能作用及其機(jī)理，對(duì)于菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及進(jìn)入體內(nèi)后的安全性與功能性具有重要的意義。乳酸菌能否通過胃腸道低pH值、高膽鹽濃度的環(huán)境存活，并可通過胃腸道的消化液消化而在腸道內(nèi)黏附定植，對(duì)于其在腸道內(nèi)的功能發(fā)揮至關(guān)重要。乳酸桿菌具有良好的抗生素敏感性，對(duì)酸和膽鹽環(huán)境具有良好的耐受性，經(jīng)口飼喂后無中毒情況發(fā)生，口服乳酸桿菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，表明供試菌株具有良好的安全性和益生特性，可作為生產(chǎn)用菌株應(yīng)用[17-18]。本研究從健康長(zhǎng)壽老人糞便中分離獲得一株嗜酸乳桿菌PBIL2-003(LactobacillusacidophilusPBIL2-003)。研究結(jié)果證實(shí)，該菌株具有較好的耐酸、耐膽鹽特性；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，L2-003僅對(duì)復(fù)方新諾明和阿米卡星有抗性，對(duì)慶大霉素中度敏感，對(duì)其余27種抗生素均敏感，說明L2-003對(duì)抗生素耐藥譜較窄。以上結(jié)果顯示，L2-003具有較好的抗逆性及安全性，可順利通過胃腸道消化液并發(fā)揮益生作用，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

腸道菌群是維持腸道系統(tǒng)功能的重要物質(zhì)，腸黏膜表面形成的腸道黏膜屏障和免疫屏障是保障腸道菌群維持動(dòng)態(tài)平衡的重要環(huán)節(jié)，免疫系統(tǒng)可以維持宿主與高度多樣性并不斷發(fā)展的菌群之間的共生關(guān)系，誘導(dǎo)對(duì)病原體的保護(hù)性應(yīng)答。研究顯示，益生菌可以通過自身增殖過程，產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)機(jī)體免疫功能，研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以通過促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，激活免疫細(xì)胞活性，提高機(jī)體免疫分子分泌等作用，提高機(jī)體免疫力[19-20]。本研究結(jié)果顯示，篩選出的嗜酸乳桿菌L2-003具有促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)、抑制有害菌增殖的作用；體內(nèi)免疫功能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，L2-003可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，促進(jìn)機(jī)體抗體產(chǎn)生；顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性和NK細(xì)胞殺傷活性，廣泛參與機(jī)體特異性免疫和非特異性免疫反應(yīng)，顯著提升免疫抑制造模小鼠的機(jī)體免疫力水平，具有較好的促進(jìn)機(jī)體免疫功能。綜上所述，嗜酸乳桿菌L2-003具有良好的抗逆性與安全性，具有調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫提升作用，可作為功能性益生菌菌株應(yīng)用于健康產(chǎn)品開發(fā)中。

大量研究報(bào)道顯示，人體腸道菌群因遺傳、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、地理環(huán)境、年齡、性別及不同的健康狀況等因素的差異，而具有顯著性差異。長(zhǎng)壽人群腸道菌群具有高多樣性的典型特征；維持高多樣性且均衡的腸道菌群對(duì)于老齡化過程中的健康可能起積極作用；健康長(zhǎng)壽老人作為功能性益生菌菌種資源的特殊來源，已引起廣泛關(guān)注[21]。作為一株具有良好產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的益生菌菌種資源，不僅需要其來源安全，同時(shí)還需要其具有良好的特性、安全性、功能性。尤其是作為可食用的益生菌菌株，其進(jìn)入機(jī)體后與機(jī)體的腸道菌群以及代謝、免疫等重要的生理活動(dòng)間的相互作用及影響，及其相互作用靶點(diǎn)和機(jī)理研究，均需要更深入的研究與探討，以便為行業(yè)提供性能優(yōu)良、食用安全的本土菌種資源，并為其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供嚴(yán)謹(jǐn)充分的參考依據(jù)。