碧螺春老葉多酚對桃果實保鮮效果研究

張雨晴，周靚，施文衛(wèi)，朱辰暉，袁家偉，吳曉芹*

1(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 蘇州，215500)2(SGS通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司，上海，200233)

桃(PrunuspersicaL.Batsch)屬于薔薇科，品種繁多，在我國多分布于江蘇、福建、浙江等省。由于桃果實汁多味美，營養(yǎng)價值高，深受廣大消費者喜愛。但桃果實一般成熟于高溫多雨的夏季，采后呼吸作用旺盛，極不耐貯，一般采后2～3 d就可腐爛變質(zhì)[1]。近年來，國內(nèi)外已有對水蜜桃果實采后貯藏保鮮技術(shù)的大量研究，包括物理性(如低溫保鮮、熱處理保鮮、輻射保鮮和減壓保鮮)、化學(xué)性[如1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)、植物生長調(diào)節(jié)劑]及生物保鮮方法等(如微生物拮抗劑、天然提取物)[2]。但是以上方法或因潛在食品安全風(fēng)險，或在實際應(yīng)用推廣方面成本較高、技術(shù)不完善等原因，都存在一定局限性。因此，探索可行、高效、低成本的采后處理方法，延長桃果實貯藏期，具有重要意義。

蘇州碧螺春茶是我國的傳統(tǒng)十大名茶之一，因其獨特的芳香及悠久的歷史享譽(yù)國內(nèi)外，湯色嫩綠，香氣淡雅，滋味鮮醇，被譽(yù)為“茶中仙子”，具有較高經(jīng)濟(jì)價值[3]。碧螺春茶一般于清明前開采，且開采期較短，只采其嫩芽制作，老葉因摻有茶碎末與雜質(zhì)，且影響口感往往被廢棄。而近幾年，茶樹老葉中豐富的多酚物質(zhì)受到廣泛關(guān)注[4-6]，其抗氧化、防輻射、抗炎抑菌等多種生物學(xué)功能顯著，且安全無毒，在食品工業(yè)、日用品、醫(yī)藥中有諸多應(yīng)用。

茶多酚穩(wěn)定性較差，容易氧化，采用復(fù)合保鮮技術(shù)可提高保鮮效果，延長果蔬貨架期，如茶多酚與溶菌酶的復(fù)合保鮮[7-8]。溶菌酶是一種天然蛋白質(zhì)，且安全無毒，能夠水解細(xì)菌中的多糖使細(xì)胞壁破裂，從而抑制細(xì)菌增長。然而，目前缺乏茶樹老葉茶多酚保鮮效果的研究，也未見茶樹老葉茶多酚與其他保鮮劑復(fù)合處理的報道。因此，本研究旨在探討碧螺春老葉多酚在果蔬保鮮中的效果，并研究茶多酚與溶菌酶的復(fù)合保鮮是否存在協(xié)同作用，通過本研究的開展，既能充分開發(fā)碧螺春經(jīng)濟(jì)及利用價值，又能開發(fā)一種安全無毒的食品保鮮方法，為桃果實保鮮技術(shù)的提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘白鳳’桃于常熟當(dāng)?shù)刭徺I；乙醇、沒食子酸、福林酚、Na2CO3、蘆丁標(biāo)品、NaNO2、AlCl3、NaOH、KCl、HCl、醋酸鈉、醋酸、FeSO4、水楊酸、愈創(chuàng)木酚、H2O2、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、EDTA、Met、硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)、維生素B2等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Therm高速冷凍離心機(jī)，南京康維達(dá)生物科技有限公司；紫外分光光度計，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 碧螺春老葉多酚提取及施用濃度篩選

1.3.2 桃果實原材料及處理

‘白鳳’桃果實于7月份常熟當(dāng)?shù)夭少?，挑選約8成熟、大小均一、無病蟲害及明顯機(jī)械損傷的桃果實運回實驗室，采摘當(dāng)天設(shè)置為D0。分別用1.25 mg/mL老葉多酚溶液(實驗確定的最佳濃度)，1.25 mg/mL茶多酚+0.1%溶菌酶溶液室溫下浸泡10 min，蒸餾水浸泡作為對照， 晾干后貯藏于室溫下(25±1) ℃ 6 d，分別在第2、4、6天取樣(D2、D4、D6)，去皮、切成小塊并研磨，經(jīng)離心處理后用于各項指標(biāo)的測定。所有樣品均設(shè)3個平行實驗。

1.3.3 失重

3種不同處理的桃果實各選擇9個，分別于第0、2、4、6天測定果實質(zhì)量。失重(Δn)計算如公式(1)所示：

Δn/g=貯藏前果重-貯藏后果重

(1)

1.3.4 多酚的提取測定

稱取2 g新鮮桃果實樣品進(jìn)行研磨，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液提取多酚，10 000×g離心10 min取上清備用。配制0.1 mg/mL的沒食子酸，分別取50、100、200、300、400、500 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時，取200 μL多酚提取液于試管中，每只試管加入2 mL體積分?jǐn)?shù)10%福林酚靜置5 min，然后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的Na2CO3，75 ℃水浴10 min后冷卻。于725 nm處測定吸光值，同體積的提取液作空白，每個樣品做3組平行。

1.3.5 黃酮的測定

配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，分別吸取100、200、400、600、800 μL于每支試管，用于標(biāo)曲測定。測定每組樣品時，吸取2 mL多酚提取液于新試管中，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% AlCl3溶液，搖勻并靜置6 min，然后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% NaOH溶液靜置15 min，每支試管定容至 10 mL。于510 nm處測定吸光值，同體積的提取液作為空白。

1.3.6 花青素的測定

2支試管各取1 mL多酚提取液，分別加入 3 mL KCl緩沖液(0.025 mol/L pH 1.0)與3 mL 醋酸鈉緩沖液(0.4 mol/L pH 4.5)，分別于520、700 nm處測定吸光值?；ㄇ嗨睾坑嬎闳绻?2)所示：

(2)

式中：Mw為花青素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量(C15H11O6449.2 g/mol)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為消光系數(shù)(26 900)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 羥自由基清除率的測定

于每支試管中依次加入3 mL蒸餾水，100 μL FeSO4溶液(0.02 mol/L), 45 μL雙氧水(0.15%)生成羥自由基，然后加入0.5 mL多酚提取液并混勻，最后加入1 mL水楊酸(8 mmol/L)顯色。反應(yīng)30 min后于510 nm處測吸光值，用同體積提取液代替多酚作為對照，羥自由基清除率計算如公式(3)所示：

(3)

1.3.8 DPPH自由基清除率的測定

取0.1 mL多酚提取液于試管中，加入2.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液搖勻，黑暗中孵育30 min，于517 nm處測吸光度。取同體積提取液代替多酚提取物作對照，DPPH自由基清除率計算如公式(4)所示：

(4)

1.3.9 過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定

稱取2 g新鮮桃果實樣品于冰上進(jìn)行研磨，加入6 ml PBS(50 mmol/L pH 7.8)提取酶，4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清酶液并保存于4 ℃冰箱備用。

取0.4 mL酶液，加入2 mL醋酸緩沖液(50 mmol/L pH 5.4)和1 mL愈創(chuàng)木酚(0.25%,體積分?jǐn)?shù))，然后加入0.05 mL H2O2(3%,體積分?jǐn)?shù))啟動反應(yīng)。立即置于紫外分光光度計中于460 nm處測定吸光值，每30 s記錄1次數(shù)值，反應(yīng)共5 min，每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活單位。

1.3.10 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定

取0.03 mL酶提取液，加入3 mL的反應(yīng)體系中(50 mmol/L pH 7.8 PBS、0.1 mmol/L EDTA、13 mmol/L Met、75 μmol/L NBT、2 μmol/L核黃素)。另取3個試管，加入20 μL的超純水代替酶提取液，作為對照組。將測定組與對照組放在4 000 lx強(qiáng)度的光照下反應(yīng)30 min，用等體積的超純水代替酶液作為空白組放在暗室中反應(yīng)作為空白組。反應(yīng)完成后在560 nm處測定吸光值。SOD活力計算如公式(5)所示：

(5)

式中：A0為對照組的吸光度；A為測定組的吸光度；V為樣品的總體積，mL；Vs為測定所用酶液體積，mL；t為反應(yīng)時間，h；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.11 過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測定

取2.6 mL PBS(50 mmol/L pH 7.8)，加入0.4 mL酶液，搖勻，然后加入50 μL H2O2(3%)作啟動反應(yīng)，于240 nm處測吸光值，每30 s記錄1次數(shù)值，觀察吸光值變化，反應(yīng)共5 min。每組樣品做3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 碧螺春老葉多酚施用濃度篩選

果蔬細(xì)胞中，線粒體是產(chǎn)生ATP的主要場所，通過有氧呼吸將氧氣轉(zhuǎn)化為水最終產(chǎn)生ATP，以維持機(jī)體基本的生命活動。然而，在電子傳遞過程中，在線粒體復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ處會由于電子泄露導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。羥自由基是ROS的一員，若在果蔬細(xì)胞內(nèi)累積過多，會對植物組織不斷侵襲，造成果蔬的衰老。而多酚具有羥自由基清除能力，高清除能力利于果蔬的后期貯存，延緩衰老。因此，本實驗以碧螺春老葉多酚對羥自由基的清除能力為指標(biāo)，測定不同多酚濃度下羥自由基清除能力的變化，確定最佳的施用濃度。

如圖1所示，碧螺春老葉多酚顯示出較強(qiáng)的羥自由基清除能力，且隨著多酚濃度的升高，清除能力迅速提高，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時，羥自由基清除率達(dá)到92.95%。此后多酚濃度再提高，羥自由基清除能力基本趨于平緩。因此，本實驗確定用于桃果實保鮮的老葉多酚的最佳施用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL。

圖1 老葉多酚最佳施用濃度的確定

2.2 桃果實的失重

果蔬皆為活的有機(jī)體，在采后貯藏階段，蒸騰作用、呼吸作用以及其他代謝活動仍然會繼續(xù)進(jìn)行，這些生理活動嚴(yán)重影響著果蔬表觀和質(zhì)量。其中，果蔬蒸騰作用的直接表現(xiàn)為質(zhì)量的下降、果實軟化等。本研究中，桃果實采后貯藏期間的圖片如圖2所示，在貯藏期內(nèi)，桃果實色澤進(jìn)一步轉(zhuǎn)紅。由于貯藏期只有6 d，且各組桃果實轉(zhuǎn)紅明顯，因此，僅從外觀不能很明顯的看出不同處理組之間的區(qū)別，因此要結(jié)合其他生理、生化指標(biāo)綜合討論采后處理對桃果實品質(zhì)的影響。桃果實在貯藏過程中的失重變化如圖3所示，對照組桃果實質(zhì)量下降最為迅速，茶多酚處理組次之，茶多酚和溶菌酶處理組質(zhì)量下降最慢。說明茶多酚可很好地維持桃果實在貯藏期間重量變化，減少水分的散失，茶多酚和溶菌酶結(jié)合處理對于維持桃果實的重量表現(xiàn)出協(xié)同作用，有效延緩桃果實的失重。

圖2 桃果實采后貯藏期間圖片

2.3 SOD活性的變化

桃屬于呼吸躍變型果實，在采后仍經(jīng)歷著新陳代謝活動，呼吸作用會引起細(xì)胞壁降解、果實軟化、單糖含量增加、揮發(fā)性物質(zhì)的累積等，直接影響著果實的商品特性。果蔬采后隨著呼吸作用的進(jìn)行，線粒體在氧化磷酸化產(chǎn)生能量過程中，內(nèi)部的呼吸鏈會發(fā)生電子泄露，形成ROS。ROS會直接攻擊細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，引起機(jī)體代謝的紊亂，影響細(xì)胞的代謝和細(xì)胞凋亡。植物細(xì)胞內(nèi)部還存在著抗氧化體系，包括抗氧化酶類和非抗氧化酶類，抵制ROS的侵害。其中，SOD、CAT和POD等是植物中常見的抗氧化酶。呼吸作用產(chǎn)生的超氧陰離子自由基在細(xì)胞內(nèi)部不穩(wěn)定，會在SOD的作用下轉(zhuǎn)化為H2O2，而H2O2會進(jìn)一步在CAT和POD等酶的作用下轉(zhuǎn)化為H2O，降低ROS對細(xì)胞的侵害。

本研究中，桃果實的SOD活性在貯藏過程中呈現(xiàn)總體持續(xù)上升的趨勢(如圖3所示)，說明在室溫貯存期間桃果實面臨較強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成果實內(nèi)部ROS累積。處理組的桃果實SOD活性明顯高于對照組，說明多酚提取液刺激了SOD酶活，提高了桃果實的抗氧化活性，及時清除處理組中桃果實產(chǎn)生的ROS，延緩了果實的成熟。而溶菌酶的添加對于果實SOD酶活的提高沒有顯著的作用。

2.4 CAT活性的變化

在桃果實貯藏期間，CAT酶活呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢,如圖3所示，而多酚提取液很好地維持了其較高的酶活，提高了果實的抗氧化能力。值得注意的是，不同于對SOD酶活的影響，溶菌酶與多酚的復(fù)合處理在提升CAT酶活方面顯著優(yōu)于對照組、茶多酚組，表現(xiàn)出較高的協(xié)同效果，有效清除桃果細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的H2O2，延緩果實的衰老。

2.5 POD活性的變化

如圖3所示，在貯藏期間，對照組的POD活性迅速升高，在第2天出現(xiàn)峰值，隨后在貯藏期間下降，所有組中的POD活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中，茶多酚和溶菌酶復(fù)合處理對桃果實POD活提升效果最佳，提高桃果實過氧化物酶的活性，可增強(qiáng)清除自由基的能力，延緩果實衰老。類似的研究結(jié)果在西藍(lán)花保鮮中也有報道， 李長亮等[11]采用1-MCP和溶菌酶結(jié)合處理研究新鮮西藍(lán)花保鮮，發(fā)現(xiàn)1-MCP+溶菌酶有效提高西藍(lán)花過氧化物酶的活性、感官品質(zhì)和總酚含量，延長了貯藏期。

a-失重；b-SOD酶活；c-CAT酶活；d-POD酶活

2.6 總酚、花青素和黃酮含量的變化

酚類物質(zhì)是由含有1個或多個羥基的苯環(huán)組成的高分子化合物，其廣泛存在于植物體內(nèi)，是植物體內(nèi)重要的次生代謝物。果蔬體內(nèi)的酚類物質(zhì)決定著果蔬的色澤、口感、營養(yǎng)和芳香等[12]，具有多種生物活性，可行使不同的功能，包括植物抗毒素[13]、吸引授粉、積累色素、抗氧化、防紫外線等[14]。類黃酮物質(zhì)因其極強(qiáng)的抗氧化潛力，可作為重要的抗氧化劑，還扮演著氫供體、金屬螯合和單線態(tài)氧猝滅劑等角色[15]。類黃酮物質(zhì)包括黃酮類、花色素、黃烷酮類等等，其含量的高低直接影響著果蔬的著色和抗氧化性能。

本實驗中，桃果實貯藏期間多酚和黃酮含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(圖4)，該結(jié)果與前人在李子[16]、桃子[17]研究中一致，黃酮物質(zhì)的變化與多酚趨勢類似，這種規(guī)律在之前的研究中也有報道[17-18]。2個處理組對多酚和黃酮含量均未表現(xiàn)出明顯的影響，與對照組含量區(qū)別不大。然而，處理組明顯提高了桃果實花青素的含量，且茶多酚處理組中花青素含量最高，利于桃果實后期果色的穩(wěn)定。

a-多酚含量；b-黃酮含量；c-花青素含量；d-DPPH自由基清除率；e-羥自由基清除率

2.7 DPPH自由基、羥自由基清除率的變化

酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有苯環(huán)和取代羥基，可以為其他物質(zhì)提供氫原子或者電子，還原金屬離子。酚類物質(zhì)自身可以釋放出親和性強(qiáng)的氫質(zhì)子，可以將高活性的自由基失活或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物。測定多酚清除能力的方法有很多，大體可以分為2種：第一種是測定多酚物質(zhì)清除植物體內(nèi)羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫等自由基的能力，本研究中測定羥自由基清除能力的原理是利用FeSO4-H2O2的反應(yīng)，體系中產(chǎn)生的羥自由基與染色劑水楊酸反應(yīng)產(chǎn)生顏色，加入酚類粗提液會去除體系中的自由基，使得紫色會變淺。另一種方法是清除體外人工合成自由基的活性，應(yīng)用最多的是DPPH自由基。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，易溶于醇并且顯紫色，但是當(dāng)加入酚類提取液時，DPPH自由基會被酚類清除使紫色變淺，反應(yīng)靈敏，成為測定酚類清除活性的有效工具。

本實驗中，在桃果實貯藏期間，DPPH自由基和羥自由基清除率均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，分別在第0天和第4天表現(xiàn)出峰值，2種自由基清除率的總體變化趨勢與總酚含量變化相似，因此推測清除率的變化與酚類物質(zhì)含量有關(guān)。此外，處理組的DPPH自由基和羥自由基清除率均明顯高于對照組，說明老葉多酚的處理明顯提高了桃果實自由基清除能力，維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。值得注意的是，DPPH自由基清除能力跟桃果實的總酚含量變化趨勢一致，據(jù)此推測桃果實的DPPH自由基清除能力受總酚含量的影響。而羥自由基清除能力變化趨勢與總酚含量差別較大，碧螺春老葉多酚與溶菌酶的結(jié)合處理呈現(xiàn)出最強(qiáng)的羥自由基清除活性，但是該組中桃果實的總酚含量卻沒有表現(xiàn)出最高，由此推測羥自由基清除能力可能與某幾種單酚物質(zhì)有關(guān)，與總酚含量的關(guān)聯(lián)不像DPPH自由基清除率那樣密切，類似的結(jié)果在之前的研究中也曾得出[17]。

3 結(jié)論

本研究測定了碧螺春老葉茶多酚對桃果實采后貯藏期間成熟衰老的影響，實驗前期測定不同濃度多酚提取液對羥自由基的清除效果，確定最佳適用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL。實驗結(jié)果表明，碧螺春老葉多酚處理能激活桃果實SOD、CAT、POD的活性，提高總酚、花青素的含量，增強(qiáng)多酚對DPPH自由基和羥自由基的清除能力。DPPH自由基的清除能力可能與桃果實總酚含量有關(guān)，而羥自由基的清除能力可能與某種或某幾種單酚物質(zhì)有關(guān)，與總酚含量關(guān)聯(lián)不大。溶菌酶的添加對于抑制桃果實失重、提高CAT、POD活性以及羥自由基清除能力方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。