施磷對(duì)苜蓿葉片生理參數(shù)及抗氧化能力的影響

趙建濤，楊開鑫，王旭哲，馬春暉，張前兵

施磷對(duì)苜蓿葉片生理參數(shù)及抗氧化能力的影響

趙建濤，楊開鑫，王旭哲，馬春暉，張前兵

石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000

【目的】探究連續(xù)3年施用磷肥后對(duì)紫花苜蓿葉片養(yǎng)分吸收量、光合色素含量、氣孔開度及抗氧化系統(tǒng)的影響，為紫花苜蓿高效生產(chǎn)提供科學(xué)施肥方法?！痉椒ā?019—2021年，以‘WL366HQ’紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，在石河子大學(xué)牧草試驗(yàn)站連續(xù)開展為期3年的田間試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置磷肥添加量分別為0（對(duì)照，CK）、50 kg·hm-2（低磷，LP）、100 kg·hm-2（中磷，MP）和150 kg·hm-2（高磷，HP），共4個(gè)磷肥處理。于苜蓿初花期進(jìn)行取樣，測(cè)定干草產(chǎn)量、葉片氮磷含量、色素含量、氣孔開度、抗氧化酶活性以及氧化物質(zhì)等指標(biāo)?！窘Y(jié)果】連續(xù)施加磷肥3年后，葉片的氮磷含量、光合色素含量及氣孔開度顯著增加（＜0.05），其中葉片氮磷含量在中磷處理下最高，分別為54.74和2.99 g·kg-1；葉綠素a和葉綠素b的含量均在中磷處理下最高，類胡蘿卜素含量在低磷或中磷處理下最高，且均在CK最低；氣孔開度在中磷處理下達(dá)到最大，且顯著高于CK（＜0.05）。因此，磷肥對(duì)苜蓿葉片的形態(tài)和生理特性有不同的影響，且中磷處理顯著影響苜蓿葉片的光合生理特性（＜0.05）。合理添加磷肥可以提高苜蓿葉片抗氧化酶的活性并降低氧化物質(zhì)的含量，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性均在中磷處理達(dá)到最高，分別為162.55、406.40和147.13 U·g-1，且顯著高于CK（＜0.05）；丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）和脯氨酸（Pro）含量均在中磷處理下最低，分別為2.38和1.04 μmol·g-1以及56.85 μg·g-1。根據(jù)Pearson相關(guān)性分析可知，苜蓿葉片全氮和全磷含量與葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、氣孔開度、SOD和POD活性顯著正相關(guān)（＜0.05），與MDA和H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。綜合評(píng)價(jià)表明，施磷處理的主成分得分排序?yàn)椋褐辛祝靖吡祝镜土祝緦?duì)照?！窘Y(jié)論】合理施加磷肥增加苜蓿葉片的營養(yǎng)特性及光合生理特性，從而避免其他環(huán)境因子帶來的脅迫作用，增強(qiáng)苜蓿的適應(yīng)能力，使苜蓿更好地適應(yīng)外界環(huán)境變化。綜合考慮紫花苜蓿的葉片形態(tài)、光合生理特性及抗氧化酶和氧化物質(zhì)等因素，本試驗(yàn)施磷量為100 kg·hm-2較為適宜。

紫花苜蓿；施磷；葉片表型；葉片生理；干草產(chǎn)量

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L.）作為優(yōu)質(zhì)的豆科飼草，以“牧草之王”著稱[1]。磷是植物生長(zhǎng)所需的重要元素之一[2]，而植物從土壤中獲取有效磷含量極低，僅占土壤全磷的2%—3%[3-4]。土壤中添加磷肥促進(jìn)植物獲取更多的有效磷，從而達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)等目的。【前人研究進(jìn)展】葉綠素在光能的吸收、轉(zhuǎn)換及傳遞過程中起關(guān)鍵作用，決定光合過程中的電子傳遞速率[5]。植物葉片的光合作用對(duì)磷肥濃度十分敏感，研究表明，植株葉片葉綠素含量損失及葉綠體損傷與高濃度磷肥下葉片光合能力下降有關(guān)[6]，但是磷缺乏導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育延緩、葉面積變小及根系碳水化合物合成受阻，從而降低產(chǎn)量[7-8]。因此，磷在植物葉綠體中的能量轉(zhuǎn)化和代謝過程中起著重要作用，并促進(jìn)其光合產(chǎn)物的形成[9]。研究發(fā)現(xiàn)，適量增施磷肥提高植物葉片的氮磷含量和葉綠素含量，進(jìn)而促進(jìn)其光合作用[10]。磷素通過蒸騰途徑進(jìn)入植物機(jī)體中的葉片細(xì)胞，進(jìn)而提高葉片光合及碳代謝的能力，然而，施磷量過高其光合速率則會(huì)受到抑制[2]。也有研究表明，葉片凈光合作用與施肥量之間存在一定的線性關(guān)系，一旦施磷量超過閾值后，其光合速率大幅度降低[11]。光合作用在植物生長(zhǎng)過程中至關(guān)重要，研究發(fā)現(xiàn)，一些非環(huán)境脅迫導(dǎo)致植株的光合過程受到紊亂、阻礙葉綠素的合成過程并降解葉片中光合色素含量[12]。氣孔是植物與外界環(huán)境進(jìn)行氣體和水分交換的介質(zhì)，其數(shù)量、大小和密度的變化直接影響植株的光合速率和蒸騰作用[13]。氣孔可以調(diào)控CO2進(jìn)入葉片的速率，提高光合作用效率和蒸騰速率，從而達(dá)到養(yǎng)分供應(yīng)目的[14-15]。磷肥過高則會(huì)造成葉綠體超微結(jié)構(gòu)變形，光合作用電子傳遞途徑受限，致使植物的光合作用受到抑制[16]。自由基清除機(jī)制是植物進(jìn)行自我保護(hù)的第二道防線，超氧化物歧化酶（SOD）的發(fā)現(xiàn)為自由基清除機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)[17]。植物體內(nèi)的SOD、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等可以清除脅迫環(huán)境產(chǎn)生的活性氧和自由基。也有研究表明，植物在逆境下或衰老時(shí)，CAT與POD產(chǎn)生協(xié)同作用來清除植株體內(nèi)超氧化物陰離子及過氧化氫（H2O2）[18]。從植物在低磷逆境下的反應(yīng)機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，施磷量會(huì)引起植物體內(nèi)SOD活性發(fā)生變化，且SOD活性偏高有利于植物長(zhǎng)期處于低磷環(huán)境中[19]。也有研究表明，低磷脅迫下SOD活性呈現(xiàn)短期迅速上升趨勢(shì)，使活性氧（ROS）及超氧陰離子達(dá)到一種平衡狀態(tài)，來減輕其對(duì)植株的傷害，隨著施磷量的增加，SOD、POD及CAT活性均有所降低[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于施磷對(duì)不同作物的生產(chǎn)性能及光合特性影響等問題已做了大量研究，但仍未從葉片的氣孔開度及抗氧化系統(tǒng)等問題來揭示低磷或高磷是否導(dǎo)致苜蓿處于脅迫環(huán)境?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過測(cè)定不同施肥條件下苜蓿葉片全氮全磷含量、光合色素含量、葉片的氣孔個(gè)數(shù)和開度、抗氧化酶活性及氧化物質(zhì)含量，以期明確連續(xù)多年不同施肥水平對(duì)紫花苜蓿葉片的光合生理及抗氧化系統(tǒng)的影響機(jī)制，進(jìn)而闡明低或高磷是否對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)造成脅迫作用，為施肥對(duì)紫花苜蓿生理參數(shù)的影響機(jī)制研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019—2021年在石河子大學(xué)節(jié)水灌溉試驗(yàn)站（44°20′ N，88°30′ E）進(jìn)行，屬于溫帶大陸性氣候，常年干燥少雨。年平均氣溫為7℃，無霜期為168—171 d，年均日照時(shí)間為2 770 h，年降水量為190—260 mm，年蒸發(fā)量為1 000—1 500 mm。土壤有機(jī)質(zhì)含量為39.5 g·kg-1，全氮含量為1.18 g·kg-1，堿解氮含量為145.47 mg·kg-1，全磷含量為0.53 g·kg-1速效磷含量為19.3 mg·kg-1，速效鉀含量為119.8 mg·kg-1，容重為1.54 g·cm-3，pH為7.59。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

建植年前通過測(cè)定土壤理化性質(zhì)，認(rèn)為試驗(yàn)地肥力均勻性較好。本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)排列，供試材料為紫花苜蓿（WL366HQ），設(shè)置4個(gè)磷肥處理，分別為0（對(duì)照，CK）、50 kg·hm-2（低磷，LP）、100 kg·hm-2（中磷，MP）和150 kg·hm-2（高磷，HP），供試化肥為磷酸一銨（含P2O552%），每個(gè)處理3次重復(fù)。小區(qū)面積為24 m2（4 m×6 m)，20 cm的播種行距，1.5—2.0 cm的播種深度，人工進(jìn)行條播，播種量為18 kg·hm-2，灌溉方式為滴灌，滴灌帶埋于地面10—15 cm處，間距60 cm，所用滴灌帶為內(nèi)鑲式滴灌帶，滴頭間距為20 cm。試驗(yàn)連續(xù)3年進(jìn)行等量定位施肥，肥料分別于苜蓿返青后、第1茬、第2茬和第3茬刈割后的3—5 d內(nèi)隨水施肥，每年共施肥4次。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

連續(xù)3年施肥后，于2021年苜蓿初花期（開花10%）取植株樣品進(jìn)行分析，苜蓿全年刈割4茬，留茬高度約為5 cm。在苜蓿初花期測(cè)定苜蓿葉片光合色素含量、氣孔開度、抗氧化酶活性、氧化物質(zhì)含量及干物質(zhì)產(chǎn)量等。

1.3.2 葉片營養(yǎng)的測(cè)定 將顏色正常且無破損的新鮮葉片采摘帶回實(shí)驗(yàn)室，樣品先在105℃殺青30 min，再置于65℃干燥箱中烘干48 h成風(fēng)干樣品。將烘干的葉片樣品研磨成細(xì)粉，用98%硫酸和30%過氧化氫進(jìn)行消化。葉片全氮和全磷的含量分別用凱氏定氮法和鉬銻抗比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 葉片氣孔開度的測(cè)定 采用指甲油印跡法來測(cè)定葉片的氣孔開度[21]。選取顏色正常、高度相同且光照相似的上位葉片，先用75%的酒精將葉片表面灰塵擦凈，然后將透明指甲油均勻地涂抹在葉片背面。待自然晾干后，將葉片背面表皮緊貼于透明膠帶上，并用手指抹平至膠帶與葉片間充分接觸且無氣泡。為防止葉片破損，撕取膠帶時(shí)一定要緩慢，最后輕貼至干凈的載玻片上，從而制成臨時(shí)載玻片。用ML-800光學(xué)顯微鏡（Olympus，MEIJI，Japan）對(duì)氣孔進(jìn)行拍照，每個(gè)載玻片在100倍顯微鏡下選取3個(gè)清晰且完整的視野，測(cè)量氣孔個(gè)數(shù)、長(zhǎng)度（縱徑，即啞鈴形細(xì)胞的最長(zhǎng)值）與寬度（橫徑，即啞鈴形細(xì)胞垂直處的最寬值），根據(jù)下列公式來計(jì)算其氣孔開度。其中，a是氣孔的長(zhǎng)度，b是氣孔的寬度。

1.3.4 光合色素含量 采用乙醇浸提法來測(cè)定苜蓿葉片的光合色素含量。隨機(jī)選取顏色正常、高度相同且光照相似的上位葉片，利用75%的乙醇將葉片表面灰塵擦凈，并剪去葉片中脈部位。稱取新鮮葉片0.2 g置于研缽中，加入少量的石英砂和碳酸鈣粉末，并加95%乙醇3 mL，研磨至勻漿。把中性濾紙疊好放入漏斗中，置于25 mL的棕色容量瓶上，并用乙醇將其濕潤緊貼于漏斗壁。利用玻璃棒將勻漿液引流至漏斗中，吸取少量的乙醇來清洗殘?jiān)鼣?shù)次，一起倒入漏斗內(nèi)，并用乙醇溶液將濾紙上的色素洗于容量瓶中，直至殘?jiān)袩o綠色為止。最后用乙醇定容至25 mL的棕色容量瓶中并搖勻。將色素提取液倒入1 cm的玻璃比色杯內(nèi)比色。以95%的乙醇為空白，利用分光光度計(jì)在470、663和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，分別記為A470、A663和A645。葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素及總?cè)~綠素含量，分別記為Ca、Cb、Car和Ct，根據(jù)以下公式計(jì)算光合色素含量：

Ca = (13.95×A665-6.88×A649)×提取液總量×稀釋倍數(shù)/葉片鮮重；

Cb = (24.96×A649-7.32×A665)×提取液總量×稀釋倍數(shù)/葉片鮮重；

Car = [(1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb) /245]×提取液總量×稀釋倍數(shù)/葉片鮮重；

Ct = Ca+Cb。

在手術(shù)治療的同時(shí)，按照常規(guī)護(hù)理方法進(jìn)行干預(yù)，包括觀察患者的病情變化，監(jiān)測(cè)生命體征，并詳細(xì)記錄，告知患者并介紹一些注意事項(xiàng)，幫助患者進(jìn)行下床活動(dòng)，指導(dǎo)患者合理用藥等措施。

1.3.5 抗氧化酶活性 隨機(jī)選取顏色正常、高度相同且光照相似的上位葉片，采摘后立即放入低溫冰箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩Ｓ帽本┧魅R寶科技有限公司提供的“SOD試劑盒”和“CAT試劑盒”來測(cè)定葉片中SOD和CAT的活性；用南京建成有限公司提供的“POD試劑盒”來測(cè)定POD的活性，具體步驟嚴(yán)格根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。

1.3.6 氧化物質(zhì)含量 丙二醛（MDA）的含量用硫代巴比妥酸法來測(cè)定；用北京索萊寶科技有限公司所提供的“H2O2試劑盒”來測(cè)定葉片中H2O2的含量；用南京建成有限公司提供的“脯氨酸（Pro）試劑盒”測(cè)定葉片中Pro含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)、SPSS 26.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Origin2019進(jìn)行作圖。利用Image Scope軟件處理圖片，并測(cè)量葉片氣孔個(gè)數(shù)、氣孔長(zhǎng)度及氣孔寬度。試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同施磷水平下苜蓿茬次葉片氮磷含量動(dòng)態(tài)

連續(xù)3年施加磷肥后，苜蓿葉片全氮及全磷含量均隨施磷量增加呈先增后降低的趨勢(shì)（圖1），且施磷量為中磷時(shí)，葉片全氮含量顯著高于CK（＜0.05）；施磷量為中磷時(shí)，苜蓿葉片全磷含量顯著高于CK（＜0.05），且施磷量過高顯著降低葉片全磷含量（＜0.05）。

苜蓿葉片全氮含量隨茬次變化呈先下降后上升再下降的動(dòng)態(tài)變化，第1或3茬最高，第4茬最低，分別為54.83和44.44 g·kg-1；葉片全磷含量隨茬次變化呈先降低后達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，其中第1茬最高，為2.99 g·kg-1，且各茬次間的排序?yàn)榈?茬＞第3茬＞第2、4茬。

柱上不同字母表示處理間差異顯著。下同

2.2 不同施磷水平下苜蓿茬次葉片的光合色素含量動(dòng)態(tài)

相同茬次下，隨著施磷量增加，苜蓿葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，均在中磷水平下達(dá)到最大，且顯著高于CK（＜0.05）（圖2）。施磷增加苜蓿葉片的類胡蘿卜素（Car）和葉綠素的含量，一旦磷肥含量過高，則導(dǎo)致其含量的大幅度降低。苜蓿葉片Car含量在中磷水平下達(dá)到最高，且顯著高于CK（＜0.05）。

苜蓿葉片中葉綠素a和葉綠素b含量均隨著茬次變化呈先上升后下降再上升的動(dòng)態(tài)規(guī)律，而類胡蘿卜素含量呈先上升后降低到相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡。不同茬次下，與CK相比，中磷處理下苜蓿葉片的色素含量均有所增加，中磷處理下葉綠素a的含量在各茬次間分別增加了12.5%、8.9%、19.5%、8.6%，在第3茬時(shí)最大；中磷水平下的葉綠素b含量在各茬次間分別增加了28%、5.7%、21.4%和4.0%，在第1茬時(shí)增加量最大；中磷處理下Car的含量在各茬次間分別增加了23.5%、10.5%、5.6%和17.6%，且第1茬時(shí)增加量最大。

圖2 不同施磷水平下葉片1—4茬光合色素含量動(dòng)態(tài)變化

2.3 不同施磷水平下苜蓿茬次葉片的氣孔開度動(dòng)態(tài)

正常生長(zhǎng)條件下，合理的施磷量在一定程度上增加苜蓿葉片氣孔個(gè)數(shù)及氣孔開度。氣孔個(gè)數(shù)、氣孔長(zhǎng)度以及氣孔寬度均隨著施磷量增加呈先增加后降低趨勢(shì)（圖3）。相同茬次下，適量添加磷肥顯著提高苜蓿葉片的氣孔長(zhǎng)度和氣孔寬度（＜0.05），施磷量過高顯著降低葉片的氣孔寬度與長(zhǎng)度（＜0.05），進(jìn)而導(dǎo)致氣孔開度大幅度降低（表1）。苜蓿葉片的氣孔開度隨施磷量增加呈先上升后降低趨勢(shì)，在中磷水平達(dá)到最大，且顯著高于CK（第3茬除外）（＜0.05）。

表1 不同施磷水平下苜蓿葉片1—4茬氣孔數(shù)、長(zhǎng)度、寬度和開度的動(dòng)態(tài)變化

表中數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著

The data in the table are average ± standard error. Values followed by different lowercase letters in a column indicate significant difference among treatments at 0.05 level

苜蓿葉片的氣孔個(gè)數(shù)隨著茬次的變化呈先降低后上升到相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡，而氣孔開度呈先降低后上升再降低的動(dòng)態(tài)規(guī)律。不同茬次下，苜蓿葉片的氣孔數(shù)在第4茬達(dá)到最大，且各茬次間排序?yàn)榈?茬＞第1茬＞第3茬＞第2茬；氣孔開度在第3茬最大，第4茬最小，且各茬次間排序?yàn)榈?茬＞第1茬＞第2茬＞第4茬。因此，合理的施磷量通過提高苜蓿葉片的氣孔開度來促進(jìn)其光合作用。

2.4 不同施磷水平下苜蓿茬次葉片的抗氧化酶活性動(dòng)態(tài)

連續(xù)3年施加磷肥后，苜蓿葉片SOD、POD和CAT活性均隨施磷量增加呈先上升后降低的趨勢(shì)（圖4），均在中磷處理達(dá)到最高，分別為162.55、406.40和147.13 U·g-1，且顯著高于CK（＜0.05）。苜蓿葉片SOD、POD和CAT活性隨茬次的變化呈先上升后下降的動(dòng)態(tài)規(guī)律。不同茬次下，葉片SOD活性在第1茬下最高，且各茬次間排序?yàn)榈?茬＞第3茬＞第2茬＞第4茬；POD活性在第2茬最高，且各茬次間排序?yàn)榈?茬＞第1茬＞第3茬＞第4茬；CAT活性在第2茬最高，且各茬次間排序?yàn)榈?茬＞第4茬＞第3茬＞第1茬。

2.5 不同施磷水平下苜蓿茬次葉片的氧化物質(zhì)和脯氨酸含量動(dòng)態(tài)

H2O2和MDA的含量可以揭示植株氧化損傷程度[22]。相同茬次下，合理施加磷肥降低苜蓿葉片MDA、H2O2及Pro含量（圖5），施磷量過高則會(huì)加劇葉片的氧化程度，產(chǎn)生更多過氧化的產(chǎn)物。苜蓿葉片中MDA、H2O2及Pro含量均隨施磷量增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，其含量在中磷處理下達(dá)到最低，分別為2.38、1.04 μmol·g-1及56.85 μg·g-1，且顯著低于CK（＜0.05）。苜蓿葉片中MDA、H2O2及Pro含量均隨茬次變化呈先上升后降低再上升的動(dòng)態(tài)規(guī)律。苜蓿葉片H2O2、MDA和Pro含量在第1茬或第3茬最低，且各茬次間的排序?yàn)榈?、3茬＜第4茬＜第2茬。

圖A為CK，B為L(zhǎng)P，C為MP，D為HP Figure A shows CK, B shows LP, C shows MP and D shows HP

圖4 不同施磷下苜蓿葉片1—4茬抗氧化酶活性的動(dòng)態(tài)變化

圖5 不同施磷下苜蓿葉片1—4茬氧化物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化

2.6 不同施磷水平下苜蓿茬次的干草產(chǎn)量動(dòng)態(tài)

連續(xù)3年施加磷肥后，苜蓿干草產(chǎn)量隨施磷量增加呈先增加后降低趨勢(shì)（圖6），中磷處理下干草產(chǎn)量達(dá)到最高，CK最低。干草產(chǎn)量隨茬次的變化呈現(xiàn)先降低后增加再降低的動(dòng)態(tài)規(guī)律，其中第1茬最高，第4茬最低，且各茬次間的排序?yàn)榈?茬＞第3茬＞第2茬＞第4茬。

2.7 葉片氮磷含量與生理參數(shù)和抗氧化能力的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步分析3年連續(xù)施磷后苜蓿葉片的生理參數(shù)和抗氧化能力與氮磷含量之間的關(guān)系，對(duì)葉片氮磷含量與光合色素含量、氣孔開度和抗氧化酶活性等指標(biāo)進(jìn)行皮爾遜（Pearson）相關(guān)性分析。結(jié)果表明（圖7），苜蓿葉片氮含量與葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、氣孔開度、SOD活性及POD活性呈顯著正相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.886、0.925、0.500、0.832及0.575，而與MDA和H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為-0.811和-0.760；葉片磷含量與葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和SOD活性呈顯著正相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.798、0.740及0.791，與MDA和H2O2含量呈負(fù)相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.576和-0.633。另外，SOD、POD及CAT活性與MDA及H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。

圖6 不同施磷下苜蓿1—4茬干草產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化

2.8 施磷處理對(duì)苜蓿葉片的生理參數(shù)和干草產(chǎn)量的綜合評(píng)價(jià)

對(duì)苜蓿葉片氮磷含量、生理特性、抗氧化酶活性及干草產(chǎn)量等指標(biāo)采用主成分進(jìn)行分析，將13個(gè)相互關(guān)聯(lián)的單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)變成2個(gè)相互獨(dú)立的綜合性指標(biāo)。本試驗(yàn)中，提取主成分特征值大于1，得到2個(gè)主成分，其主成分的貢獻(xiàn)率分別為60.1%和18.7%，且累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到78.8%（圖8）。綜合得分發(fā)現(xiàn)，中磷得分最高，其次是高磷和低磷處理，對(duì)照組最低。

3 討論

3.1 苜蓿葉片氮磷含量與光合色素和氣孔開度的關(guān)系分析

葉綠素作為反映植物生理活動(dòng)的指標(biāo)之一，是光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。研究表明，葉綠素含量隨施磷量不同而有所差異，且磷的有效性提高植物對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力[23]，進(jìn)而改變其光合性能。通過對(duì)幼苗葉片的研究發(fā)現(xiàn)，蒸騰速率和凈光合作用與葉片磷含量呈正相關(guān)，表明高施磷量可以提高葉片的蒸騰速率[24]。本研究表明，合理的施磷量提高葉片全磷和光合色素含量，這與前人研究結(jié)果一致[9]。作為光合過程中的輔助色素，類胡蘿卜素在光合過程中發(fā)揮重要作用[25]。研究發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素保護(hù)葉綠素分子，防止葉片的細(xì)胞膜脂和膜蛋白遭到破壞，進(jìn)而減緩植株的氧化過程[26]。本研究中，適當(dāng)施加磷肥顯著提高紫花苜蓿葉片類胡蘿卜素含量，然而，施磷量過高或過低均降低葉片的葉綠素，對(duì)植株產(chǎn)生脅迫作用，導(dǎo)致類胡蘿卜素含量大幅度降低。

*表示相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P＜0.05）* mean significant level of correlation (P＜0.05)

圖8 不同施磷水平下各指標(biāo)的主成分分析及綜合得分

氣孔控制著植物與外界環(huán)境的氣體交換，維持植物的碳代謝和水分達(dá)到平衡狀態(tài)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受到外界環(huán)境的脅迫時(shí)，植物可以通過改變氣孔的分布方式來應(yīng)對(duì)環(huán)境的脅迫作用[27]。植物對(duì)磷肥虧缺的早期適應(yīng)主要表現(xiàn)在氣孔運(yùn)動(dòng)上[28]，植物體內(nèi)的水分和氣體與環(huán)境的交換過程離不開氣孔的控制，且影響其葉片光合的能力[29-30]。施肥條件下，氣孔密度和氣孔導(dǎo)度與水分利用效率有密切的正相關(guān)關(guān)系[31]，這表明合理施磷量可以提高植物葉片的氣孔開度，從而增加其氣孔密度來適應(yīng)環(huán)境[32]。本研究中，施磷增加苜蓿葉片的氣孔個(gè)數(shù)和氣孔開度。研究表明，植物的光合速率和蒸騰作用可以通過氣孔開度以及氣孔數(shù)目來控制，在一定情況下其變化可反映植物對(duì)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉片通過降低氣孔個(gè)數(shù)和氣孔開度來減緩磷肥過高而造成的脅迫作用，進(jìn)而提高其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性。Pearson相關(guān)性分析揭示，葉片氮磷含量與葉綠素和類胡蘿卜素含量呈顯著正相關(guān)，推測(cè)可以通過提高葉片氮磷含量來提高其光合能力。因此，長(zhǎng)期合理添加磷肥通過提高苜蓿葉片氮磷含量來增加其光合色素含量和氣孔開度，從而減緩環(huán)境因子對(duì)苜蓿引起的傷害。

3.2 苜蓿葉片氮磷含量與葉片抗氧化酶、氧化物質(zhì)及脯氨酸的關(guān)系分析

光能在脅迫條件下不能被完全利用時(shí)，植株的抗氧化酶體系（SOD、POD和CAT）可以清除體內(nèi)過剩的H2O2和ROS，來減輕非生物因素對(duì)植物細(xì)胞膜造成的傷害，并維持一定的光合速率[34]。研究表明，植物在逆境條件下引起的傷害與體內(nèi)抗氧化酶活性密切相關(guān)，并且植物的正常衰老現(xiàn)象與體內(nèi)SOD的活性緊密相連[35]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施磷影響紫花苜蓿葉片中SOD和POD活性，一旦施磷量過高，抗氧化酶活性明顯受到抑制[36]。MDA和H2O2是膜脂被氧化形成的產(chǎn)物，細(xì)胞膜的損傷程度與植株體內(nèi)MDA的生成量呈正相關(guān)[34]。本研究表明，適量施加磷肥顯著降低苜蓿葉片中MDA和H2O2含量，而施磷量過高導(dǎo)致葉片中MDA、H2O2和Pro含量顯著上升，這可能是因?yàn)榱淄ㄟ^刺激植物體內(nèi)抗氧化酶活性，加快自由基的清除進(jìn)度，減輕對(duì)細(xì)胞膜的損害，進(jìn)而減少脅迫條件對(duì)植株的損害[37]。Pearson相關(guān)性分析揭示，葉片氮磷含量與SOD活性、MDA含量和H2O2含量有較高的相關(guān)性。因此，合理的施磷量通過提高苜蓿葉片氮磷含量，增加抗氧化酶活性并清除體內(nèi)氧化物質(zhì)的含量，從而增強(qiáng)苜蓿對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

3.3 不同施磷水平對(duì)苜蓿干草產(chǎn)量的影響

干草產(chǎn)量是紫花苜蓿生產(chǎn)性能最具有代表性指標(biāo)之一。作為多年生豆科牧草，紫花苜蓿以優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)著名。合適的施磷量通過提高植物葉片葉綠素含量[10]、氣孔長(zhǎng)度及密度[16]，來促進(jìn)其光合作用；加強(qiáng)植株的抗氧化酶活性，并降低氧化物質(zhì)含量[19]，進(jìn)而達(dá)到更高的生物量。本研究表明，苜蓿干草產(chǎn)量隨施磷量的增加呈先增高后降低的趨勢(shì)，中磷處理下達(dá)到最高，而高磷處理有所下降，這與高施磷量對(duì)苜蓿造成了脅迫作用有關(guān)，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低。主成分分析使大量相關(guān)變量轉(zhuǎn)化成一組少量不相關(guān)變量，并保留原始數(shù)據(jù)的信息。主成分分析表明，施磷量為100 mg·kg-1時(shí)，葉片的生理特性、抗氧化酶活性及苜蓿干草產(chǎn)量等指標(biāo)的綜合得分最高。因此，合理施磷量增加苜蓿葉片營養(yǎng)特性和光合生理性能，進(jìn)而提高其生產(chǎn)性能。

4 結(jié)論

苜蓿葉片氮磷含量、氣孔開度及抗氧化酶活性在中磷（100 kg·hm-2）最高，且氧化物質(zhì)含量最低。磷肥通過提高苜蓿葉片中氮磷含量，從而增加葉片葉綠素含量積累和抗氧化酶活性，降低葉片中氧化物質(zhì)含量，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的。綜合考慮苜蓿葉片的營養(yǎng)特性、生理參數(shù)及干草產(chǎn)量等因素，在新疆石河子地區(qū)連續(xù)多年施加磷肥條件下，推薦紫花苜蓿的施磷量為100 kg·hm-2。

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Effect of phosphorus Application on Physiological Parameters and Antioxidant Capacity in Alfalfa Leaves

ZHAO JianTao, YANG KaiXin, WANG XuZhe, MA ChunHui, ZHANG QianBing

College of Animal Science & Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, Xinjiang

【Objective】The aim of this study was to investigate the effects on nutrient uptake, photosynthetic pigment content, stomatal aperture and antioxidant system of alfalfa leaves after three consecutive years of phosphorus fertilizer application, so as to provide scientific fertilization methods for efficient production of alfalfa.【Method】Field trials were conducted at the forage experiment station of Shihezi University in Xinjiang from 2019 to 2021. ‘WL366HQ’ alfalfa was used as the test material, and four fertilizer treatments in the experiment included 0 (CK), 50 (Low P, LP), 100 (Middle P, MP), and 150 (High P, HP) kg·hm-2. Samples were taken at the first flowering of alfalfa to determine the hay yield, nitrogen and phosphorus content, pigment content, stomatal opening, antioxidant enzyme activity, and oxidizing substances of leaves.【Result】The nitrogen and phosphorus content, photosynthetic pigment content and stomatal aperture of leaves of alfalfa increased significantly (＜0.05) after 3 years of continuous phosphorus fertilization, with the highest nitrogen and phosphorus content under MP treatment (54.74 and 2.99 g·kg-1, respectively), the highest chlorophyll a and chlorophyll b content under MP, and the highest carotenoid content under LP or MP, and the lowest in CK. The stomatal aperture was the highest under MP and significantly higher than that under CK (＜0.05). Therefore, phosphorus fertilizer had different effects on the morphological and physiological characteristics of alfalfa leaves, and MP treatment significantly affected the photosynthetic and physiological characteristics of alfalfa leaves (＜0.05). Superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities were the highest under MP, with the value of 162.55, 406.40 and 147.13 U·g-1, respectively, and were significantly higher than those under CK (＜0.05). The malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide (H2O2) and proline (Pro) content were the lowest under MP, at 2.38 and 1.04 μmol·g-1and 56.85 μg·g-1, respectively. According to the Pearson correlation analysis, the total N and P contents of alfalfa leaves showed significant positive correlation (＜0.05) with chlorophyll content, carotenoid content, stomatal aperture, SOD activity and POD activity, and significant negative correlation (＜0.05) with MDA and H2O2content. The overall evaluation showed that the principal component scores of phosphorus application treatments were ranked as MP＞HP＞LP＞CK. 【Conclusion】 The reasonable application of phosphorus fertilizer increased the nutritional characteristics and photosynthetic physiological characteristics of alfalfa leaves, thus avoiding the stressful effects brought by other environmental factors, enhancing the adaptive capacity of alfalfa, and making it better adapted to external environmental changes. Considering the leaf morphology, photosynthetic physiological characteristics and antioxidant enzymes and oxidizing substances of alfalfa, the phosphorus application rate of 100 kg·hm-2was suitable under this experiment.

alfalfa; phosphorus fertilizer; leaf phenotype; leaf physiology; hay yield

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.03.005

2022-05-20；

2022-10-08

國家自然科學(xué)基金（32001400）、霍英東青年教師基金（171099）、兵團(tuán)科技創(chuàng)新骨干人才計(jì)劃項(xiàng)目（2021CB034）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

趙建濤，E-mail：1513192544@qq.com。通信作者馬春暉，E-mail：chunhuima@126.com。通信作者張前兵，E-mail：qbz102@163.com

（責(zé)任編輯 楊鑫浩）