蕓薹屬植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因組中的PCR鑒別

鄒婷，劉麗莉，向建華，周定港，吳金鋒，李莓，李寶，張大為，嚴(yán)明理,

蕓薹屬植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因組中的PCR鑒別

鄒婷1，劉麗莉1，向建華1，周定港1，吳金鋒1，李莓2，李寶2，張大為1，嚴(yán)明理1,2

1湖南科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院/經(jīng)濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室，湖南湘潭 410201；2湖南省作物研究所，長沙 410125

【目的】MYBL2負調(diào)控擬南芥花青素和原花青素的生物合成。從蕓薹屬6個物種的不同葉色材料中克隆MYBL2基因，分析其序列和表達模式，探究其在蕓薹屬植物花青素生物合成途徑中的功能，為油菜的品質(zhì)、抗逆性、觀賞性等性狀改良提供參考。【方法】以蕓薹屬6個物種19份供試材料的總DNA為模板，同源克隆MYBL2基因，并進行多序列比對和進化樹分析；對白菜、甘藍型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亞芥的紫葉材料進行遮光處理，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR分析MYBL2基因表達水平；對甘藍、甘藍型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亞芥紫、綠葉材料進行qRT-PCR分析MYBL2基因表達水平；根據(jù)克隆和序列的核苷酸變異位點設(shè)計特異性引物，開發(fā)能夠區(qū)分MYBL2基因組來源的PCR標(biāo)記。【結(jié)果】克隆獲得和各9個同源基因共56個拷貝。其中，為首次獲得，編碼區(qū)序列全長為867 bp，包含2個內(nèi)含子，分別為168和102 bp，編碼198個氨基酸，分子量為22.69 kD，等電點（pi）為8.72。序列比對和進化分析表明，來源于B基因組。蕓薹屬6個物種和同源基因中，僅、和在不同葉色材料中存在序列差異。經(jīng)遮光處理后，紫葉材料葉色變淺，在白菜紫寶5號中，和表達量分別為未遮光部分的0.7和0.4倍；在紫葉白花甘藍型油菜中，、、和表達量分別為未遮光部分的0.4、0.5、0.4和0.4倍；在紫葉芥中，、、和表達量分別為未遮光部分的0.4、0.3、0.4和0.2倍；在紫稈埃芥中，、和表達量分別為未遮光部分的0.3、0.4和0.5倍，而表達量為未遮光部分的2.4倍。對比蕓薹屬不同葉色材料MYBL2基因表達情況，結(jié)果表明，除了羽衣甘藍，在紫葉材料中MYBL2基因大部分同源基因的表達量均高于綠葉。在羽衣甘藍中，綠葉羽衣甘藍和的表達量分別為紫葉羽衣甘藍的2.5和3.5倍；在甘藍型油菜中，紫葉白花、和的表達量分別為綠葉白花的7.5、8.6和26.0倍，而綠葉白花的表達量為紫葉白花的13.0倍；在芥菜型油菜中，紫葉芥、、和的表達量分別為四川黃籽的8.3、11.8、23.2和14.6倍；在埃塞俄比亞芥中，紫稈埃芥、的表達量分別為W-BCDH76的7.1和27.6倍，而W-BCDH76的和的表達量則分別為紫稈埃芥的2.8和5.0倍。依據(jù)克隆的基因序列設(shè)計出5對引物，可以有效鑒別蕓薹屬植物MYBL2基因的A、B、C基因組來源?！窘Y(jié)論】蕓薹屬紫葉材料MYBL2基因的表達與光照密切相關(guān)，而且參與花青素生物合成的調(diào)控機制與擬南芥MYBL2負調(diào)控花青素生物合成的機制有所不同。

蕓薹屬植物；MYBL2基因；同源克隆；基因表達；基因組PCR鑒別

0 引言

【研究意義】油菜不僅是重要的油料作物，還是重要的膳食蔬菜，在全世界范圍內(nèi)都有廣泛的栽培和食用，其豐富的花色和葉色具有觀賞價值。花青素（anthocyanidins）和原花青素（proanthocyanidins，PAs）是植物體內(nèi)廣泛存在的色素，屬于類黃酮合成途徑中的次生代謝物，是影響植物花色、葉色、莖稈顏色和籽粒顏色形成的重要因素[1]，可以幫助植物本身應(yīng)對干旱、蟲害、凍害和吸引昆蟲授粉等，蔬用和油用則具有抗氧化、預(yù)防心血管和腫瘤疾病等功效[2-3]。植物花青素和原花青素的生物合成途徑非常復(fù)雜，涉及很多關(guān)鍵酶、轉(zhuǎn)運蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的參與[4-5]，探究并挖掘花青素和原花青素合成的關(guān)鍵基因，對油菜的品質(zhì)、抗逆性、觀賞性等性狀的改良具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】MYBL2（myeloblastosis family transcription factor like-2）轉(zhuǎn)錄因子屬于R3-MYB蛋白家族，參與植物抗逆境脅迫和類黃酮合成等重要生物過程的調(diào)控[6-7]。擬南芥負調(diào)控花青素的生物合成，且可能參與了花青素合成的反饋抑制，AtMYBL2通過與TT8（bHLH類轉(zhuǎn)錄因子）蛋白相互作用形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，該復(fù)合物能夠結(jié)合（編碼二氫黃酮醇4-還原酶，Dihydorflavonol 4-reductase）啟動子，抑制和的轉(zhuǎn)錄，從而抑制花色苷的積累[8-11]。在敲除系中，花青素合成關(guān)鍵基因和調(diào)控基因的表達水平上調(diào)，花青素含量顯著上升[12]。Song等[13]發(fā)現(xiàn)的表達與花青素含量呈負相關(guān)，紫甘藍（）葉片的紫色是由于啟動子替換或基因序列缺失導(dǎo)致的表達缺失所致。然而，Mushtaq等[14]結(jié)合qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組分析了紫、綠葉白菜（），結(jié)果表明，在紫葉中的表達量顯著高于綠葉。Rameneni等[15]結(jié)合qRT-PCR和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)在紅紫色白菜（reddish purple Chinese cabbage，RPCC）中的轉(zhuǎn)錄水平高于綠色白菜。Ye等[16]發(fā)現(xiàn)與甘藍型油菜黃色和白色花瓣相比，、和是杏色花瓣和粉色花瓣中唯一顯著上調(diào)的3個花青素調(diào)節(jié)基因，這些結(jié)果與黃色和白色花瓣中花青素含量較低相一致，與花青素積累呈顯著正相關(guān)。因此，MYBL2基因可能是蕓薹屬植物花青素生物合成途徑中重要的調(diào)控基因，但MYBL2基因是發(fā)揮正調(diào)控還是負調(diào)控功能需要進一步驗證。有報道表明基因組原位雜交能夠辨別蕓薹屬雜種后代的A、B、C基因組[17-18]，也有根據(jù)基因上的酶切位點來鑒定A、C組的報道[19]。基因組原位雜交操作比較復(fù)雜，有多態(tài)性且能被酶切的位點相對有限，雖然有利用PCR和FISH等方法檢測B組染色體上的特異序列的報道，但這樣的特異序列也非常有限[20]。Drenkard等[21]以擬南芥為研究材料開發(fā)了一種改進的等位基因特異性PCR程序，設(shè)計引物時引入錯配堿基形成錯配，用于檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點。YAN等[22-25]根據(jù)數(shù)據(jù)庫已有和克隆得到的蕓薹屬植物、和的DNA序列分別在A、B、C基因組中特有的核苷酸多態(tài)位點進行引物設(shè)計，開發(fā)出能夠簡單、快速地檢測基因的多態(tài)性和等位基因的基因組來源的PCR標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c】蕓薹屬植物基因的克隆和功能研究主要以白菜、甘藍、甘藍型油菜為主，在黑芥、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥中研究較少，蕓薹屬6個物種花青素生物合成途徑中MYBL2基因的功能尚未全部明確，關(guān)于蕓薹屬6個物種MYBL2基因序列的變異和多態(tài)性的研究也尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究基于已公布的和的DNA序列設(shè)計引物，以蕓薹屬6個物種不同葉色的材料為對象，同源克隆MYBL2基因，通過比較和在不同葉色材料中的序列差異和基因表達情況，以探討其與葉色之間的關(guān)系。通過分析蕓薹屬6個物種不同葉色材料中和特異的SNP位點，開發(fā)出能夠識別來自A、B、C基因組的MYBL2基因的PCR標(biāo)記，為進一步了解其功能及起源進化關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蕓薹屬6個物種19份材料，包括白菜（，2n=20，AA）早熟40、綠葉白菜、白菜全紫株、紫寶5號；黑芥（，2n=16，BB）Giebra（由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李再云課題組惠贈）；甘藍（，2n=18，CC）綠葉羽衣甘藍、紫葉羽衣甘藍；芥菜型油菜（，2n=36，AABB）四川黃籽、李G19、紫葉芥、Z44紫葉黃籽、紫葉cd30；甘藍型油菜（，2n=38，AACC）湘油787、ZSL409、綠葉白花和紫葉白花；埃塞俄比亞芥（，2n=34，BBCC）W-BCDH76、黃埃和紫稈埃芥，用途詳見電子附表1。

1.2 DNA提取和cDNA的合成

采用天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒提取葉片的總DNA和總RNA，運用北京擎科生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，1.0%瓊脂糖凝膠檢測DNA和RNA的完整性，核酸測定儀檢測其濃度和純度，將DNA和cDNA稀釋至50 ng·μL-1。

1.3 蕓薹屬MYBL2基因的克隆和序列分析

以19份供試材料葉片的總DNA為模板進行基因編碼區(qū)序列克隆，參照NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/）、BnTIR（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR）和BRAD（http://brassicadb.cn）等數(shù)據(jù)庫已有的和序列設(shè)計引物（電子附表2），由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為2×Rapid Taq master mix 10 μL、10 mmol?L-1正向引物1 μL、10 mmol?L-1反向引物1 μL、50 ng·μL-1DNA模板2 μL，無菌去離子水補足至20 μL。PCR擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收后，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，利用Amp抗性和X-gal/IPTG進行藍白斑篩選。選取6個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，采用DNAMAN軟件分析蕓薹屬不同葉色材料測序所得序列，結(jié)合數(shù)據(jù)庫已有的序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與蕓薹屬親緣關(guān)系較近物種的MYBL2蛋白質(zhì)序列進行比對，用MEGA11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 蕓薹屬MYBL2基因轉(zhuǎn)錄水平的分析

將紫寶5號、紫葉白花甘藍型油菜、紫葉芥和紫稈埃芥材料的紫葉進行遮光處理（3個生物學(xué)重復(fù)）2周，取葉片。將紫葉羽衣甘藍、綠葉羽衣甘藍、紫葉白花甘藍型油菜、綠葉白花甘藍型油菜、紫葉芥、四川黃籽、W-BCDH76和紫稈埃芥材料進行土培，6葉期時取新鮮葉片。對上述葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。并將紫葉遮光和未遮光材料送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。根據(jù)測序所得蕓薹屬6個物種MYBL2基因序列差異設(shè)計引物（電子附表2）。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測蕓薹屬MYBL2基因轉(zhuǎn)錄水平，以為內(nèi)參基因，qRT-PCR反應(yīng)體系為熒光染料SYBR 10 μL、10 mmol?L-1正向引物1 μL、10 mmol?L-1反向引物1 μL、50 ng·μL-1cDNA模板1 μL，無菌去離子水補足至20 μL。qRT-PCR擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，35個循環(huán)；65—95℃熔解曲線，每0.5℃讀板1次檢測擴增產(chǎn)物的特異性。用2-ΔΔCT算法分析目標(biāo)基因的相對表達量。

1.5 MYBL2-1和MYBL2-2等位基因的特異PCR檢測

根據(jù)蕓薹屬6個物種和多態(tài)位點和基因特性，通過多次設(shè)計引物和優(yōu)化PCR條件，設(shè)計5對特異性引物，能夠區(qū)分來自A、B、C基因組的MYBL2基因（電子附表2）。PCR反應(yīng)體系為2×Rapid Taq master mix 10 μL、10 mmol?L-1正向引物1 μL、10 mmol?L-1反向引物1 μL、50 ng·μL-1DNA模板2 μL，無菌去離子水補足至20 μL。PCR擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，33個循環(huán)；72℃ 5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 蕓薹屬植物MYBL2基因的克隆

以蕓薹屬6個物種19份供試材料葉片總DNA為模板進行編碼區(qū)序列的克隆，共克隆獲得和各9個同源基因，共計56段序列（電子附表1，電子附圖1）。其中，用引物和從埃塞俄比亞芥W-BCDH76材料中擴增獲得1條約1 000 bp大小的片段。測序結(jié)果表明，該序列為867 bp（電子附圖2），包含2個內(nèi)含子，分別為168和102 bp，且在參考基因組上未比對到相應(yīng)基因。因此，該片段系首次獲得，命名為。對序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該序列與參考基因組中和序列相似性最高，分別為100%和98.39%；與BRAD數(shù)據(jù)庫埃塞俄比亞芥另一個序列相似性為88.24%。因此，所獲得的確定為B基因組來源的。

2.2 蕓薹屬植物MYBL2-1氨基酸序列的推導(dǎo)與分子進化分析

根據(jù)埃塞俄比亞芥W-BCDH76材料的cDNA序列，用MEGA11.0和DNAMAN8.0軟件推導(dǎo)，BcaMYBL2-1共編碼198個氨基酸（圖1），分子量為22.69 kD，等電點（pI）為8.72，屬于R3-MYB家族。BLASTp分析結(jié)果表明，BcaMYBL2-1蛋白序列與黑芥BniB03.MYBL2-1的相似性為100%；與芥菜型油菜BjuB03.MYBL2-1的相似性為95.96%。經(jīng)多序列比對，BcaMYBL2-1與擬南芥、蘿卜以及蕓薹屬6個物種MYBL2序列具有較高的保守性（電子附圖3）。利用MEGA11.0構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)來自不同材料的MYBL2-1與MYBL2-2分別聚在不同進化枝，且來源相同基因組（A、B或C基因組）的蛋白聚在一起，表明與的分化在蕓薹屬基因組分化和異源四倍化之前（圖2）。BcaMYBL2-1與來自B基因組的BniB03.MYBL2-1和BjuB03.MYBL2-1的進化關(guān)系較近，進一步確定了其來源于B基因組。

BniB03 G：黑芥（Giebra）；Bca G：WBCDH76；Bca P：紫稈埃芥；BjuB03 SY：四川黃籽；BjuB03 PM：紫葉芥

Bra G：綠葉白菜；Bra P1：白菜全紫株；Bra P2：紫寶5號；Bni G：Giebra；Bol G：綠葉羽衣甘藍；Bol P：紫葉羽衣甘藍；SY：四川黃籽；PM：紫葉芥；Bna G：綠葉白花；Bna P：紫葉白花；Bca G1：W-BCDH76；Bca G2：黃埃；Bca P：紫稈埃芥；At：擬南芥；Rs：蘿卜

2.3 蕓薹屬植物不同葉色材料MYBL2基因的序列差異

通過對克隆MYBL2基因進行分析，結(jié)果表明，大部分克隆基因與參考基因組中序列完全一致（50/56），僅在部分材料中、和與參考基因組存在差異（表1）。比較蕓薹屬植物不同葉色材料MYBL2基因序列，與綠葉白菜相比，白菜全紫株外顯子區(qū)域存在一段長為61 bp的片段插入（表1、電子附圖4）。在芥菜型油菜中，不同葉色材料的外顯子區(qū)域均有該61 bp片段的插入，而甘藍型油菜中則均無該片段的插入（表1）。比較綠葉埃芥（W-BCDH76）和紫稈埃芥的編碼區(qū)序列，共發(fā)現(xiàn)9個核苷酸差異位點差異（電子附圖2），導(dǎo)致4處氨基酸變化（表1和圖1）；比較綠葉和紫葉羽衣甘藍的序列，共發(fā)現(xiàn)11個核苷酸位點變異，導(dǎo)致3個氨基酸變化（表1，電子附圖5）。但和在不同葉色的甘藍型油菜和埃塞俄比亞芥材料中的均無差異（電子附圖5）。此外，8個拷貝（黑芥暫無紫葉材料）在不同葉色材料中編碼區(qū)序列均無差異（電子附圖6）。

表1 蕓薹屬不同葉色材料MYBL2基因序列差異位點

61 bp片段為TTGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGAATCGATCCAACT

The 61 bp fragment is TTGTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGAATCGATCCAACT

2.4 遮光處理下蕓薹屬MYBL2基因的表達

白菜、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的紫葉材料經(jīng)遮光處理2周后進行轉(zhuǎn)錄組測序與qRT-PCR分析，結(jié)果表明，紫葉材料經(jīng)過遮光處理后葉色變淺，MYBL2基因表達普遍下調(diào)（圖3）。在紫寶5號、紫葉白花甘藍型油菜和紫葉芥中，與未遮光部分相比，MYBL2基因在遮光后均下調(diào)表達。在白菜紫寶5號中，和表達量分別為未遮光部分的0.7和0.4倍（圖3-B）；在紫葉白花甘藍型油菜中，、、和表達量分別為未遮光部分的0.4、0.5、0.4和0.4倍（圖3-C）；在紫葉芥中，、、和表達量分別為未遮光部分的0.4、0.3、0.4和0.2倍（圖3-D）。在紫稈埃芥中，、和表達量分別為未遮光部分的0.3、0.4和0.5倍，而表達量為未遮光部分的2.4倍（圖3-E）。對紫葉材料遮光前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明，花青素代謝途徑中基因在遮光后平均表達量相比未遮光部分均下調(diào)（圖4）。其中，、、等基因在蕓薹屬植物多個材料遮光后均下調(diào)表達，因此，推測上述基因與MYBL2基因一樣，與光照密切相關(guān)，且遮光后被抑制表達。

A：蕓薹屬紫葉材料遮光處理后的表型；B：紫寶5號；C：紫葉白花甘藍型油菜；D：紫葉芥；E：紫稈埃芥；sP：紫葉未遮光部分；sG：紫葉遮光部分

2.5 蕓薹屬植物不同葉色材料MYBL2基因的表達

比較甘藍、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥紫綠葉材料中MYBL2基因的表達，結(jié)果表明，除了羽衣甘藍，紫葉材料中MYBL2基因大部分同源基因均比綠葉上調(diào)表達。在羽衣甘藍中，綠葉羽衣甘藍和表達量分別為紫葉羽衣甘藍的2.5和3.5倍（圖5-B）；在甘藍型油菜中，紫葉白花、和表達量分別為綠葉白花的7.5、8.6和26.0倍，而綠葉白花表達量為紫葉白花的13.0倍（圖5-C）；在芥菜型油菜中，紫葉芥、、和表達量分別為四川黃籽的8.3、11.8、23.2和14.6倍（圖5-D）；在埃塞俄比亞芥中，紫稈埃芥、表達量分別為W-BCDH76的7.1和27.6倍，而W-BCDH76的和表達量則分別為紫稈埃芥的2.8和5.0倍（圖5-E）。對蕓薹屬紫綠葉材料中花青素合成相關(guān)（甘藍16個，甘藍型油菜31個，芥菜型油菜31個，埃芥32個）基因表達進行分析（電子附圖7），結(jié)果表明，甘藍、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥紫綠葉材料中花青素合成相關(guān)基因表達模式存在差異，推測上述材料紫葉形成機制存在差異。

2.6 MYBL2-1和MYBL2-2等位基因的特異PCR檢測

根據(jù)蕓薹屬6個物種和序列的SNP位點，設(shè)計5對引物以區(qū)分來自A、B、C基因組MYBL2基因（圖6）。在9份供試材料中，引物可從具有A基因組材料中擴增出預(yù)期的目標(biāo)條帶；引物B1、B2和B均可從B基因組材料中產(chǎn)生特異的目標(biāo)條帶；引物對僅從具有C基因組的材料中產(chǎn)生預(yù)期的目標(biāo)條帶。通過上述引物，可以有效地鑒別蕓薹屬植物MYBL2的基因組來源。

3 討論

3.1 羽衣甘藍不同葉色材料MYBL2基因的表達分析

比較不同葉色蕓薹屬植物MYBL2基因，結(jié)果表明，僅、和編碼區(qū)序列在紫、綠葉材料中存在差異。Song等[13]對紫葉甘藍位于C06染色體上的的啟動子區(qū)序列和編碼區(qū)序列研究，結(jié)果表明，無論是啟動子的替換，還是的全缺失，都可能導(dǎo)致甘藍紫葉性狀的出現(xiàn)。LIU等[26]在研究同一株觀賞性羽衣甘藍葉綠素、類胡蘿卜素和花青素色素沉著時，發(fā)現(xiàn)MYBL2基因在粉紅色葉片、淺粉紅色葉片和綠色粉色雜色葉片中依次上調(diào)表達。HAN等[27]在對甘藍花青素合成相關(guān)基因進行全基因組表征，發(fā)現(xiàn)和在紫葉甘藍（材料：15Z-P）中的表達量顯著低于綠葉羽衣甘藍（材料：120QY-G）。本研究綠葉羽衣甘藍和紫葉羽衣甘藍的編碼區(qū)序列存在11個核苷酸位點變異，會導(dǎo)致3個氨基酸變化，且紫葉材料中和表達量均相比綠葉低，但本研究所用甘藍材料編碼區(qū)序列的差異是否會導(dǎo)致葉色變化還有待進一步研究。

3.2 白菜、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥MYBL2基因的表達分析

Zhao等[28]發(fā)現(xiàn)在MYBL2基因上游通過抑制MYBL2基因正向調(diào)控蔗糖誘導(dǎo)的擬南芥花青素生物合成，MYBL2基因過表達顯著抑制過表達幼苗的花青素合成。Xie等[29]在研究茉莉酸和赤霉素對花青素合成的影響過程中發(fā)現(xiàn)MBW復(fù)合物活性被MYBL2和JAZ家族蛋白抑制，它們分別與bHLH和MYB/bHLH競爭性結(jié)合，DELLA蛋白直接隔離MYBL2和JAZ抑制子，導(dǎo)致bHLH/MYB亞基的釋放，隨后形成活性MBW復(fù)合物，激活花青素生物合成途徑，推測JAZ-DELLA-MYBL2模塊在非生物脅迫誘導(dǎo)的花青素合成中也發(fā)揮了重要作用。Nguyen等[30]研究發(fā)現(xiàn)在高強度光照情況下，HY5（bZIP家族）直接與啟動子結(jié)合抑制擬南芥MYBL2基因的表達增加花青素的積累。然而，在蕓薹屬植物研究中，IMTIAZ等[31]發(fā)現(xiàn)在釩脅迫下紫葉芥和綠葉芥花青素含量降低，花青素生物合成基因在紫葉芥中高表達，尤其是釩脅迫下的、和，釩濃度與花青素生物合成之間呈負相關(guān)，結(jié)果表明，、和的上調(diào)可以觸發(fā)釩脅迫下花色苷的積累。KHUSNUTDINOV等[32]發(fā)現(xiàn)在芥菜型油菜的3個紫色品種（Vitamin、Red velvet和Freckle）中的表達量均顯著高于綠色品種 。Ye等[16]發(fā)現(xiàn)與甘藍型油菜黃色和白色花瓣相比，、和是杏色花瓣和粉色花瓣中唯一顯著上調(diào)的3個花青素調(diào)節(jié)基因，這些結(jié)果與黃色和白色花瓣中花青素含量較低相一致，與花青素積累呈顯著正相關(guān)。本研究白菜、甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的紫葉材料經(jīng)遮光處理后葉色變淺，MYBL2基因表達量普遍下降，表明MYBL2基因的表達水平與光照密切相關(guān)且可能與花青素的積累呈正相關(guān)。對甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥不同葉色材料MYBL2基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，除了、和在紫葉中的表達量均低于綠葉，其余和在紫葉中的表達量均高于綠葉。因此，在蕓薹屬植物花青素合成途徑中MYBL2轉(zhuǎn)錄因子究竟發(fā)揮正調(diào)控、負調(diào)控還是拮抗功能？蕓薹屬植物與擬南芥MYBL2是否發(fā)揮著不同功能？仍需要進一步驗證。

A：紫寶5號；B：紫葉白花甘藍型油菜；C：紫葉芥；D：紫稈埃芥；sP：紫葉未遮光部分；sG：紫葉遮光部分

A：蕓薹屬不同葉色材料的表型；B（P）：紫葉羽衣甘藍；B（G）：綠葉羽衣甘藍；C（P）：紫葉白花甘藍型油菜；C（G）：甘藍型油菜綠葉白花；D（P）：紫葉芥；D（G）：四川黃籽；E（P）：紫稈埃芥；E（G）：W-BCDH76；P：紫葉材料；G：綠葉材料

A: Phenotypes ofwith different leaf colors; B(P): Green leaf kale; B(G): Purple leaf kale; C(P):with purple leaves and white flowers; C(G):with green leaves and white flowers; D(P): Purple leaf mustard; D(G): Sichuan Yellow; E(P):with purple leaf; E(G): W-BCDH76; P: Materials with purple leaf; G: Materials with green leaf

圖5 蕓薹屬不同葉色材料MYBL2基因的表達

Fig. 5 The expression ofwith different leaf color

M：標(biāo)準(zhǔn)分子量；A：白菜早熟40；B：黑芥；C：羽衣甘藍；AB1：紫葉芥；AB2：李G19；AC1：湘油787；AC2：紫葉白花甘藍型油菜；BC1：黃埃；BC2：紫稈埃芥；N：空白對照；ACT：內(nèi)參基因?qū)φ?/p>

3.3 蕓薹屬植物MYBL2基因A、B、C基因組的鑒別

蕓薹屬植物中，高花青素含量的材料多見在白菜、甘藍和芥菜型油菜，而大規(guī)模種植的甘藍型油菜其高花青素含量材料相對較少，且部分為遠緣雜交獲得[33-35]。本研究基于蕓薹屬6個物種和序列多態(tài)性位點設(shè)計的特異性引物，通過等位基因特異PCR可以準(zhǔn)確區(qū)分來自A、B基因組的基因和來自B、C基因組的。在解析蕓薹屬MYBL2基因功能后，上述標(biāo)記可為利用遠緣雜交在A、B、C基因組間轉(zhuǎn)移MYBL2基因，創(chuàng)制高花青素含量的甘藍型油菜提供參考。

4 結(jié)論

蕓薹屬紫葉材料經(jīng)遮光處理后，MYBL2基因表達量普遍下降，葉色變淺，表明該基因的表達與光照密切相關(guān)。除了羽衣甘藍，發(fā)現(xiàn)在甘藍型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥的紫葉材料中MYBL2基因的大部分同源基因的表達水平均高于綠葉，表明蕓薹屬植物中MYBL2基因參與花青素生物合成的調(diào)控機制與擬南芥有所不同。

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Cloning of MYBL2 gene fromand its PCR identification in genomes A, B and C

ZOU Ting1, LIU LiLi1, XIANG JianHua1, ZHOU DingGang1, WU JinFeng1, LI Mei2, LI Bao2, ZHANG DaWei1, YAN MingLi1,2

1College of Life Science and Health, Hunan University of Science and Technology/Hunan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Comprehensive Utilization of Cash Crops, Xiangtan 410201, Hunan;2Hunan Crop Research Institute, Changsha 410125

【Objective】In,MYBL2 negatively regulates the biosynthesis of anthocyanins and proanthocyanidinsThe MYBL2 genes from sixspecies with different leaf colors were cloned. By analyzing the sequence and expression pattern of MYBL2, the function of MYBL2 in the biosynthesis of anthocyanins inspecies was explored. 【Method】The sequences of MYBL2 from the sixspecies with different leaf colors were obtained using homology-based cloning method and multi sequence alignment and phylogenetic tree analysis were performed. The purple leaf materials of,,andwere treated with shading, and the expression level of MYBL2 gene was analyzed by transcriptome sequencing and qRT-PCR. The qRT-PCR in,,andwith purple and green leaves were also performed to evaluate the expression level of MYBL2. Based on the nucleotide variation sites of the clonedandsequences, PCR markers which could distinguish the genomic origin of alleles were developed. 【Result】A total of 56 copies of 9 homologs ofandwere cloned from 19 samples of six species of. Thegene was obtained for the first time. The total length ofsequence was 867 bp, including two introns of 168 bp and 102 bp respectively, encoding 198 amino acids, with a molecular weight of 22.69 kD and an isoelectric point (pI) of 8.72. Sequence alignment and evolutionary analysis showed thatwas derived from B genome. Among theandcopies of six species in, only,andexhibited sequence differences in different leaf color materials. After shading treatment, the leaf color of purple leaf material becomes lighter than that of the unshaded part. In Chinese cabbage Zibao 5, the expression ofandwith purple leaves and white flowers, the expression of,,and,,andwith purple leaf, the expression of,and, the results showed that the expression of most of the homologous genes of MYBL2 gene in purple leaf materials was higher than that in green leaf materials except kale. In kale, the expression ofand, the expression of,and,,andwere 8.3 times, 11.8 times, 23.2 times and 14.6 times of those in Sichuan yellow respectively. Inwith purple leaf, BcaMYBL2-1 and BcaB03.MYBL2-1 were 7.1 and 27.6 times as much as W-BCDH76, respectively. However,andgenes of W-BCDH76 were 2.8 and 5.0 times as much as those ofwith purple leaf, respectively. Five pairs of primers were obtained, which can effectively identify thefrom A, B and C genomes of. 【Conclusion】After shading treatment, MYBL2 gene expression was closely related to light. the regulation mechanism of MYBL2gene inplants involved in anthocyanin biosynthesis was different from that ofplants in which MYBL2 gene negatively regulated anthocyanin biosynthesis.

species; MYBL2gene; homologous cloning; gene expression; genomic PCR identification

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.03.002

2022-08-31；

2022-10-24

國家自然科學(xué)基金（31971980，U19A2029）

鄒婷，Tel：15297827231；E-mail：3392648002@qq.com。通信作者張大為，E-mail：zhangdawei.hnust@foxmail.com。通信作者嚴(yán)明理，E-mail：ymljack@126.com

（責(zé)任編輯 李莉）