基于p38 MAPK信號(hào)通路探討穴位埋線對(duì)哮喘大鼠肺組織Th1/Th2失衡及EOS的影響?

唐徐韻，陳盼碧△，杜狄佳，秦中銀，龍潤(rùn)錦

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.織金縣中醫(yī)院，貴州 織金 552100)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是呼吸系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病，以持續(xù)性的慢性氣道炎癥為特征[1]，其中嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)是哮喘氣道炎癥最重要的效應(yīng)細(xì)胞之一。當(dāng)EOS在氣道周?chē)技?、活化時(shí)，會(huì)釋放出具有細(xì)胞毒性的蛋白顆粒，并合成炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，從而引起氣道炎癥的發(fā)生。同時(shí)在哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中，Th1/Th2免疫失衡同樣是引起哮喘發(fā)病的重要原因。Th2所分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)EOS的黏附并影響EOS的活化，促進(jìn)EOS在局部的浸潤(rùn)而引發(fā)氣道炎癥，而Th1分泌的細(xì)胞因子γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等則可以拮抗IL-4的作用，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[2,3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，p38 MAPK信號(hào)通路可能是哮喘Th1/Th2免疫失衡發(fā)病機(jī)制的核心調(diào)控通路。研究表明，可以通過(guò)抑制磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)的表達(dá)，從而抑制p38 MAPK的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子，糾正Th1/Th2的免疫失衡[4-6]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，穴位埋線可以通過(guò)降低哮喘大鼠血清中IL-4的表達(dá)，升高IFN-γ的表達(dá)，從而起到防治哮喘的作用[7]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探討穴位埋線是否通過(guò)p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)哮喘失衡的Th1/Th2細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ，繼而影響EOS的募集、活化以達(dá)到治療哮喘的目的，為穴位埋線治療哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)20210012)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar雄性大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量(200±50)g，購(gòu)于湖南長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SCXK(湘)2019-0014。飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，濕度(55±2)%，室溫(25±2)℃，12 h/12 h明暗周期，提供普通飼料，自由飲水。

1.2 主要試劑及儀器

卵蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁，上海源葉科技有限公司(貨號(hào)S12015、S30353)，HE染色試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)20200115、20190603)，北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛(貨號(hào)3710)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；地塞米松磷酸鈉注射液(貨號(hào)XRF0624)，貴州光正制藥責(zé)任有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(貨號(hào)1610185)，美國(guó)BIO-RAD公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(貨號(hào)WBKLS0100)，美國(guó)密理博公司；快速瑞氏-吉姆薩染色試劑盒，貨號(hào)E607315，生工生物工程(上海)股份有限公司。

RM2235型切片機(jī)、EMUC7型超薄切片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；SA-YLS-8B型小動(dòng)物霧化給藥儀，江蘇賽昂斯生物科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京市六一儀器廠；1704150型轉(zhuǎn)膜機(jī)，美國(guó)BIO-RAD公司；BX51型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HT7700型透射電鏡，日本Hitachi公司。

1.3 分組與造模

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，根據(jù)計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組和穴位埋線組，各10只。參考文獻(xiàn)方法制備哮喘模型[8]，造模過(guò)程分為致敏和激發(fā)2個(gè)階段。除正常組外其余各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第1天腹腔注射1 mL 10% OVA和10%氫氧化鋁混懸液致敏，實(shí)驗(yàn)第8天以上3組大鼠重復(fù)上述過(guò)程以加強(qiáng)致敏，正常組大鼠在相同時(shí)間腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 mL。第15天起除正常組外其余各組大鼠分別放于小動(dòng)物霧化給藥儀中，給予1% OVA溶液霧化吸入激發(fā)，霧粒直徑3～5 μm，每日1次，每次30 min，持續(xù)2周。霧化過(guò)程中進(jìn)行觀察并記錄，以大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹式呼吸、鼻癢抓鼻等表現(xiàn)提示造模成功。

1.4 治療方法

參考文獻(xiàn)進(jìn)行埋線針具的準(zhǔn)備，事先準(zhǔn)備一次性無(wú)菌7號(hào)注射針針頭和羊腸線若干，置于無(wú)菌彎盤(pán)中備用[9]。將羊腸線剪成0.2 cm-0.5 cm左右小段若干，用鑷子將羊腸線從無(wú)菌7號(hào)注射針針尖穿入，再將預(yù)先剪去針尖的毫針(0.30 mm×50 mm)從注射針針尾部穿入，組成1套埋線針具備用。

正常組和模型組每日正常喂養(yǎng)，不予任何處理。西藥組于實(shí)驗(yàn)第15天起腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液(1.5 mg/kg)，每日1次，連續(xù)2周，具體注射量根據(jù)人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量比值進(jìn)行換算[10]。穴位埋線組于實(shí)驗(yàn)第15天進(jìn)行埋線，由于羊腸線吸收時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中僅埋線1次，穴位選取“肺俞”“腎俞”“脾俞”“定喘”和“膻中”，具體穴位定位方法參照全國(guó)“十三五”規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]?！胺斡帷薄岸ù毙贝? mm，“脾俞”“腎俞”直刺6 mm,“膻中”針尖向上平刺6 mm，緩慢將腸線推入穴內(nèi)，覺(jué)注射針內(nèi)有空虛感時(shí)方可出針，并檢查有無(wú)線頭外露，確保腸線已埋入大鼠體內(nèi)。

1.5 標(biāo)本制備

在末次激發(fā)后的24 h內(nèi)用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，切開(kāi)胸腔充分暴露肺組織和氣管后進(jìn)行肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺組織標(biāo)本的制備。

1.5.1 BALF制備 分離出氣管后結(jié)扎右主支氣管，立刻將2 mL 0.9%氯化鈉溶液緩慢注入左肺中，見(jiàn)左肺逐漸變得膨隆后輕柔按壓肺組織，20 s后立即緩慢回抽灌洗液，如此反復(fù)抽注3次，后將灌洗液收集于離心管中。分別重復(fù)上述操作3次，將灌洗液4 ℃保存，用于EOS相對(duì)含量的測(cè)定。

1.5.2 肺組織制備 絲線結(jié)扎右肺門(mén)后取下右肺，4%多聚甲醛緩沖液中固定用于HE染色；取右上肺組織數(shù)塊(每塊約100 mg)放于1 mL EP管中-80 ℃保存，用于提取蛋白；取右下肺時(shí)在1～3 min內(nèi)快速取下2 mm×2 mm大小的肺組織，立即放入1 mL的EP管中，電鏡固定液室溫固定2 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃保存，用于透射電鏡觀察。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 引喘潛伏期 計(jì)數(shù)引喘潛伏期，即從霧化激發(fā)開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)呼吸急促、搔鼻抓面等哮喘癥狀的時(shí)間，以s為單位觀察記錄10 min，若潛伏期超過(guò)10 min則引喘潛伏期以600 s計(jì)。

1.6.2 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué) 肺組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，清水沖洗過(guò)夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，組織浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為4 μm。切片進(jìn)行常規(guī)二甲苯、梯度乙醇至水脫蠟處理，蘇木素染色后自來(lái)水沖洗，鏡下觀察著色情況，封片后顯微鏡下觀察并拍照保存。

1.6.3 電鏡觀察肺組織EOS超微結(jié)構(gòu) 將標(biāo)本從電鏡固定液中取出，磷酸鹽緩沖液沖洗并浸泡過(guò)夜，再用1%鋨酸緩沖液固定1 h，梯度酒精脫水，包埋、聚合后用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，透射電鏡觀察EOS的超微結(jié)構(gòu)并拍照保存。

1.6.4 瑞氏染色觀察BALF中EOS相對(duì)含量 BALF常溫離心，棄掉上清液后用移液槍將細(xì)胞沉渣懸液打勻，滴加在載玻片上制作灌洗液涂片。干燥后放入甲醇固定液中5～10 min，滴加適量的染色液到載玻片上，室溫孵育5～10 min。蒸餾水洗滌風(fēng)干后封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)EOS的相對(duì)含量。EOS的相對(duì)含量=EOS的數(shù)量/細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.6.5 Western blot檢測(cè)肺組織p-p38 MAPK、IFN-γ、IL-4蛋白表達(dá) 取100 mg肺組織蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按相同蛋白濃度進(jìn)行上樣，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，快速封閉，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(β-actin 1︰1000，p-p38 MAPK 1︰300，IFN-γ1︰500，IL-4 1︰500)，洗膜后孵育二抗(1︰5000)。滴加化學(xué)顯色液后用圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行檢測(cè),Image lab軟件分析處理?xiàng)l帶，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠引喘潛伏期的變化

表1示，與正常組比較，模型組大鼠引喘潛伏期明顯縮短(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠的引喘潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組引喘潛伏期縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠引喘潛伏期比較

2.2 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

圖1示，正常組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，支氣管周?chē)匆?jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠支氣管管腔縮小，管壁增厚、變形，支氣管周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；西藥組大鼠支氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本接近正常，周?chē)鸁o(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；穴位埋線組大鼠支氣管變形緩解，周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)減少。

注：紅色箭頭示大量炎性細(xì)胞聚集于支氣管周?chē)缓谏^示支氣管管壁增厚、變形；黃色箭頭示氣管管腔縮小

2.3 各組大鼠肺組織EOS超微結(jié)構(gòu)的變化

正常組大鼠肺組織中可見(jiàn)EOS包膜完整，細(xì)胞內(nèi)含嗜酸性顆粒且中心鍵明顯，細(xì)胞處于靜息狀態(tài)；模型組可見(jiàn)EOS胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)不均勻，內(nèi)含有腫脹、密度不均的嗜酸性顆粒，EOS處于活化狀態(tài)；西藥組可見(jiàn)EOS胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)含受損細(xì)胞器的自噬泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)；穴位埋線組可見(jiàn)EOS細(xì)胞體積縮小，胞內(nèi)同樣可見(jiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)透射電鏡圖片(×6000)

2.4 各組大鼠BALF中EOS相對(duì)含量變化

表2示，與正常組比較，模型組大鼠EOS的相對(duì)含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠EOS的相對(duì)含量明顯降低(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組大鼠EOS的相對(duì)含量升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠BALF中EOS相對(duì)含量比較

2.5 各組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4、IFN-γ蛋白表達(dá)變化

表3圖3示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，西藥組和穴位埋線組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與西藥組比較，穴位埋線組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，IFN-γ蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠肺組織p-p38 MAPK、IL-4、IFN-γ蛋白表達(dá)比較

注：A正常組；B模型組；C西藥組；D穴位埋線組；磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 mitogen-activated protein kinase, p-p38 MAPK)，白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)，γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)

3 討論

哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，主要病機(jī)為宿痰內(nèi)伏于肺遇外邪而引動(dòng)。中醫(yī)認(rèn)為哮喘為本虛標(biāo)實(shí)之證，在肺為實(shí)、在腎為虛，強(qiáng)調(diào)“急則治其標(biāo)，緩則治其本”“發(fā)時(shí)治肺，緩時(shí)治腎”等治療原則。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘的長(zhǎng)期發(fā)作不僅存在氣道炎癥、氣道痙攣等“肺實(shí)”表現(xiàn)，還存在因免疫功能紊亂導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)的防御能力低下等“腎脾皆虛”表現(xiàn)[12，13]。因此，臨床大多數(shù)學(xué)者提倡以“標(biāo)本兼治”原則治療哮喘更為合適[14，15]，既要宣肺降氣平喘，緩解哮喘炎癥，又要調(diào)理臟腑功能，改善機(jī)體免疫。課題組前期研究也證實(shí)，從標(biāo)本兼治的角度選穴論治哮喘，其治療效果優(yōu)于單純治標(biāo)或治本[15]。經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，脾為生痰之源，肺為貯痰之器，調(diào)理肺、脾、腎三臟既可扶助正氣又可祛除宿根宿痰，是從根本上治療哮喘的方法；同時(shí)“定喘”為治療哮喘的經(jīng)驗(yàn)穴，具有定喘止咳、發(fā)散風(fēng)寒的作用。因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上增加了“脾俞”和“定喘”2個(gè)穴位[15]，從“標(biāo)本兼治”的角度選取“肺俞”“腎俞”“脾俞”“定喘”和“膻中”進(jìn)行穴位埋線。

Th1/Th2免疫失衡是哮喘重要的發(fā)病機(jī)制之一，由Th1和Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子的失衡可對(duì)應(yīng)激反應(yīng)下的炎癥起到一定調(diào)控作用，EOS也會(huì)受到這一過(guò)程的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達(dá)升高，IFN-γ蛋白表達(dá)下降，BALF中EOS的相對(duì)含量升高，EOS處于活化狀態(tài)。提示在炎癥反應(yīng)的刺激下，p38 MAPK的活化可以促進(jìn)Th2細(xì)胞分泌IL-4、抑制Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，從而促進(jìn)EOS在炎癥組織中的浸潤(rùn)和活化。經(jīng)治療后發(fā)現(xiàn)，西藥組和穴位埋線組大鼠肺組織中p-p38 MAPK、IL-4蛋白表達(dá)下降，IFN-γ蛋白表達(dá)升高，BALF中EOS相對(duì)含量下降，EOS內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞自噬樣的結(jié)構(gòu)改變。提示地塞米松和穴位埋線可以抑制p38 MAPK的激活和Th2細(xì)胞分泌IL-4，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，從而減少EOS在炎癥組織中的浸潤(rùn)和活化。相關(guān)研究表明，p38 MAPK信號(hào)通路與哮喘的發(fā)病，特別是Th1/Th2失衡免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，p38 MAPK在被炎癥反應(yīng)激活的同時(shí)，也參與了炎癥細(xì)胞因子基因的表達(dá)和蛋白合成的調(diào)控[16-19]，說(shuō)明p38 MAPK的激活在Th1和Th2細(xì)胞分化中起著重要作用，可以調(diào)節(jié)IL-4等致炎因子與IFN-γ等抗炎因子的分泌，影響生物體致炎和抗炎反應(yīng)的平衡，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，穴位埋線可對(duì)哮喘大鼠肺組織中EOS活化的過(guò)程起到一定抑制作用，可引起EOS出現(xiàn)細(xì)胞自噬樣細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，因此推測(cè)這可能也是穴位埋線治療哮喘的作用機(jī)制之一。

綜上所述，穴位埋線可以減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀，其機(jī)制可能與抑制p38 MAPK的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平，糾正Th1/Th2的免疫失衡，抑制EOS的浸潤(rùn)和活化有關(guān)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，雖然穴位埋線治療哮喘的效果較地塞米松稍差，但激素的長(zhǎng)期使用可能引起藥物依賴(lài)、代謝紊亂和感染等不良反應(yīng)，而穴位埋線更為安全、便捷，患者的依從性更好。因此，穴位埋線作為中醫(yī)治療哮喘的特色方法之一仍然具有一定的優(yōu)勢(shì)。