基于“水不涵木”及“方證相應”探討肝陽上亢證對機體的影響機制及實驗研究?

孫永康，王新志，劉向哲，王小燕

(1.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

肝陽上亢證是臨床常見證型，最早記載于《臨證指南醫(yī)案·中風》[1]，可見于高血壓病、失眠、甲亢、更年期綜合征、慢性腦缺血等多種疾病[2,3]。目前對該證的研究多以病證結合方式為主，如李運倫等[4,5]研究高血壓病肝陽上亢證的物質基礎以及診斷量表、療效評價體系的構建；黃德健等[6]借助影像技術觀察偏頭痛肝陽上亢證及非肝陽上亢證的腦部組織差異；鐘廣偉等[7,8]研究高血壓等疾病肝陽上亢證動物模型下丘腦等組織蛋白質、基因的表達，而對于單純證型的研究則較少[9]。

肝腎陰虛作為本證的病理基礎在現(xiàn)代得到了廣泛認可[10]；在肝陽上亢證的診斷標準中也包含肝腎陰虛癥狀[11]?！端貑枴り庩枒蟠笳撈酚涊d：“腎生骨髓，髓生肝”，葉天士[1]言：“肝為風臟，因精血衰耗，水不涵木，木少滋榮，故肝陽偏亢，內風時起”及張山雷[12]提出“蓋真陰若充，肝陽亦必不動，木之動無不本于水之虛”，可見肝有賴于腎臟精血濡養(yǎng)，腎中精血不足導致腎陰虛進而肝失腎之濡養(yǎng)，兩臟并虛發(fā)為肝腎陰虛、肝陽失于制約，發(fā)為肝陽上亢證。故可以認為腎陰虛是肝腎陰虛發(fā)生的原因，同時也是導致肝陽上亢證的根本原因。天麻鉤藤飲為治療本證的經(jīng)典代表方劑，該方由近現(xiàn)代醫(yī)家胡光慈創(chuàng)立[13,14]。

中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP )V2.0是中國中醫(yī)科學院中藥研究所開發(fā)的一種能夠以癥狀為切入點，預測疾病不同證型生物學基礎的系統(tǒng)，可為傳統(tǒng)理論科學內涵研究提供可能的依據(jù)[15,16]。本研究在“水不涵木”及“方證相應”理論指導下，借助TCMIP V2.0平臺，以肝陽上亢證臨床表現(xiàn)、腎陰虛證臨床表現(xiàn)和經(jīng)典方劑天麻鉤藤飲藥物作用基礎聯(lián)合預測肝陽上亢證可能對人體的作用機制，并通過動物實驗進行驗證，這可能為證候生物學基礎研究提供一定幫助。本研究通過河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物倫理委員會批準(批號DWLL202105053)。

1 資料與方法

1.1 整合藥理學分析

1.1.1 腎陰虛證、肝陽上亢證靶標及天麻鉤藤飲藥物作用靶標 腎陰虛證、肝陽上亢證臨床表現(xiàn)參照全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中醫(yī)診斷學》[10]。運用TCMIP V2.0系統(tǒng)“疾病相關分子集及其功能挖掘”模塊，篩選出腎陰虛證臨床表現(xiàn)所對應英文詞條，構建腎陰虛證相關分子庫，運用“證候相關分子挖掘及功能分析”模塊，篩選出肝陽上亢證臨床表現(xiàn)所對應英文詞條，構建肝陽上亢證相關分子庫；運用“中藥(含方劑)靶標預測及功能分析”模塊，構建天麻鉤藤飲相關分子庫[16]。

1.1.2 基因功能富集分析及關聯(lián)網(wǎng)絡可視化展示 TCMIP V2.0系統(tǒng)中鑲嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT等多個數(shù)據(jù)庫中蛋白質相互作用信息[16]。運用“中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘”中“疾病-證候-方劑”功能，在1.1.1結果基礎上，選擇腎陰虛證、肝陽上亢證與天麻鉤藤飲進行聯(lián)合藥理學分析。根據(jù)交集核心網(wǎng)絡靶標進行GO富集分析，以及Reactome通路富集分析，GO富集分析包括生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)，在此基礎上構建“疾病-證候-方劑-藥物-有效成分-核心網(wǎng)絡靶標-通路”關聯(lián)網(wǎng)絡。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 8周齡SD雄性大鼠，體質量約250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK(京)2021-0006。大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室溫(23±2)℃，維持明暗交替，自由攝食和飲水。

1.2.2 藥物 附子顆粒(0.7 g/袋，相當于中藥飲片6 g，批號1091432)，廣東一方制藥有限公司生產，購自河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。將附子顆粒水浴加熱溶解得到附子藥液，濃度相當于中藥飲片0.2 g/mL。

1.2.3 主要試劑與儀器 蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抗體、環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein,CREB)抗體、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)抗體、膜鐵轉運蛋白(recombinant ferroportin,Fpn)抗體，貨號分別為GB11598、GB111052、GB11034B、GB111471，武漢賽維爾生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抗體(貨號BSM-33219 M)，北京Bioss生物技術有限公司；轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,Tfr)抗體(貨號A18083)，武漢Abclonal科技有限公司；核因子E2相關因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2,Nrf2)抗體、血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體(貨號16396-1-AP、27282-1-AP)，武漢三鷹生物技術有限公司。

RT-6100型酶標儀，Rayto生命科學股份有限公司；D3024R型臺式高速冷凍離心機，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司；JY92-11N型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；6300型化學發(fā)光儀，上海勤翔科學儀器有限公司；NIKON ECLIPSE E100型正置光學顯微鏡，日本尼康公司；D1008E型掌上離心機、BV-2型垂直電泳儀、BT-2型轉印電泳儀，武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2.4 動物分組及干預方法 將12只SD大鼠隨機分為對照組及模型組，模型組使用附子藥液灌胃，藥物劑量相當于生藥2 g/(kg·d)，大鼠灌胃劑量按動物體表面積系數(shù)折算，動物藥物劑量=(人體藥物劑量/60 kg)×6.25，灌胃4周；從第5周開始每天灌胃0.9%氯化鈉溶液代替治療，連續(xù)2周[17,18]。對照組全程用等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.5 標本采集 灌胃結束后取材。將麻醉后的大鼠放置于取材板，剪開腹腔皮膚逐步向上打開胸腔；暴露心臟剪開左心耳，使用20 mL注射器經(jīng)左心室注射0.9%氯化鈉溶液；灌注結束后斷頭處死大鼠，取全腦剝離大腦皮質組織。

1.2.6 觀測指標 一般情況觀察大鼠鞏膜顏色、飲水量、活動量、易激惹程度等。普魯士藍染色法檢測大腦皮質鐵代謝，腦組織切片后依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精；水洗后使用普魯士藍染液染色；中性樹膠封片、顯微鏡鏡檢、圖像采集分析。Western blot法檢測HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表達，皮質組織勻漿，冰上裂解，BCA法檢測總蛋白濃度；電泳、轉模分別加入HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF一抗(均為1:1 000)，4 ℃孵育；TBST洗脫，室溫下加入二抗(1:3 000)。ECL顯色，Alpha軟件系統(tǒng)分析目標條帶灰度值。

2 結果

2.1 整合藥理學分析結果

2.1.1 肝陽上亢證及腎陰虛證臨床表現(xiàn)及對應英文詞條 根據(jù)肝陽上亢證臨床表現(xiàn)，篩選出29個對應詞條；根據(jù)腎陰虛證臨床表現(xiàn)，篩選出25個對應詞條(見表1)。

表1 肝陽上亢證及腎陰虛證臨床表現(xiàn)及對應英文詞條

2.1.2 關聯(lián)網(wǎng)絡分析 表2示，腎陰虛證、肝陽上亢證與天麻鉤藤飲聯(lián)合藥理學分析獲得核心網(wǎng)絡靶標564個，其中核心節(jié)點209個，部分核心節(jié)點展示。GO富集分析生物過程(biological process,BP)、細胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)分別得到前20個條目：BP結果顯示，肝陽上亢證參與機體的生物過程，包括對細胞增殖、細胞凋亡、基因表達的雙向調控，參與細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、衰老、DNA轉錄、細胞凋亡、信號傳導，和對有機物質反應、蛋白質自磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ轉錄的正向調控等；CC富集結果顯示，該證可能作用的部位包括細胞質、細胞質膜、細胞核、核基質、內質網(wǎng)、谷氨酸能突觸、突觸前膜的整體成分、突觸后、神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘、線粒體、線粒體呼吸鏈復合物Ⅱ等，包括細胞的多個部位及突觸、神經(jīng)元、線粒體等結構的多個部分；MF富集結果顯示，該證能夠催化蛋白質、酶、藥物、轉錄因子、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)、血清素、核苷酸及含蛋白復合物的結合，影響核受體、蛋白質異源二聚體、蛋白質同源二聚體、神經(jīng)遞質受體、G蛋白偶聯(lián)5-羥色胺受體、類固醇激素受體、激酶及蛋白激酶活性。Reactome通路富集前20條通路，包含VEGF受體(VEGF receptor,VEGFR)2、Rapidly accelerated fibrosarcoma(Raf)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、PI3K、3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇蛋白(PIP3 protein,PIP3)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、信號傳導轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3,STAT3)、PKA、CREB1等相關通路(見圖1)。

表2 基于腎陰虛證、肝陽上亢證、天麻鉤藤飲聯(lián)合藥理學分析所得部分核心節(jié)點展示

圖1 肝陽上亢證核心節(jié)點Reactome富集分析前20條通路

2.1.3 關聯(lián)網(wǎng)絡可視化展示由圖2來關聯(lián)網(wǎng)絡中包含11味中藥86個中藥有效成分210個核心節(jié)點28條通路。其中根據(jù)實驗結果增加了核心節(jié)點HO-1和通路Ferroptosis。

圖2 基于腎陰虛證、肝陽上亢證、天麻鉤藤飲聯(lián)合構建的“疾病-證候-方劑-藥物-有效成分-核心網(wǎng)絡靶標-通路”關聯(lián)網(wǎng)絡

2.2 實驗結果

2.2.1 一般情況 灌胃結束后，模型組較對照組大鼠表現(xiàn)出易激惹程度、飲水量、活動增加等表現(xiàn)，提示造模成功。

2.2.2 大鼠皮質普魯士藍染色結果 普魯士藍染色顯示，模型大鼠皮質細胞外有多個藍色斑點，提示細胞外存在鐵沉積(見圖3)。

圖3 大鼠皮質普魯士藍染色結果(左側為對照組，右側為模型組)

2.2.3 Western blot法檢測HO-1、Nrf2、Tfr、Fpn、PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表達結果 Westernblot檢測結果見圖4，模型組大鼠皮質組織鐵代謝相關蛋白Fpn、Nrf2、HO-1較空白組表達有升高趨勢，Tfr蛋白表達有所下降；模型組大鼠PI3K蛋白表達減少，PKA、CREB、VEGF蛋白表達增加。

圖4 大腦皮質相關蛋白(K為對照組，M為模型組)

3 討論

目前對于單純肝陽上亢證型，尤其是該證對腦組織影響的研究較少。筆者結合肝陽上亢形成的根本原因及經(jīng)典名方天麻鉤藤飲，以“水不涵木”及“方證相應”為指導，借助TCMIP V2.0平臺，尋找出證候臨床表現(xiàn)對應的詞條，根據(jù)詞條及藥物有效成分篩選核心交集靶標，進而富集分析得到該證對機體產生影響可能作用的部位、生物過程等，并篩選出富集程度較高的通路，構建出“疾病-證候-方劑-中藥-中藥藥效成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡。網(wǎng)絡藥理學預測結果受數(shù)據(jù)庫等因素影響，存在一定的限制[19]。筆者還根據(jù)實驗結果補充了鐵代謝相關靶點及通路，對數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有內容進行了補充。本研究以中醫(yī)理論為指導，結合該證的根本病因及方藥，能夠更準確、更合理地預測該證作用機制，縮小了預測范圍、增強了可信度。

富集分析結果顯示，VEGFR2、Raf/MAPK、PI3K、PIP3/Akt、STAT3、PKA、CREB1等相關通路富集程度較高。VEGF/VEGFR2信號傳導通路可以促進血管新生，是重要的正性調控通路[20]；而缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1α介導的VEGFA/VEGFR2可以影響胞質緊密黏連蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)的降解，進而使血管通透性增強，血腦屏障受到破壞[21]；推測本研究中VEGFR2主要影響血管通透性，但預實驗結果發(fā)現(xiàn)模型大鼠VEGF表達也有變化，故其可能通過上述兩種機制影響腦組織。有研究報道，Raf/MAPK通路可促進記憶功能穩(wěn)定，促進細胞增殖和細胞存活[22-24]。成纖維細胞生長因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)是PI3K相關通路的核心節(jié)點，F(xiàn)GF1-PI3K-Akt通路可以影響心肌細胞增殖[25]，可能該證對神經(jīng)細胞也有促進增殖的作用。PIP3/Akt信號通路可能與細胞的線粒體功能和細胞活力有關[26]；磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)介導的PIP3/Akt 通路可能與多種神經(jīng)退行性疾病及衰老有關[27,28]，這為進一步研究本證與疾病的聯(lián)系提供指導。腺苷酸環(huán)化酶6抗體(adenylate cyclase 6,Adcy6)、 R1A of the protein kinase A(RKAR1A1A)是PKA相關通路的核心節(jié)點，Adcy6可影響環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量，進而影響PKA，使CREB磷酸化增強，從而影響肝臟葡萄糖代謝[29]。這與高血壓肝陽上亢證葡萄糖代謝異常的結果相符合[30]；PRKAR1A可影響PKA活性，進而影響CREB、Akt，促使下游凋亡相關基因BCL2的表達[31]。核心節(jié)點PRKACA(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha)與PKA、CREB1相關通路均有聯(lián)系，研究顯示，低氧預處理可減輕低氧暴露力竭小鼠心肌損傷，其機制可能通過活化腺苷受體，進而影響G蛋白偶聯(lián)、胞內腺苷酸環(huán)化酶及單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)生成，增加細胞內cAMP含量，引起PRKACA/B及 CREB1等相關分子表達上調[32]，這提示肝陽上亢證可能與組織缺氧損傷有關。

本研究采用附子灌胃的方法建立肝陽上亢證模型，對與腦病相關的VEGFR2血管相關通路、PI3K信號通路、PKA信號通路、CREB1信號通路相關蛋白進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)模型大鼠皮質PI3K、PKA、CREB、VEGF蛋白表達均存在變化，在后續(xù)工作中可通過這些通路開展研究。筆者還根據(jù)當前的研究熱點檢測了鐵代謝相關指標，發(fā)現(xiàn)模型大鼠與正常大鼠比較，大腦皮質細胞外出現(xiàn)鐵沉積，鐵代謝相關蛋白HO-1、Fpn、Nrf2升高，Tfr降低，推測肝陽上亢證通過激活Nrf2，減少Tfr介導的鐵從胞外向胞內的轉運，增加Fpn介導的轉出，導致鐵從細胞內向細胞外轉運，這可能是模型大鼠表現(xiàn)出易激惹、興奮等癥狀的物質基礎，同時該變化過程與阿爾茨海默病、帕金森病等疾病中鐵轉運的方向相反，故該證還可能與這些疾病的防治存在聯(lián)系[33,34]。

綜上所述，肝陽上亢證可能通過多靶點、多通路、多機制對機體產生影響；對大腦皮質PI3K、PKA、CREB、VEGF相關通路有明確影響作用，還能夠促使大鼠皮質細胞內鐵向細胞外的轉運。在后續(xù)研究中，計劃深入探索肝陽上亢證通過Nrf2相關信號通路影響腦組織鐵代謝的機制，并開展實驗確定以附子為代表的溫陽法對阿爾茨海默病等疾病的治療作用。