長(zhǎng)鏈非編碼RNA lnc-CCDC33-1:1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及臨床意義

李鵬平，蘭霞斌，黃煜慶

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬蕭山醫(yī)院 杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，浙江 杭州 311201；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 浙江省腫瘤醫(yī)院 頭頸外科，浙江 杭州 310005

甲狀腺癌是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是主要病理類型（占80%以上）[2]。盡管大部分PTC預(yù)后良好，但部分高危特征的PTC存在甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B）突變，預(yù)后較差[3]，給患者及其家庭帶來(lái)較大的身心及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）在多種腫瘤中發(fā)揮作用，是潛在的腫瘤標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[4]。有研究報(bào)道lncRNA NAMA、BANCR和PTCSC3等對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展有重要作用[5-7]。Lnc-CCDC33-1∶1在甲狀腺癌中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期通過(guò)基因芯片檢測(cè)初步發(fā)現(xiàn)lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表達(dá)升高[8]。本研究擬進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并結(jié)合癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas,TCGA）[9]的數(shù)據(jù)，分析lnc-CCDC33-1∶1與甲狀腺乳頭狀癌臨床因素的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料

1.1.1 本地隊(duì)列數(shù)據(jù)：收集2021年11月至2022年3月杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院的120例PTC組織及30例癌旁正常甲狀腺組織。所有PTC患者均為初診病例，其中男38例，女82例。根據(jù)lnc-CCDC33-1∶1相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)分為低表達(dá)組（60例）和高表達(dá)組（60例），其中高表達(dá)組年齡為（41.8±12.9）歲，低表達(dá)組年齡為（44.0±12.6）歲。所有病例均經(jīng)2位以上病理科醫(yī)師確診，組織標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)前均儲(chǔ)存于液氮中。其中，臨床特征中甲狀腺外侵犯和多灶性由手術(shù)結(jié)合病理學(xué)報(bào)告聯(lián)合認(rèn)定，是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移由術(shù)前各項(xiàng)檢查（包括胸部CT、腹部B超、PET-CT等）判定，TNM分期根據(jù)所獲取的臨床和組織病理學(xué)情況，對(duì)照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第八版癌癥分期系統(tǒng)來(lái)判定。本研究經(jīng)杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫審字（科）[2021]43號(hào)]，所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 TCGA隊(duì)列數(shù)據(jù)：選取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https∶//cancergenome.nih.gov）中的502例PTC患者臨床及測(cè)序資料，其中男135 例，女367 例，根據(jù)lnc-CCDC33-1∶1相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)分為低表達(dá)組（254例）和高表達(dá)組（248 例）。其中高表達(dá)組年齡為（46.2±15.7）歲，低表達(dá)組年齡為（48.4±15.9）歲。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）應(yīng)用TRIzol（美國(guó)賽默飛世爾公司）提取組織標(biāo)本中的RNA；使用PrimeScript RT Master Mix（日本TaKaRa公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；應(yīng)用SYBR Premix Ex Taq II（日本TaKaRa公司），于LightCycler 480 中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算lnc-CCDC33-1∶1相對(duì)表達(dá)量。lnc-CCDC33-1∶1引物為：F 5’-AAGGCTCAGT GTGAGACCAG-3’，R 5’-GGACTAGGGAATGCTGTGACC-3’，GAPDH引物為：F 5’-GGCCAATCCTGAATCACACCT-3’，R 5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用GraphPad Prism 6、SPSS22 及R 4.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。計(jì)量資料以±s表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例和率表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析lnc-CCDC33-1∶1對(duì)PTC的診斷價(jià)值。應(yīng)用單因素Logistic回歸分析lnc-CCDC33-1∶1表達(dá)量和相關(guān)臨床特征（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯）之間的關(guān)系，其中性別和年齡作為協(xié)變量，lnc-CCDC33-1∶1作為自變量，相關(guān)臨床特征作為因變量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中的表達(dá) qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中的表達(dá)量升高（P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 lnc-CCDC33-1∶1在PTC和癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)水平

2.2 lnc-CCDC33-1∶1對(duì)PTC的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示曲線下面積（area under the curve,AUC）為0.803（95%CI=0.736～0.869，P＜0.001），以相對(duì)表達(dá)量0.016作為截點(diǎn)值，Youden指數(shù)、敏感度和特異度分別為0.558、81.7%和74.2%，見(jiàn)圖2。

圖2 lnc-CCDC33-1∶1診斷PTC的ROC曲線

2.3 本地隊(duì)列中l(wèi)nc-CCDC33-1∶1與PTC臨床病理因素的相關(guān)性 根據(jù)lnc-CCDC33-1∶1中位表達(dá)值，將本地隊(duì)列中的PTC患者分為lnc-CCDC33-1∶1高表達(dá)組和低表達(dá)組，本地隊(duì)列顯示lnc-CCDC33-1∶1表達(dá)水平與PTC腫瘤大?。≒=0.048）、腺外侵犯（P=0.011）、T分期（P=0.007）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.003）相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 PTC中l(wèi)nc-CCDC33-1∶1表達(dá)和臨床病理的相關(guān)性（本地隊(duì)列，每組n=60）

2.4 TCGA中l(wèi)nc-CCDC33-1∶1與PTC臨床病理因素的相關(guān)性 在TCGA數(shù)據(jù)隊(duì)列中，根據(jù)其502例PTC樣本的lnc-CCDC33-1∶1中位表達(dá)值，將TCGA組PTC患者分為lnc-CCDC33-1∶1高表達(dá)組和低表達(dá)組，TCGA組數(shù)據(jù)顯示lnc-CCDC33-1∶1表達(dá)水平與PTC甲狀腺外侵犯（P=0.028）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001），見(jiàn)表2。

表2 PTC中l(wèi)nc-CCDC33-1∶1表達(dá)和臨床病理的相關(guān)性（TCGA）

2.5 Logistic回歸分析lnc-CCDC33-1∶1與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及甲狀腺外侵犯的相關(guān)性 本地隊(duì)列的單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，lnc-CCDC33-1∶1高表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)為lnc-CCDC33-1∶1低表達(dá)組的77.42倍（OR=77.42，95%CI=39.74～115.11，P＜0.001），而lnc-CCDC33-1表達(dá)高低不影響PTC甲狀腺外侵犯的風(fēng)險(xiǎn)（P=0.143）。

3 討論

PTC通常是一種預(yù)后良好、進(jìn)展緩慢的腫瘤，一般通過(guò)手術(shù)或聯(lián)合放射碘、促甲狀腺激素（tyroidstimulating hormone,TSH）抑制等治療均能達(dá)到很好控制。但是某些高危特征，如高齡、腫瘤大小≥3 cm、甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和BRAF突變等與其不良預(yù)后相關(guān)[10]。盡管術(shù)前可通過(guò)超聲或CT等影像學(xué)方式判斷PTC外侵、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，但這些手段的預(yù)測(cè)價(jià)值有一定的局限性[3]。因此，利用新的分子標(biāo)志物來(lái)早期預(yù)測(cè)或輔助鑒別PTC高危特征，可能對(duì)制定PTC的治療方案和治療后的臨床轉(zhuǎn)歸有重要意義。

分子標(biāo)志物已被廣泛運(yùn)用于多種疾病的輔助診斷和預(yù)后評(píng)估[11]。在甲狀腺癌中，許多分子標(biāo)志物，如BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ、galectin-3等，已被證實(shí)對(duì)術(shù)前性質(zhì)不明確的甲狀腺結(jié)節(jié)具有輔助診斷作用[12]。除mRNA和蛋白質(zhì)等分子標(biāo)志物外，還有許多microRNAs，如miR-146b、miR-221、miR-222、和miR-135b被發(fā)現(xiàn)與PTC腺外侵犯、進(jìn)展期分期、BRAF突變等不良臨床病理特征相關(guān)[13]。正如美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)指南所推薦的，當(dāng)細(xì)胞穿刺也不能明確某些甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷時(shí)，可應(yīng)用這些分子標(biāo)志物協(xié)助診斷[3]。最近的研究顯示lncRNA對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用[14-16]。在PTC中有研究顯示lncRNA發(fā)揮著一定作用，例如YOON等[5]發(fā)現(xiàn)lncRNA NAMA在BRAF突變的PTC中表達(dá)降低，并與腫瘤的生長(zhǎng)阻滯相關(guān)；JENDRZEJEWSKI等[7]發(fā)現(xiàn)SNP rs944289的患者更易發(fā)生PTC，其作用發(fā)揮與lncRNA PTCSC3相關(guān)。PTCSC3則具有抑癌作用，同時(shí)PTCSC3是miR-574-5p的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，PTCSC3可能通過(guò)調(diào)控miR-574-5p的含量來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)其靶基因而發(fā)揮作用[17]。因此，lncRNA也有望成為甲狀腺癌的分子標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)lnc-CCDC33-1∶1在PTC組織中表達(dá)升高，并經(jīng)ROC曲線證實(shí)其具有較高的診斷價(jià)值。如果將lnc-CCDC33-1∶1與其他分子標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于穿刺細(xì)胞學(xué)不能明確診斷的甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性判斷，可能有助于優(yōu)化甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷與管理。同時(shí)本研究分析lnc-CCDC33-1∶1的表達(dá)量與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)lnc-CCDC33-1∶1與PTC腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等高危特征相關(guān)，為進(jìn)一步的功能及機(jī)制研究建立了基礎(chǔ)。另外，僅有的一項(xiàng)研究指出，lnc-CCDC33似乎和腫瘤特征性分類有關(guān)，例如在胰腺癌中，lnc-CCDC33是糖尿病胰腺癌的特征性基因。而lnc-CCDC33-1∶1作為lnc-CCDC33基因下游非編碼區(qū)域的lncRNA，可能在甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)一步臨床亞群分組中具有一定的意義[18]。近年來(lái)，非編碼RNA（ncRNA）被揭示能編碼轉(zhuǎn)錄小肽分子，代替ncRNA本體發(fā)揮腫瘤調(diào)節(jié)作用。例如在結(jié)腸癌中，lncRNA HOXB-AS3能夠編碼53個(gè)氨基酸的小肽，該小肽能夠通過(guò)抑制PKM介導(dǎo)的葡萄糖代謝重編，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[19]。這說(shuō)明，有可能存在lnc-CCDC33-1∶1編碼小肽的可能，并借此調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

然而，本研究尚存在一些不足。通過(guò)矯正年齡、性別、組織類型和BRAF V600E突變等因素后，發(fā)現(xiàn)lnc-CCDC33-1∶1的表達(dá)量與PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和包膜外侵犯分風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。這意味著，在不同的年齡、性別、組織學(xué)類型和基因表達(dá)背景的亞組PTC人群中，lnc-CCDC33-1∶1對(duì)臨床病理特征具有不同的影響。另外，研究發(fā)現(xiàn)本地隊(duì)列數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)存在差異結(jié)果，即lnc-CCDC33-1∶1對(duì)腫瘤大小、腫瘤分期的影響存在差異性。上述的差異可能是不同隊(duì)列的年齡構(gòu)成比差異、種族差異、病例研究年限等因素所致。盡管如此，兩組隊(duì)列均指出lnc-CCDC33-1∶1高表達(dá)提高了甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和包膜侵犯風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，lnc-CCDC33-1∶1在PTC中表達(dá)異常升高，并與PTC高危特征相關(guān)。lnc-CCDC33-1∶1有望成為潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但是lnc-CCDC33-1∶1在不同人群中可能存在不同的臨床意義，進(jìn)一步揭示其在PTC中的具體作用需要擴(kuò)大臨床樣本。與此同時(shí)，lnc-CCDC33-1∶1調(diào)節(jié)甲狀腺侵襲性的分子機(jī)制也需要進(jìn)一步探索。本研究為甲狀腺癌乳頭狀癌的臨床評(píng)估提供新的參考指標(biāo)，同時(shí)為癌進(jìn)展提供新的分子研究靶點(diǎn)。