新型小分子化合物cyy-287聯(lián)合CDK抑制劑roscovitine抑制SBC-2細胞生長的機制

鄭淑文，黃慧靜，陳國，麻浩群，錢建暢，張倩雯

溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035

小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）是肺癌中惡性程度較高的類型，約占所有肺癌病例的15%，具有極高的增殖率、強烈的早期轉移傾向和不良預后，患者5年平均生存率不超過10%[1-2]。目前，以鉑類和依托泊苷為基礎的化療仍是SCLC一線標準治療方案，盡管大部分患者在化療初期應答良好，但大多會在一年內(nèi)出現(xiàn)耐藥復發(fā)，臨床亟需新的治療藥物和干預策略。cyy-287為本課題組新合成的嘧啶-2，4-二胺衍生物（見圖1），為小分子多靶點激酶抑制劑，前期研究發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤中有良好的抗腫瘤活性[3]。另通過藥代動力學實驗發(fā)現(xiàn)cyy-287在肺組織中選擇性較高，且在EGFR突變非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中具有良好的抗腫瘤活性，顯著抑制其在體內(nèi)外的生長、遷移并逆轉上皮間質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[4]。本研究探索了cyy-287與細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinase,CDK）抑制劑roscovitine聯(lián)用對SCLC的抑制作用，以期為SCLC的臨床治療提供新的方案。

圖1 cyy-287的化學結構式

1 材料和方法

1.1 材料 SBC-2細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。cyy-287由本實驗室自行合成，純度≥98%，并通過1H NMR、13C NMR、電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）和高分辨率質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry,HRMS）等方法驗證其結構。順鉑（dichlorodiammineplatinum,DDP）、ABT-199和roscovitine購自美國APExBIO公司，MTS試劑購自美國Promega公司，碘化丙啶染料購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。CL-PARP、P-AKT、AKT和GAPDH抗體從美國CST公司購買。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制：精密稱取適量的cyy-287、多西他賽、BCL-2抑制劑ABT-199和roscovitine樣品，加入一定體積的二甲基亞砜（DMSO），制備濃度為20 mmol/L的儲備液。精密稱取適量的DDP樣品，加入一定體積的ddH2O，制備濃度為3 mmol/L的儲備液。渦旋混合均勻后分裝，保存于-80 ℃冰箱備用，并于使用前稀釋。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：SBC-2 細胞使用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（加入10%的FBS，含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉），置于37 ℃，5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞擴增速率確定傳代倍數(shù)。

1.2.3 實驗分組：SBC-2細胞分為DMSO（對照）組、roscovitine（20 μmol/L）組、cyy-287組（1.5 μmol/L）和cyy-287（1.5 μmol/L）+roscovitine（20 μmol/L）組。

1.2.4 細胞活力測定和藥物聯(lián)合指數(shù)（combination index,CI）：將細胞接種在96孔板（5%～10%密度）中，并用不同濃度的cyy-287和DDP（60、20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.027 μmol/L）處理48 h后，棄掉上清液，每孔加入100 μL MTS工作液，將細胞培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1～2 h。待顏色達到合適深度，用酶標儀檢測490 nm處吸光度（A）值。細胞相對活力（%）=（加藥組細胞A均值-空白對照組A均值）/（陰性對照組A均值-空白對照組A均值）×100%。為了獲得CI，操作同上，另增加多西他賽（docetaxel,DTX）、BCL-2抑制劑ABT-199和roscovitine單用組，以及分別和cyy-287 的合用組（比例為1∶1）。選取5個濃度（2.220、0.740、0.250、0.082、0.027 μmol/L）進行CI計算，并使用Compusyn軟件分析CI，當CI＜1時表明協(xié)同作用，當CI＞1時表明拮抗作用。

1.2.5 克隆形成實驗：將細胞以800個/孔的密度接種在12孔板中，然后用不同濃度的藥物處理8 d。細胞集落用4%多聚甲醛固定20 min，用0.5%結晶紫溶液（購自美國Sigma公司）染色30 min。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡：將細胞接種在6孔板（20%～25%密度）中，并用不同藥物處理24 h。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡比例。對于細胞周期，首先收集細胞并在4 ℃下用70%乙醇固定24 h。使用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌兩次后加入碘化丙啶（propidium iodide,PI,50 μg/mL）室溫避光染色10 min。使用BD-FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）檢測并分析細胞周期分布和細胞凋亡比例。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達：將細胞接種在12孔板（20%～25%密度）中，并用不同藥物處理24 h。使用NuPAGE LDS裂解緩沖液（購自美國Invitrogen公司）收集蛋白樣品，并進行免疫印跡檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用±s表示；多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 cyy-287對SCLC細胞SBC-2生長的作用 以DDP為陽性對照，通過MTS實驗發(fā)現(xiàn)cyy-287對SBC-2細胞的IC50為（1.77±0.10）μmol/L，與DDP的IC50值（1.47±0.26）μmol/L相近（見圖2A）。細胞凋亡檢測結果表明，與DMSO組比，梯度濃度的cyy-287雖然可以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，但比例均小于15%；而在同等濃度（3 μmol/L）下，單獨使用cyy-287（14.88%）或DDP（10.3%）的凋亡細胞比例相近（見圖2B）。這表明cyy-287對SBC-2細胞的生長抑制作用相對較差，與DDP對SCLC的抗腫瘤效果相當。

圖2 cyy-287對SBC-2細胞的抑制作用

2.2 cyy-287與roscovitine的協(xié)同效應 通過分析CI，發(fā)現(xiàn)cyy-287與常用的抗肺癌化療藥物DTX和BCL-2抑制劑ABT-199等并不存在協(xié)同抗腫瘤作用，但cyy-287與CDK抑制劑roscovitine合用的CI＜1，提示兩者間存在協(xié)同效應（見圖3）。

圖3 cyy-287與roscovitine協(xié)同效應CI值圖

2.3 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞增殖的影響 通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，與cyy-287組比，cyy-287+roscovitine組可顯著抑制SBC-2細胞的克隆形成，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。表明cyy-287 與roscovitine聯(lián)用確實可以有效抑制SBC-2的增殖。

圖4 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞增殖的影響

2.4 cyy-287 與roscovitine聯(lián)用對SBC-2 細胞周期的影響 通過流式細胞術分析了cyy-287 與roscovitine單用或聯(lián)用對SBC-2細胞周期的影響，與DMSO組比，roscovitine組和cyy-287組輕度增加G2/M期細胞，而cyy-287+roscovitine組顯著增加G2/M期細胞，S期細胞減少，見圖5；提示cyy-287與roscovitine聯(lián)用可誘導SBC-2細胞周期阻滯在G2/M期。

圖5 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞周期分布的影響

2.5 cyy-287與roscovitine聯(lián)用誘導SBC-2細胞凋亡情況 通過流式細胞術檢測cyy-287與roscovitine單用或聯(lián)用對SBC-2細胞凋亡的影響，與DMSO組比，roscovitine組和cyy-287 組SBC-2 細胞發(fā)生凋亡的較少，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而roscovitine+cyy-287組凋亡的SBC-2細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖6。提示cyy-287與roscovitine聯(lián)用可顯著誘導SBC-2細胞發(fā)生凋亡。

圖6 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞凋亡的影響

2.6 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞AKT活化的影響 與cyy-287組比，cyy-287+roscovitine組SBC-2細胞凋亡相關蛋白CL-PARP的表達明顯增加（P＜0.05）；與roscovitine組比，cyy-287+roscovitine組AKT的磷酸化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖7。這提示cyy-287主要通過抑制AKT的活化，從而與roscovitine發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用，抑制SBC-2細胞的存活，并誘導其發(fā)生凋亡。

圖7 cyy-287與roscovitine聯(lián)用對SBC-2細胞CL-PARP蛋白表達和AKT磷酸化的影響

3 討論

約70%的SCLC患者在確診時就已出現(xiàn)胸腔以外的轉移，也稱廣泛期SCLC，該類患者中位生存時間僅為8～13個月，5年生存率不到2%[5-6]。然而，SCLC的生物分型尚不成熟，盡管經(jīng)過了30多年的努力和探索，SCLC臨床治療的研究進展依舊十分有限。SCLC的靶向治療僅有我國原研的小分子多靶點抗血管藥物安羅替尼獲批用于進展或復發(fā)SCLC患者的三線治療[7-8]。雖然免疫抑制劑如阿特珠單抗等與傳統(tǒng)化療藥物相關的聯(lián)合治療方案已成為廣泛期SCLC的一線治療標準之一，但與其他實體瘤比，阻斷PD-1對SCLC患者生存率的總體改善并不明顯，僅有少數(shù)患者在免疫治療中獲益[9-11]。因此，臨床亟需尋找SCLC治療的新策略，開發(fā)出新的可用于臨床替代的治療藥物。

cyy-287作為一種新型的可口服的抗腫瘤小分子抑制劑[3]，雖然在骨肉瘤和NSCLC中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，但本研究發(fā)現(xiàn)其對SBC-2細胞的體外抑制效果僅與DDP相當，對SCLC細胞的生長增殖抑制作用有限，提示單獨使用cyy-287可能無法有效抑制SCLC生長。SCLC作為一種高侵襲性的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其臨床治療往往采用聯(lián)合用藥的手段[12]。因此，嘗試通過聯(lián)合用藥篩選，探索新的可用于抑制SCLC的干預手段，結果發(fā)現(xiàn)CDK抑制劑roscovitine與cyy-287具有協(xié)同的抗腫瘤效應，而活性研究結果也顯示，兩藥聯(lián)合可有效抑制SBC-2細胞的增殖，使其細胞周期阻滯在G2/M期，并誘導細胞出現(xiàn)明顯的凋亡。這些研究結果表明兩者聯(lián)合對SBC-2細胞具有良好的體外抑制效果。

細胞周期失調(diào)是腫瘤的重要特征之一，而CDK對細胞周期的調(diào)控起著至關重要的作用。目前，已有超過40多種CDK抑制劑用于抗腫瘤藥物研發(fā)，其中roscovitine作為多靶點的CDK抑制劑，廣泛用于基礎研究和疾病研究[13]。roscovitine主要通過直接競爭ATP結合位點抑制CDK，它能夠有效抑制CDK1、CDK2、CDK5和CDK7，但對CDK4和CDK6的抑制效果較差[14]。作為一種可口服的小分子CDK抑制劑，roscovitine在包括骨肉瘤[15]、多發(fā)性骨髓瘤[16]和前列腺癌[17]等多種惡性腫瘤中發(fā)揮較好的抗腫瘤活性。同時，通過單一療法或聯(lián)合療法，roscovitine也在NSCLC、鼻咽癌和轉移性乳腺癌中開展II期臨床試驗研究[18]。一系列的研究表明，該藥可以做為腫瘤治療的潛在藥物。但本研究結果表明roscovitine對SBC-2細胞的抑制效果十分有限，并不能有效抑制腫瘤細胞的增殖，或誘導細胞凋亡；說明單獨使用roscovitine對SCLC抗腫瘤作用并不明顯。

本研究結果表明，通過將cyy287與roscovitine相結合不僅能夠顯著抑制SBC-2的克隆形成，還可以明顯增加凋亡細胞的比例，提示兩者具有良好的協(xié)同抗腫瘤作用。兩者均為可口服的小分子化合物，后續(xù)如果有類似化合物進入臨床研究，通過將兩類藥物聯(lián)合，或許會發(fā)揮出更好的抗腫瘤活性，有可能成為SCLC治療的潛在方案。