羊傳染性膿皰滅活疫苗的制備及臨床免疫效果觀察

李璋赟，汪 萍，金映紅，薛 晶，汪 陽，陳古麗，夏 俊*

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830000）

羊傳染性膿皰（contagiousecthyma）俗稱羊口瘡（orf）、羊傳染性膿皰皮炎（contagiouspustular dermatitis，CPD），是由羊傳染性膿皰病毒引起的人畜共患病。該病主要引起羔羊口唇等部位的皮膚、黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍及疣狀厚痂[1]。

目前還沒有商用疫苗能夠完全預(yù)防羊傳染性膿皰病毒感染。弱毒疫苗進(jìn)行皮膚劃痕免疫能夠預(yù)防羊傳染性膿皰病毒感染[2]，但存在免疫方法繁瑣、保護(hù)期短的缺陷，在基層難以推廣使用。使用滅活疫苗對(duì)產(chǎn)前孕羊進(jìn)行免疫，羔羊可通過初乳獲得抗體[3]產(chǎn)生對(duì)羊傳染性膿皰的抵抗力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

羔羊睪丸細(xì)胞取自20日齡雄性羔羊睪丸；病毒為新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存的羊傳染性膿皰強(qiáng)毒株。

1.2 試劑與儀器

1.3 羔羊睪丸細(xì)胞的制備

制備細(xì)胞前配置細(xì)胞生長(zhǎng)液，500 mL MEM培養(yǎng)基中加入50 mL胎牛血清和10 mL青霉素-鏈霉素溶液，混勻置4℃?zhèn)溆谩?/p>

無菌采集20日齡雄性羔羊睪丸，用無菌剪刀和鑷子剝離睪丸外部組織，并用MEM沖洗2～3次；將清洗完畢的睪丸組織剪碎，稱重，置入無菌錐形瓶?jī)?nèi)；按凈重的4倍加入0.25%胰酶消化液，置4℃冰箱消化12 h，待組織表面呈絨毛狀，棄消化液，用玻璃珠振搖加入細(xì)胞生長(zhǎng)液收集細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液用4層紗布過濾后1 000 rpm離心5 min，棄去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后將細(xì)胞懸液以適宜濃度培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃培養(yǎng)2～3 d即獲得羔羊睪丸原代細(xì)胞。

1.4 接種病毒

接種病毒前需配置維持液，在500 mL MEM培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清和10 mL青霉素-鏈霉素溶液，混勻置4℃?zhèn)溆谩?/p>

取已生長(zhǎng)至細(xì)胞瓶底70%的羔羊睪丸細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用加入10 mL青霉素-鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2～3次。以5%的濃度接種羊傳染性膿皰病毒，置37℃培養(yǎng)箱吸附1 h，后加入維持液，約24 h出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%時(shí)收毒，于-20℃室溫反復(fù)凍融3次。

1.5 超濾膜包大小的選擇及病毒液的濃縮

超濾膜的選擇原則是超濾膜的孔徑要小于待濃縮蛋白分子直徑，一般為目標(biāo)蛋白分子直徑的1/5～1/3[4]，為減少傳染性膿皰病毒分子損失，選擇使用100 KD超濾膜。

將大量培養(yǎng)的羊傳染性膿皰病毒液用超濾膜進(jìn)行10倍濃縮。將待濃縮病毒液離心后取上清液混勻，將膜包及進(jìn)液管、出液管和濾出管安裝完畢并與蠕動(dòng)泵連接完全。打開蠕動(dòng)泵，速度調(diào)整為200～300 mL/min。將待測(cè)病毒液濃縮至10倍時(shí)，將進(jìn)液管從待測(cè)濃縮病毒液中取出，超濾膜包內(nèi)所有液體泵入收集杯內(nèi)時(shí)，關(guān)閉蠕動(dòng)泵，收集杯內(nèi)病毒液即為濃縮完畢的10倍濃縮病毒液。

1.6 測(cè)定病毒毒力

將正常羔羊睪丸細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加入少量胰酶清洗細(xì)胞2～3次，棄去液體后再加入胰酶溶液進(jìn)行細(xì)胞消化，待培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞由透明變?yōu)槊Ａ訒r(shí)棄去胰酶，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，將羔羊睪丸細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上搖下，加入少量細(xì)胞培養(yǎng)液終止胰酶反應(yīng)，用移液器多次吹打細(xì)胞懸液，將細(xì)胞團(tuán)塊吹散。將細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，輕輕搖晃96孔板，使細(xì)胞均勻分布于96孔板。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。收獲的病毒原液和10倍濃縮病毒液用維持液做10倍梯度稀釋，取8個(gè)梯度各100μL加到96孔板內(nèi)，同時(shí)設(shè)定只加入維持液100μL的孔作為陰性對(duì)照，加入100μL病毒原液的孔為陽性對(duì)照。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，并記錄每個(gè)細(xì)胞病變孔出現(xiàn)的時(shí)間及稀釋的濃度，用Reed-Muench法計(jì)算病毒液TCID50[5]。

1.7 制備傳染性膿皰滅活疫苗

1.7.1 10倍濃縮病毒液的滅活

取濃縮后病毒液，按體積比為1∶4 000比例加入β-丙內(nèi)酯滅活，4℃作用24 h，每隔3 h顛倒搖動(dòng)一次，24 h后病毒液置37℃水浴2 h脫毒。取少量已滅活的羊口瘡病毒液樣品，接種于羔羊睪丸原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞，觀察羊睪丸原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞是否發(fā)生病變來判斷病毒液是否滅活完全。

1.7.2 滅活病毒液的乳化及相關(guān)檢驗(yàn)

取已滅活的病毒液與法國(guó)206佐劑以1:1的比例混合，使用磁力攪拌棒以300 r/min的速度將其攪拌均勻。穩(wěn)定性檢驗(yàn)，取10 mL已乳化的疫苗加到15 mL離心管中，3 000 r/min，15 min，若無分層則可保存一年。黏度檢驗(yàn)，取內(nèi)口直徑為1.2 mm的吸管，在室溫下吸滿1 mL乳劑，垂直放出0.4 mL所需時(shí)間作為黏度單位，若流出時(shí)間為2～6 s即為合格。將已乳化好的疫苗以接種病毒的方式接種到羔羊睪丸細(xì)胞上，若無細(xì)胞病變即疫苗安全。

1.8 免疫程序

免疫試驗(yàn)羊場(chǎng)為常發(fā)羊傳染性膿皰羊場(chǎng)，未免疫羔羊在出生后15～30 d自然條件下發(fā)病率100%。

1.8.1 孕羊免疫程序

選取產(chǎn)前30 d體況良好的孕羊60只，分為A、B、C三組，每組孕羊20只，A組孕羊于產(chǎn)前28 d免疫一次，產(chǎn)前14 d免疫第二次，兩次免疫均為3 mL/只。B組孕羊于產(chǎn)前28 d免疫一次，不進(jìn)行二次免疫。C組為空白對(duì)照組，不進(jìn)行免疫。

1.8.2 羔羊免疫程序

A、B、C三組孕羊產(chǎn)出的羔羊均分為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3九組，A1、B1、C1組羔羊分別于出生1 d和14 d注射羊傳染性膿皰滅活疫苗兩次，均為肌內(nèi)注射2 mL/只。A2、B2、C2組羔羊于出生1 d進(jìn)行一次免疫，2 mL/只。C1、C2、C3組羔羊出生后不做處理。觀察羔羊免疫后60 d內(nèi)的發(fā)病情況并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊睪丸細(xì)胞

制備的羔羊睪丸原代細(xì)胞24 h后有細(xì)胞貼壁，有明顯圓形高透光懸浮細(xì)胞，部分細(xì)胞出芽明顯。培養(yǎng)至48 h時(shí)細(xì)胞呈三角形。培養(yǎng)至72 h時(shí)細(xì)胞鋪滿T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶底面，細(xì)胞界限清晰，細(xì)胞呈條索狀，部分細(xì)胞可見明顯漩渦狀。見圖1。

圖1 正常羔羊睪丸原代細(xì)胞

2.2 細(xì)胞病變結(jié)果

羔羊睪丸原代細(xì)胞接種羊傳染性膿皰病毒24 h后細(xì)胞邊界模糊；48 h細(xì)胞核質(zhì)顏色加深，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓，無明顯漩渦狀；72 h時(shí)細(xì)胞大量脫落，無明顯細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞漩渦狀完全消失不見，細(xì)胞聚集似葡萄。見圖2。

圖2 接種羊傳染性膿皰病毒的羔羊睪丸細(xì)胞

2.3 TCID50結(jié)果

根據(jù)表1、表2統(tǒng)計(jì)，可計(jì)算出羊傳染性膿皰病毒液TCID50效價(jià)為106.3TCID50/0.1 mL，10倍濃縮羊傳染性膿皰病毒液TCID50效價(jià)為107.5TCID50/0.1 mL。

表1 羊傳染性膿皰病毒液TCID50測(cè)定結(jié)果

表2 10倍濃縮后的羊傳染性膿皰病毒液TCID50測(cè)定結(jié)果

2.4 制備滅活疫苗結(jié)果

2.4.1 病毒液的滅活結(jié)果

10倍濃縮羊傳染性膿皰病毒液滅活后接種羔羊睪丸細(xì)胞和Vero細(xì)胞并盲傳三代，無細(xì)胞病變產(chǎn)生，證明病毒液滅活、脫毒完全。見圖3、圖4。

圖3 滅活病毒液接種羔羊睪丸細(xì)胞

圖4 滅活病毒液接種Vero細(xì)胞

2.4.2 滅活疫苗的乳化

乳化后疫苗經(jīng)檢測(cè)均為合格。

2.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)免疫程序進(jìn)行滅活疫苗免疫后，對(duì)自然感染狀態(tài)下的免疫組羔羊和對(duì)照組羔羊的發(fā)病率及發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。免疫組羔羊口唇部未見膿皰、痂皮等典型病變，如圖5。發(fā)病羔羊口唇部有痂皮產(chǎn)生，口腔內(nèi)有潰瘍，如圖6。試驗(yàn)結(jié)果證明本次制備的傳染性膿皰滅活疫苗在正確免疫程序下能對(duì)羔羊產(chǎn)生保護(hù)力。

表3 羔羊發(fā)病情況

圖5 免疫組未發(fā)病羔羊

圖6 未免疫組發(fā)病羔羊

3 討 論

超濾技術(shù)是以特制超濾膜質(zhì)材料為分離介質(zhì)，利用濾膜的篩分性能。以超濾膜兩側(cè)壓差作為推動(dòng)力，在把提取液從濾膜高壓一側(cè)推至低壓一側(cè)過程中，將直徑大于濾膜孔徑的分子截流在高壓一側(cè)，從而克服了濾膜經(jīng)常被堵塞的問題。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)濃縮前后病毒液TCID50的檢測(cè)可證明超濾膜濃縮對(duì)提高病毒效價(jià)效果明顯。

本實(shí)驗(yàn)中采了1∶4 000β-丙內(nèi)酯作為滅活劑進(jìn)行滅活，β-丙內(nèi)酯作為滅活劑可以直接作用于病毒核酸，而不作用于殼蛋白，不會(huì)破壞病毒的免疫原性；而且β-丙內(nèi)酯極易水解，37℃作用2 h即可水解為無毒性的代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸[6]。

羊傳染性膿皰病流行于世界各地，主要影響綿羊和山羊，幼齡動(dòng)物多因口腔病變?cè)斐傻睦^發(fā)感染而致嚴(yán)重死亡，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成一定的損失[7]。疫苗接種免疫是預(yù)防該病的最簡(jiǎn)便有效的解決方式。羊傳染性膿皰滅活疫苗在1975年由L‘Haridon等已經(jīng)證明了羔羊可以受血清抗體或母乳的保護(hù)。1978年C.LE JAN等人進(jìn)行了關(guān)于預(yù)防羊傳染性膿皰病時(shí)改變接種時(shí)間對(duì)哺乳期羊群初乳中免疫球蛋白有無影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明：在母羊懷孕期將進(jìn)行免疫，初乳中免疫球蛋白對(duì)羔羊的保護(hù)可以持續(xù)3～4周并建議在自然哺乳的狀況下進(jìn)行疫苗接種以保護(hù)羔羊[8]。2014年李娜用0.4%甲醛滅活傳染性膿皰病毒48 h后混合201佐劑和11R佐劑對(duì)2～3月齡羔羊進(jìn)行皮下注射免疫，對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果證明201佐劑保護(hù)率67%，11R佐劑保護(hù)率50%，對(duì)照組全部發(fā)病[9]。2018年李星明采用0.4%甲醛滅活傳染性膿皰病毒后混合轉(zhuǎn)移因子鋁膠鹽佐劑對(duì)孕羊進(jìn)行頸部皮下注射可以降低孕羊傳染性膿皰病原的攜帶率，新生羔羊的病原攜帶率降低，對(duì)新生羔羊有一定的保護(hù)作用[10]。羊傳染性膿皰病毒能夠引起宿主強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，但由于病毒中一些毒力因子和免疫調(diào)節(jié)基因的存在，使該病毒能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行免疫調(diào)節(jié)進(jìn)而發(fā)生免疫逃避[11]。

本實(shí)驗(yàn)中制備的滅活疫苗采用了簡(jiǎn)單安全的肌內(nèi)注射，免疫接種結(jié)果顯示對(duì)孕羊進(jìn)行肌肉注射也可對(duì)羔羊產(chǎn)生有效的保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

采用切向流超濾膜系統(tǒng)可有效提高病毒液效價(jià)，1∶1混合206佐劑制備的羊傳染性膿皰滅活疫苗對(duì)羔羊有明顯保護(hù)作用。