丙酮醛改性對麥醇溶蛋白功能特性及結(jié)構(gòu)的影響

楊土娣，張烘焜，龐鑫鑫，陳展鵬，楊容，鄭文宇，吳曉梅，曾新安，3，廖蘭*

（1.廣東省食品智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528225；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640）

小麥?zhǔn)俏覈庸っ娣鄣脑希饕糜谏a(chǎn)面條、饅頭、餅干和蛋糕。小麥面筋蛋白是生產(chǎn)小麥淀粉的副產(chǎn)品[1]，其氨基酸組成比較完整，是營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源。麥醇溶蛋白（gliadin，Gli）占總面筋蛋白的40%～50%，根據(jù)酸性條件下的電泳遷移率，醇溶蛋白可分為 α-型、β-型、γ-型和 ω-型，分別占總量的25%、30%、30%和15%[2]。糖和蛋白質(zhì)是各種小麥制品中最常見的成分，因此，糖基化反應(yīng)（美拉德反應(yīng)）在食品加工過程中廣泛發(fā)生，從而影響產(chǎn)品的色、香、質(zhì)和保質(zhì)期[3-4]。熱加工過程中的糖基化反應(yīng)會(huì)提高蛋白質(zhì)組分的熱穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性和溶解性[5-6]，表明糖基化反應(yīng)可有效改善食品質(zhì)量。然而糖基化反應(yīng)除改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)外，還會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，不利于保障食品安全[7]。

小麥產(chǎn)品在熱加工過程中會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生α-二羰基化合物。α-二羰基化合物的生成主要發(fā)生在美拉德反應(yīng)的中間階段，同時(shí)它也可由食品體系中碳水化合物的焦糖化或氧化產(chǎn)生[8]。在美拉德反應(yīng)中，醛基與游離氨基反應(yīng)形成席夫堿，然后重排形成可逆的阿馬道里產(chǎn)物，經(jīng)過氧化、脫水、還原等一系列反應(yīng)，化學(xué)重排、縮合產(chǎn)生大量晚期糖基化終末產(chǎn)物。α-二羰基化合物作為高活性晚期糖基化中間產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和精氨酸殘基迅速反應(yīng)，產(chǎn)生羧甲基賴氨酸[Nε-（carboxymethyl）lysine，CML]、羧乙基賴氨酸[Nε-（carboxyethyl）lysine，CEL]、乙二醛基二聚賴氨酸（glyoxal derivedlysinedimer，GOLD）、丙酮醛基二聚賴氨酸（methylglyoxalderivedlysinedimer，MOLD）等晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）。

AGEs是葡萄糖或其他還原糖與脂類、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)生成的一系列復(fù)雜的共價(jià)加合物[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可與人體組織蛋白結(jié)合改變組織蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，也可與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGEs）發(fā)生特異性的結(jié)合導(dǎo)致炎癥，從而危害人體健康。因此，對于控制小麥制品熱加工過程中糖基反應(yīng)形成的AGEs生成量的研究引起了廣泛的關(guān)注。

美拉德反應(yīng)過程的每個(gè)步驟幾乎都是可逆和開放的，因此糖基化蛋白質(zhì)中的糖基化結(jié)構(gòu)類型很復(fù)雜。以還原糖為原料制備糖基化蛋白，系統(tǒng)產(chǎn)物復(fù)雜，不能很好地反映α-二羰基化合物與蛋白質(zhì)的相互作用。因此，本文以AGEs的重要前體——α-二羰基化合物[丙酮醛（methylglyoxal，MGO）]作為糖基化試劑，模擬小麥產(chǎn)品的熱加工條件，探究麥醇溶蛋白與不同丙酮醛添加量在不同糖化溫度和時(shí)間下，其游離氨基含量變化及AGEs生成的規(guī)律，通過分析糖化蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能特性的變化，揭示AGEs的生成機(jī)理，對小麥制品熱加工過程中控制AGEs的生成量及提高熱加工小麥制品的質(zhì)量、營養(yǎng)和安全性具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥醇溶蛋白（98%）：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院廣東省食品智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制；MGO（40%水溶液）：上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；石油醚、無水乙醇：天津市百世化工有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、尿素、考馬斯亮藍(lán)R-250、鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、甘氨酸、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、考馬斯亮藍(lán) G-250：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：西隴科學(xué)股份有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；鄰苯二甲醛：上海易匯生物科技有限公司；β-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，β-ME）：上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：美國Sigma公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；5，5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器（ZNCL-BS）：河南愛博特科技發(fā)展有限公司；高速冷凍離心機(jī)（TGL-20MB）：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，pH計(jì)（PHS-3E）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子分析天平（JA2003）：寧波市華豐儀器廠；冷凍干燥機(jī)（Scientz-30N）：上海泰坦科技股份有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（EU-2600A）：上海昂拉儀器有限公司；高速剪切機(jī)（BRT）：安徽博進(jìn)化工機(jī)械有限公司；油水浴鍋（WO-2L）：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-2700）：島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司；多功能酶標(biāo)儀（Thermo-Varioskan.Flash）：北京九宇金泰生物技術(shù)有限公司；電泳儀（DYCZ-24-DN）：北京六一儀器廠；傅里葉變換紅外光譜儀（SHIMADZU-IRT racer-100）：日本島津企業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麥醇溶蛋白及懸浮液的制備

參考文獻(xiàn)[10]的方法，稱取0.1 g麥醇溶蛋白，加入100 mL的50 mmol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖溶液，使用高速剪切機(jī)以10 000 r/min將麥醇溶蛋白懸浮液均質(zhì)化，以實(shí)現(xiàn)在緩沖液中的均勻分散。

1.3.2 游離氨基含量的測定

采用鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）法測定蛋白質(zhì)游離氨基含量[10]。OPA試劑配制：稱取40 mg鄰苯二甲醛，溶于25 mL 10 mmol/L四硼酸鈉，加入2.5 mL 20%SDS 和 100 μL β-巰基乙醇，用超純水定容至50 mL。將蛋白樣品液稀釋一定倍數(shù)，取1 mL蛋白液與2 mL OPA液混合后搖勻，50℃水浴5 min，冷卻至室溫（25℃～27℃），在波長340 nm處測定吸光度，游離氨基含量按下式計(jì)算，做3組平行。

游離氨基含量/%=（A-A0）/（B-B0）

式中：A為糖化蛋白液與OPA液反應(yīng)后在340 nm處的吸光度；A0為糖化蛋白液和緩沖溶液混合后在340 nm處的吸光度；B為未糖化蛋白液與OPA液反應(yīng)后在340 nm處的吸光度；B0為未糖化蛋白液和緩沖溶液混合后在340 nm處的吸光度。

1.3.3 熒光分光光度法檢測樣品中AGEs生成量

參考文獻(xiàn)[11]的方法，將糖化蛋白液稀釋一定倍數(shù)，控制熒光強(qiáng)度在1 000以下，在電壓700 V、激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm下進(jìn)行掃描，測定糖化蛋白的熒光強(qiáng)度，所有試樣做3組平行。

1.3.4 麥醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響因素分析

1.3.4.1 丙酮醛添加量的影響

取5 mL 1 mg/mL麥醇溶蛋白懸浮液于血清瓶中，分別加入不同添加量MGO（40%），使麥醇溶蛋白和MGO的質(zhì)量比分別為 1∶1、1 ∶2、1∶4、1∶6、1 ∶8、1 ∶10。然后將混合液于100℃油水浴鍋中加熱30 min，反應(yīng)結(jié)束后置于冰水浴中冷卻至室溫（25℃～27℃），分別按照1.3.2和1.3.3所述方法檢測游離氨基含量和AGEs生成量。將不含MGO的麥醇溶蛋白懸浮液于100℃油水浴鍋中加熱30 min作為對照。

1.3.4.2 糖化溫度的影響

取5 mL 1 mg/mL麥醇溶蛋白懸浮液于血清瓶中，加75 μL 40%MGO到懸浮液中，然后將混合液分別在80、100、120、140、160、180 ℃下加熱 30 min。將不含MGO的麥醇溶蛋白懸浮液作為對照。反應(yīng)結(jié)束后置于冰水浴中冷卻至室溫（25℃～27℃），分別按照1.3.2和1.3.3所述方法檢測游離氨基含量和AGEs生成量。

1.3.4.3 糖化時(shí)間的影響

取5mL1mg/mL麥醇溶蛋白懸浮液于血清瓶中，加75 μL 40%MGO到懸浮液中，使麥醇溶蛋白和MGO的質(zhì)量比為1∶6。然后將混合液在140℃油水浴鍋中分別加熱 15、30、45、60、75、90 min。用 pH7.0 的磷酸鹽緩沖溶液代替丙酮醛溶液作為對照。反應(yīng)結(jié)束后置于冰水浴中冷卻至室溫（25℃～27℃），分別按照1.3.2和1.3.3所述方法檢測游離氨基含量和AGEs生成量。

1.3.5 糖基化改性對麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

1.3.5.1 樣品的制備

根據(jù)1.3.4的結(jié)果，糖化蛋白的制備：取5 mL 1 mg/mL 原始麥醇溶蛋白（native-gliadin，N-Gli）懸浮液于血清瓶中，加75 μL 40%MGO到懸浮液中，使麥醇溶蛋白和MGO的質(zhì)量比為1∶6，然后將混合液在140℃油水浴鍋中加熱75 min，反應(yīng)結(jié)束于冰水浴中冷卻至室溫（25℃～27℃）后置于-10℃下保存；加熱麥醇溶蛋白（heated-gliadin，H-Gli）的制備：取5mL1mg/mL原始麥醇溶蛋白（native-gliadin，N-Gli）懸浮液于血清瓶中，加75 μL pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液代替丙酮醛溶液，其余操作同糖化蛋白的制備。

1.3.5.2 乳化性能測定

根據(jù)Bi等[12]的方法測定樣品乳化活力指數(shù)（emulsion capacity，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsion stability，ESI），準(zhǔn)確稱取一定量 N-Gli、H-Gli和 MGO-Gli樣品溶解于磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L、pH7.0）中，配制成蛋白濃度為3 mg/mL的樣品溶液。取9 mL蛋白溶液置于燒杯，加入3 mL大豆油，利用高速剪切機(jī)對溶液進(jìn)行均質(zhì)處理（19 000 r/min）1 min，然后從乳液底部取樣50 μL，于 10 mL預(yù)先配制的 SDS溶液（0.1%）中混合均勻，然后分別在0、30 min取樣，于500 nm波長處測定吸光度，空白液為SDS溶液，根據(jù)以下公式計(jì)算EAI、ESI。

EAI/（m2/g）=2×（2.303×A500）×N×10-4/（ΦLC）

式中：A500為樣品在500 nm處的吸光度；N為稀釋倍數(shù)；Φ為玉米油的體積分?jǐn)?shù)，0.25；L為比色池光徑，1 cm；C為蛋白濃度，3 mg/mL。

ESI/%=A0×Δt/（A0-A30）

式中：A0、A30為 0、30 min 時(shí)樣品于 500 nm 處的吸光度；Δt為時(shí)間差，30 min。

1.3.5.3 起泡性能測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法，將蛋白樣品溶于磷酸鹽緩沖液中，配制蛋白濃度為5 mg/mL的溶液，利用高速剪切機(jī)對溶液進(jìn)行均質(zhì)處理（19 000 r/min）1 min，分別準(zhǔn)確記錄蛋白溶液攪打后0、30 min時(shí)的泡沫體積高度，根據(jù)以下公式計(jì)算起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和起泡穩(wěn)定性（foaming stabitily，F(xiàn)S）。

FC/%=（V0-V）/V×100

FS/%=（V30-V）/（V0-V）×100

式中：V 為蛋白原液體積，mL；V0、V30為蛋白溶液經(jīng)高速均質(zhì)機(jī)攪打后0 min和30 min的體積，mL。

1.3.5.4 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳的測定

根據(jù)Xue等[14]方法并作修改，聚丙烯凝膠電泳試驗(yàn)對不同處理蛋白樣品蛋白亞基條帶進(jìn)行測定的具體操作：1）配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的分離膠和5%的濃縮膠；2）蛋白變性處理：取約2 mg蛋白樣品于2 mL離心管中，加入含有5%β-巰基乙醇、2%SDS、10%丙三醇和0.002%溴酚藍(lán)的Tris-HCl緩沖液（pH6.7、0.5mol/L），充分溶解配制成2mg/mL蛋白溶液，并置于沸水5 min；3）進(jìn)樣：將變性蛋白溶液離心（5 000 r/min，5 min），取15 μL上清液于電泳進(jìn)樣槽中，電壓120 V直至樣品達(dá)底部；4）電泳凝膠采用考馬斯亮藍(lán)R-250（0.1%）染色，并使用脫色液（含乙酸40%）多次脫色至條帶清晰，于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.3.5.5 紫外光譜的測定

參考文獻(xiàn)[15]的方法，準(zhǔn)確稱量 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli樣品溶解于磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L、pH7.0）中，配制蛋白濃度為 1 mg/mL 的 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli蛋白溶液，樣品的掃描波長范圍為290 nm～600 nm。

1.3.5.6 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

根據(jù)Ai等[16]的方法稍作修改，分別取N-Gli、HGli和Gli-MGO與KBr按質(zhì)量比1∶100混合，研磨并壓成1 mm的薄膜，在4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)、以分辨率為2 cm-1掃描128次。使用Peak Fit軟件對酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）去卷積處理，計(jì)算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量。

1.3.5.7 游離巰基和二硫鍵的測定

根據(jù)Wang等[17]的方法并略作修改。具體操作：稱取75 mg凍干樣品，加入4.7 g鹽酸胍，并用Tris-Gly緩沖液（pH8.0）定容至10 mL。然后取1 mL樣液再加入4 mL 8 mol/L尿素振蕩均勻，25℃放置30 min，每隔10 min混勻1次，離心（4℃，5 000×g，10 min）后得到上清液。將部分上清液用考馬斯亮藍(lán)G-250測蛋白含量；另外取1 mL上清液加入20 μL Ellman試劑[將含1.04%Tris、0.69%甘氨酸和0.12%EDTA的Tris-Gly緩沖液（pH8.0）配制成4 mg/mL的DNTB溶液]迅速混合，于25℃下避光反應(yīng)30 min，在412 nm下測定吸光度，空白對照為上述緩沖液。

總巰基含量的測定：取75 mg凍干樣品，加入4.7 g鹽酸胍，并用Tris-Gly緩沖液（pH8.0）定容至10 mL，樣液加入4 mL Urea-GuHCl溶液（含8 mol/L尿素和5 mol/L鹽酸胍的Tris-Gly緩沖液）、0.05 mLβ-巰基乙醇，25℃保溫1 h，再加入10 mL 12%TCA溶液，繼續(xù)25℃保溫1 h后離心（4℃，5 000×g，10 min），將樣品中的沉淀分散于10 mL TCA（12%）溶液中后離心（4℃，5 000×g，10 min）以除去 β-ME，重復(fù) 2 次后再將沉淀溶解于10 mL 8 mol/L尿素中，振蕩均勻至溶解完全。取一部分上清液用考馬斯亮藍(lán)G-250測蛋白含量，再取1 mL上清液加入20 μL Ellman試劑，避光反應(yīng)30 min，測定上清液在412 nm下的吸光度。

巰基（-SH）含量和二硫鍵（-S-S-）含量的計(jì)算公式如下。

式中：73.53為Ellman試劑的摩爾吸光系數(shù)；A412為樣品在412 nm下所測的吸光度；D為稀釋因子；C為樣品濃度，mg/mL；SHtotal為總巰基含量，μmol/g；SHfree為游離巰基含量，μmol/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果采用SPSS13.0軟件中最小顯著法（least significance difference method，LSD）進(jìn)行方差和顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮醛添加量對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響

丙酮醛添加量對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響見圖1。

圖1 丙酮醛添加量對糖化蛋白游離氨基含量和AGEs生成量的影響Fig.1 The effect of the amount of MGO added on the content of free amino groups and the amount of AGEs in glycated protein

由圖1可知，隨著丙酮醛添加量的增大，糖化蛋白的游離氨基含量逐漸下降，從88%下降到43%，當(dāng)丙酮醛添加量大于75 μL（Gli與MGO的質(zhì)量比為1∶6），糖化蛋白的游離氨基含量下降緩慢，這可能是因?yàn)殡S著MGO添加量的增加，MGO和Gli碰撞的幾率會(huì)增大，反應(yīng)程度也隨之增大。但隨著反應(yīng)的進(jìn)行會(huì)產(chǎn)生一定的空間位阻，使得過多的MGO無法繼續(xù)與蛋白游離氨基接觸反應(yīng)[18]。另一方面，隨著丙酮醛添加量的增大，糖化蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸增大，即AGEs的生成量逐漸增多。因此，為提高其安全性，在確保糖基化改性效果的前提下，應(yīng)優(yōu)先選擇適中的丙酮醛添加量，即丙酮醛添加量應(yīng)控制在75 μL（1∶6）以內(nèi)以減少有害物質(zhì)AGEs的產(chǎn)生。

2.2 糖化溫度對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響

圖2為糖化溫度對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響。

圖2 糖化溫度對糖化蛋白游離氨基含量和AGEs生成量的影響Fig.2 The effect of glycation temperature on the content of free amino groups and the amount of AGEs in glycated protein

由圖2可知，游離氨基含量隨著糖化溫度的升高而逐漸下降，從24%降低到3%，140℃之后下降緩慢。這是因?yàn)闇囟仍礁撸腔磻?yīng)程度越大，是典型的熱反應(yīng)[19]。另一方面，隨著糖化溫度的升高，AGEs的生成量先上升，當(dāng)糖化溫度大于100℃時(shí)，熒光性AGEs生成量急劇下降最后趨于穩(wěn)定。推測是100℃處理后，模擬體系中的麥醇溶蛋白會(huì)加速與MGO反應(yīng)生成AGEs，引起熒光值迅速增大；但在更高溫度（140、160℃）下，糖基化程度加劇，熒光性AGEs生成量減少。其原因是升溫加快了美拉德反應(yīng)速率，在100℃時(shí)AGEs生成最多，但隨著溫度的升高，反應(yīng)中熒光性AGEs迅速轉(zhuǎn)化成類黑素等不具有熒光性的物質(zhì)而導(dǎo)致熒光值降低[20]。由此發(fā)現(xiàn)在糖化溫度140℃的反應(yīng)條件下，其糖基化程度較高，而AGEs的生成量較低。因此，為了降低體系中美拉德反應(yīng)過程有害產(chǎn)物的生成量，應(yīng)選擇在140℃下進(jìn)行糖化反應(yīng)。

2.3 糖化時(shí)間對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響

糖化時(shí)間對醇溶蛋白改性過程中游離氨基含量和AGEs生成量的影響如圖3所示。

圖3 糖化時(shí)間對糖化蛋白游離氨基含量和AGEs生成量的影響Fig.3 The effect of glycation time on the content of free amino groups and the amount of AGEs in glycated protein

由圖3可知，糖化蛋白的游離氨基含量隨糖化時(shí)間的延長逐漸下降，從34%降低到11%，糖化75 min后游離氨基含量的變化不顯著（P＞0.05），表明糖基化程度逐漸加深并趨于平緩。這是由于前期丙酮醛會(huì)迅速與暴露在蛋白質(zhì)表面的游離氨基發(fā)生反應(yīng)，隨著反應(yīng)程度的加深，丙酮醛的接入產(chǎn)生一定的空間位阻，從而限制了反應(yīng)的進(jìn)行。另一方面，隨著糖化時(shí)間的延長，糖化蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸增大，但45 min之后，AGEs的生成量隨著糖化時(shí)間的延長而減少，與劉慧琳等[21]的結(jié)果相同。推測是由于隨著糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長，熒光性AGEs進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成不具熒光性的物質(zhì)（如類黑素）。由于有害產(chǎn)物AGEs生成量與糖化時(shí)間成正比，因此改性時(shí)間不宜過長，選擇75 min作為糖化時(shí)間，此時(shí)具有較好的糖基化效果和較低的有害產(chǎn)物生成量。

2.4 糖基化改性對麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的功能特性如表1所示。

表1 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的功能特性Table 1 The functional properties of N-Gli，H-Gli and MGOGli

2.4.1 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

由表1可知，經(jīng)糖基化處理后的MGO-Gli乳化性最高，為6.444 m2/g，較N-Gli提高了50.03%，而經(jīng)加熱處理后H-Gli的乳化性較N-Gli下降了23.84%（P＜0.05）。這可能是因?yàn)镸GO的糖基化修飾使分子大小和溶解度增加，提高了MGO-Gli的可溶性蛋白含量，從而使吸附到乳液液滴表面的蛋白質(zhì)增多，乳滴之間的絮凝減少，麥醇溶蛋白的乳化能力隨之增加。經(jīng)丙酮醛糖基化修飾后的麥醇溶蛋白容易相互交聯(lián)形成更大尺寸的分子，由于這種大分子聚合物在乳化過程中有利于抑制液滴的聚集和破裂，從而有效提高蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性[22]。而在僅加熱的過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，引發(fā)多聚集體的產(chǎn)生，降低了蛋白分子的柔順性和溶解度，使蛋白更難分散于乳化界面中，這在一定程度上降低蛋白的乳化性[23]。

2.4.2 起泡性和起泡穩(wěn)定性分析

由表1可知，MGO-Gli的起泡性和泡沫穩(wěn)定性較N-Gli均有明顯提高，原因可能是MGO和麥醇溶蛋白之間的共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致麥醇溶蛋白上親水基團(tuán)的數(shù)量增加，從而提高了麥醇溶蛋白的溶解度，進(jìn)一步導(dǎo)致MGO-Gli的起泡性增加[24]。但H-Gli較N-Gli的起泡性輕微減弱，這可能是由于加熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量變性，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，從而提高內(nèi)部的疏水基團(tuán)和巰基暴露程度，麥醇溶蛋白分子通過非共價(jià)鍵重新連接，形成更大的分子聚集體，從而降低了水-空氣界面膜的穩(wěn)定性，使蛋白的起泡性下降[25]。

2.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜分析

本文將麥醇溶蛋白與丙酮醛反應(yīng)后的樣品（MGO-Gli）進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以未處理的麥醇溶蛋白（N-Gli）和加熱時(shí)不加丙酮醛的樣品（H-Gli）作為對照，電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的電泳圖譜Fig.4 Electrophoresis patterns of N-Gli，H-Gli and MGO-Gli

由圖4可知，N-Gli分子量主要分布在25 kDa～46 kDa，分別對應(yīng) α-/β-和 γ-醇溶蛋白，并且在 66.2 kDa處出現(xiàn)淺色條帶，與其他文獻(xiàn)[26-27]結(jié)果一致。與N-Gli相比，H-Gli在低分子量的條帶消失，出現(xiàn)的條帶主要分布在28.1 kDa和46 kDa，推測是由于加熱導(dǎo)致蛋白發(fā)生聚集，分子量聚集。而相比N-Gli和H-Gli，糖化蛋白（MGO-Gli）亞基條帶的顏色較淺，這是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)主要以非共價(jià)作用與蛋白質(zhì)分子上游離氨基、巰基等活性基團(tuán)相結(jié)合，呈現(xiàn)顏色反應(yīng)[28]。當(dāng)MGO-Gli進(jìn)行糖基化反應(yīng)時(shí)，游離氨基和巰基含量迅速減少，阻礙了考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合，導(dǎo)致電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)不顯色，這一現(xiàn)象也間接表明麥醇溶蛋白與MGO是以共價(jià)鍵結(jié)合，而且在濃縮膠與分離膠分界線處觀察到染色現(xiàn)象，同時(shí)低分子量處的蛋白條帶消失，這說明小分子蛋白質(zhì)經(jīng)過MGO修飾糖化反應(yīng)生成了分子量較大、難以通過濃縮膠進(jìn)入分離膠的大分子聚合物。電泳的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了丙酮醛和麥醇溶蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng)，形成了以共價(jià)鍵結(jié)合的糖蛋白聚合物。

2.4.4 紫外光譜分析

圖5為N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的紫外光譜。

圖5 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的紫外光譜Fig.5 UV spectrum of of N-Gli，H-Gli and MGO-Gli

蛋白質(zhì)本身含有帶芳香環(huán)的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸殘基，并在280 nm處具有特殊的紫外吸收[29-30]。如圖5所示，MGO-Gli與H-Gli、N-Gli的紫外光譜曲線有著明顯的不同，丙酮醛糖化過程中除了提高糖化蛋白在280 nm處的紫外吸收峰峰值，也在330 nm左右出現(xiàn)了新的吸收峰，說明糖基化過程改變了基團(tuán)的微環(huán)境，暴露了肽鏈上具有紫外吸收的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸殘基[31]，且伴隨糖基化反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)生了新的具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)物質(zhì)。

2.4.5 紅外光譜分析

N-Gli、H-Gli及糖基化MGO-Gli的紅外光譜如圖6所示。

圖6 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的紅外光譜Fig.6 FT-IR spectra of N-Gli，H-Gli and MGO-Gli

由圖6可知，當(dāng)麥醇溶蛋白肽鏈上的游離氨基與丙酮醛發(fā)生糖基化反應(yīng)，最直觀的表現(xiàn)就是蛋白質(zhì)的游離氨基減少，多肽鏈上引入了丙酮醛的羰基，在紅外光譜中，3 400 cm-1左右的吸收峰代表O-H鍵和NH鍵伸縮振動(dòng)，N-Gli出峰在3 295.4 cm-1，而MGO-Gli出峰在3 301.3 cm-1，發(fā)生了藍(lán)移，說明糖基化后Gli引入了MGO分子，MGO分子的共價(jià)接入影響了N-H鍵的振動(dòng)，氫鍵作用力減弱[32]。與N-Gli相比，糖基化產(chǎn)物MGO-Gli在波數(shù)1 640 cm-1左右的吸收峰發(fā)生了藍(lán)移且吸收強(qiáng)度減弱，表明糖基化反應(yīng)的發(fā)生引起了C=O鍵的伸縮振動(dòng)變化，這與Greene等[33]的研究結(jié)果基本一致。在1 539 cm-1處，MGO-Gli較N-Gli的吸收強(qiáng)度減弱，這表明分子中-NH2的彎曲振動(dòng)減弱。Gu等[34]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)后，蛋白質(zhì)中的-NH2等功能性基團(tuán)會(huì)減少，會(huì)導(dǎo)致此處的吸收峰強(qiáng)度下降；此外1 250 cm-1左右的峰代表C-N鍵伸縮振動(dòng)，發(fā)現(xiàn)MGO-Gli在該處的吸收峰出現(xiàn)藍(lán)移，并且吸收峰強(qiáng)度增大，說明糖基化反應(yīng)增大了分子中新形成的C-N共價(jià)鍵吸收強(qiáng)度，由此可以證明，經(jīng)過糖基化反應(yīng)，麥醇溶蛋白以共價(jià)鍵的形式引入丙酮醛分子[35]。從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，糖基化產(chǎn)物MGO-Gli在1 050 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度明顯增大，說明糖基化反應(yīng)使麥醇溶蛋白的側(cè)鏈上引入了對應(yīng)的功能基團(tuán)，從而促使蛋白質(zhì)的側(cè)鏈發(fā)生了振動(dòng)[36]。

N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的二級結(jié)構(gòu)組成如表2所示。

表2 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structural contents of N-Gli，H-Gli and MGO-Gli

由表2可以看出，與N-Gli相比，MGO-Gli中α-螺旋含量從28.71%下降到27.45%，而β-折疊含量從47.22%增加到54.04%，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少，表明蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被破壞，致使游離氨基和丙酮醛發(fā)生糖基化反應(yīng)，這與Zhao等[37]的研究結(jié)果一致。與α-螺旋結(jié)構(gòu)相比，β-折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)象的穩(wěn)定性較差，有利于功能特性所需要的某些構(gòu)象變化，α-螺旋/β-折疊代表蛋白分子柔性，比例越高，分子柔性越低[38]。研究發(fā)現(xiàn)，MGO-Gli樣品中的α-螺旋與β-折疊之比為0.508，明顯低于N-Gli樣品中的0.608，這說明糖基化改性后，經(jīng)丙酮醛分子修飾的麥醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白的分子柔性增強(qiáng)，利于蛋白質(zhì)的功能特性的改善[39]。這與2.4.1中的MGO-Gli的乳化性得到較大改善的結(jié)果一致。

2.4.6 游離巰基和二硫鍵含量的分析

N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的游離巰基和二硫鍵含量結(jié)果如圖7所示。

圖7 N-Gli、H-Gli和MGO-Gli的游離巰基和二硫鍵含量Fig.7 The free-SH and-S-S-contents of of N-Gli、H-Gli and MGO-Gli

如圖7所示，隨高溫加熱的進(jìn)行，麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)趨于暴露式，H-Gli的游離巰基含量增加，而MGO-Gli樣品的游離疏基含量較N-Gli進(jìn)一步降低，但二硫鍵含量高于N-Gli和H-Gli，表明羰基化加劇了一些被掩蔽游離巰基的暴露，隨后暴露的游離巰基氧化形成新的二硫鍵。這種巰基與二硫鍵含量的變化對于維持蛋白分子空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及改變功能特性起到了關(guān)鍵作用[40]，這也解釋了前文提到的糖基化前后功能特性和結(jié)構(gòu)的變化。

3 結(jié)論

本文以麥醇溶蛋白和丙酮醛為研究對象，通過模擬小麥制品熱加工體系進(jìn)行糖基化反應(yīng)。結(jié)果表明，麥醇溶蛋白與丙酮醛質(zhì)量比1∶6、糖化溫度140℃、糖化時(shí)間75 min時(shí)，MGO-Gli的游離氨基含量較少，糖基化效果好，且有害物質(zhì)熒光性AGEs生成量少。針對Gli以及糖基化改性的MGO-Gli的功能性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論：糖基化后的MGO-Gli的乳化活性較N-Gli提高了50.03%，乳化穩(wěn)定性提高了79.51%，起泡性和起泡穩(wěn)定性分別提高了13.33%、28.20%，表明糖基化改性有利于功能特性的改善。電泳結(jié)果分析表明，小分子量蛋白經(jīng)MGO修飾后共價(jià)結(jié)合形成蛋白-MGO共聚物。由于其分子量大，無法進(jìn)入分離凝膠并聚集在濃縮凝膠和分離凝膠的交界處；紫外光譜結(jié)果顯示光譜峰值發(fā)生紅移，說明糖基化過程改變了基團(tuán)的微環(huán)境，暴露了肽鏈上具有紫外吸收的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸殘基。通過紅外光譜分析，與N-Gli相比，糖基化改性后MGO-Gli的α-螺旋含量減少，而β-折疊的含量增加，說明糖基化反應(yīng)影響了麥醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量。