兔源大腸桿菌的分離鑒定

王新新，任 曼，孫 浩

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 843300；2.新疆阿克蘇地區(qū)民政局 843000）

大腸埃希氏細(xì)菌隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）﹑埃希氏菌屬（Escherichia）﹑大腸桿菌種（coli），是革蘭氏陰性的直桿菌，無芽孢[1-3]，兼性厭氧，常存在于人和動(dòng)物的腸道。致病性大腸桿菌常引起幼齡動(dòng)物嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[4-6]。兔大腸桿菌?。╮abbits colibacillosis）又名黏液性腸炎，以幼齡兔發(fā)生流涎﹑腹瀉﹑排鼠糞樣或透明膠胨樣糞為主要特征[7]，在兔養(yǎng)殖業(yè)中常見并危害較大的一種疾病。本試驗(yàn)對(duì)某兔場(chǎng)的疑似病例開展病原分離鑒定，并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，從而對(duì)兔源大腸埃希氏菌的分離鑒定和兔大腸桿菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

病料來自新疆阿拉爾市某兔場(chǎng)。采集腹瀉癥狀的兔子糞樣﹑病死兔的腸內(nèi)容物和肝臟。樣品均無菌采集，并裝入無菌處理的密封袋和凍存管，單獨(dú)標(biāo)記，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

普通瓊脂（LB）固體培養(yǎng)基﹑麥康凱培養(yǎng)基﹑伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基﹑SS瓊脂培養(yǎng)基﹑葡萄糖發(fā)酵管﹑甘露醇發(fā)酵管﹑麥芽糖發(fā)酵管﹑蔗糖發(fā)酵管﹑乳糖發(fā)酵管﹑衛(wèi)矛醇發(fā)酵管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒鑒定套裝，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

GEX-9272MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；LDZX-40Bl型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；HPX-9272MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離純化及生長(zhǎng)特性鑒定

按照無菌操作方法取兔小腸內(nèi)容物和糞便樣品，用生理鹽水稀釋后用移液槍滴加到麥康凱培養(yǎng)基上并用涂布棒進(jìn)行涂布均勻（分別標(biāo)號(hào)為腸內(nèi)容物﹑1號(hào)糞便﹑2號(hào)糞便），在肝組織切面上用涂布棒蘸取肝切面后移于麥康凱培養(yǎng)基上涂布均勻（標(biāo)號(hào)為肝組織）,置37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

按照無菌操作方法從麥康凱瓊脂平板上挑取單個(gè)紅色菌落[14]，接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板﹑SS瓊脂平板﹑普通瓊脂固體培養(yǎng)基上，于37℃溫箱中培養(yǎng)24h。

生長(zhǎng)特性的鑒定依據(jù)：大腸桿菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成光滑﹑白色或灰白色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成黑色帶有金屬光澤的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成紅色或粉紅色菌落；在SS瓊脂平板上生長(zhǎng)不良或不生長(zhǎng)[3]。

1.2.2 染色鏡檢

按照革蘭氏染色試劑盒鑒定套裝說明書進(jìn)行染色，鏡檢。

判定標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)革蘭氏染色的大腸桿菌在光學(xué)顯微鏡下呈紅色﹑兩端鈍圓﹑短桿狀[3]。

1.2.3 生化試驗(yàn)

1.2.3.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)

選取葡萄糖﹑乳糖﹑衛(wèi)矛醇﹑蔗糖﹑甘露醇﹑麥芽糖六種糖分別在微量反應(yīng)管中進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)。使用微量反應(yīng)管時(shí)，輕輕用鉗子夾斷以上無培養(yǎng)基的玻璃管，然后用在酒精燈灼燒的接種針蘸取相對(duì)應(yīng)的已經(jīng)培養(yǎng)好的純菌種接種，放在37℃恒溫箱過夜培養(yǎng)，18～24 h觀察并記錄觀察結(jié)果。

1.2.3.2 硫化氫試驗(yàn)

蘸取被檢細(xì)菌的純培養(yǎng)物，接種于硫化氫微量反應(yīng)管中，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d后觀察結(jié)果。

1.2.3.3 觸酶試驗(yàn)

用酒精燈灼燒的接種環(huán)將被檢菌落放于載玻片1/3處，滴加一滴3%雙氧水于菌落上，立即觀察是否有氣泡產(chǎn)生。

1.2.3.4 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

將從兔腸段上取得的被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，于35℃恒溫培養(yǎng)1～4 d，每日觀察記錄。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

取1號(hào)糞便﹑2號(hào)糞便﹑腸內(nèi)容物中分離鑒定的大腸桿菌，分別注射5只昆明小鼠。1號(hào)糞便中分離鑒定的大腸桿菌分別注射5只昆明小鼠（注射劑量均為0.5mL）。注射后連續(xù)觀察48h并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

通過分離培養(yǎng)，分別從標(biāo)號(hào)1號(hào)糞便﹑2號(hào)糞便和腸內(nèi)容物的培養(yǎng)基上得到三株疑似菌（分別標(biāo)記為1F﹑2F﹑C）。1F﹑2F上得到的疑似菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成光滑﹑灰白色菌落（圖1），在麥康凱培養(yǎng)基形成紅色圓形菌落（圖2），在伊紅美蘭瓊脂平板上長(zhǎng)出黑紫色帶金屬光澤的圓形菌落（圖3），SS瓊脂培養(yǎng)基未形成肉眼可見的菌落。

圖1 2F LB培養(yǎng)基

圖2 2F 麥康凱培養(yǎng)基

圖3 1F 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

見表1及圖4～9。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

圖4 1F

圖5 2F

圖6 1F

圖7 2F

圖8 C

圖9 硫化氫試驗(yàn)

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

注射2號(hào)糞便和腸內(nèi)容物中分離的菌株，5只昆明小鼠在12 h內(nèi)死亡3只；解剖觀察后發(fā)現(xiàn)，腹腔有少量積液，肝臟邊緣變黑，其它實(shí)質(zhì)臟器眼觀無明顯病理變化。注射1號(hào)糞便中分離的菌株，5只昆明小鼠均未發(fā)現(xiàn)引起死亡。

3 討論

本試驗(yàn)采集新疆阿拉爾市某兔場(chǎng)疑似大腸桿菌病例的病料，對(duì)其進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)，形態(tài)學(xué)觀察（革蘭染色鏡檢），生化試驗(yàn)及試驗(yàn)動(dòng)物感染試驗(yàn)。病料通過預(yù)處理后，分別接種到普通瓊脂培養(yǎng)基﹑麥康凱培養(yǎng)基﹑伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基﹑SS瓊脂培養(yǎng)基。經(jīng)過培養(yǎng)后，標(biāo)記為1號(hào)糞便﹑2號(hào)糞便和腸內(nèi)容物的培養(yǎng)基中均培養(yǎng)出類似大腸桿菌的菌落，生長(zhǎng)特性均符合要求。分別挑取單個(gè)菌落，涂片，革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均為革蘭氏陰性（紅色）﹑兩端鈍圓﹑成雙或散裝排列的短桿菌，形態(tài)特征符合預(yù)期要求。

通過形態(tài)學(xué)觀察的單個(gè)菌落進(jìn)行純化增菌后，對(duì)其開展了生化試驗(yàn)，從生化試驗(yàn)結(jié)果來看，腸內(nèi)容物糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與其他兩組試驗(yàn)結(jié)果有較大區(qū)別，1號(hào)糞便與2號(hào)糞便糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果中葡萄糖﹑衛(wèi)矛醇﹑乳糖都是產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而腸內(nèi)容物試驗(yàn)結(jié)果只有葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，衛(wèi)矛醇既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣其他兩個(gè)不產(chǎn)氣，乳糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，蔗糖試驗(yàn)結(jié)果只有1號(hào)糞便產(chǎn)酸產(chǎn)氣其他兩組不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，麥芽糖和甘露醇三組都是只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)三組都無顏色變化。硫化氫試驗(yàn)中三組都無顏色變化。各種生化特性均符合于大腸肝菌，從而確定此3株細(xì)菌為大腸桿菌。

再進(jìn)一步對(duì)昆明小鼠進(jìn)行感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2號(hào)糞便和腸內(nèi)容物中分離的菌株具有致死性，而1號(hào)糞便分離的菌株未引起試驗(yàn)動(dòng)物死亡。從而確定，2號(hào)糞便和腸內(nèi)容物中分離出的菌株具有致病特性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采集疑似大腸桿菌病的兔子病料，對(duì)其開展細(xì)菌分離培養(yǎng)，染色鏡檢和生化試驗(yàn)。最終，從中分離出3株疑似菌。經(jīng)過生長(zhǎng)特性﹑形態(tài)學(xué)觀察和生化特性鑒定后，確定其為大腸桿菌。通過感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中2種菌株具有致病特性。