豬偽狂犬病檢測技術(shù)研究進(jìn)展

陳云蕾，吳 蘭，丁林玲，張澤林，程國華，王佳璟，張 鯤

（ 1． 桐廬縣無規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)管理中心，浙江 杭州 310000 ；2． 桐廬縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 杭州 310000 ； 3． 浙江康嘉基因技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000 ）

豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）又稱Aujeszky 氏病，是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）感染引起的以發(fā)熱、腹瀉、繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為主的急性接觸性傳染病。PRV的天然宿主是豬，還可感染牛、犬、貓等多種家畜和野生動(dòng)物，對(duì)世界畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，PRV 可跨越物種屏障并誘發(fā)人腦膜炎，但對(duì)人PRV腦膜炎的明確仍存在爭議[4]。PRV的傳播途徑包括接觸傳播、垂直傳播以及空氣傳播等，其中空氣傳播最早可追溯至1813年，但其具體機(jī)制及傳播能力尚不明確[5]。自1947 年我國首次報(bào)道豬感染PRV 以來[6]，隨后也出現(xiàn)了牛、山羊等多種動(dòng)物感染PRV的報(bào)道，直到1970年Bartha-K61疫苗株引入我國后，PR才得以很好的控制[7]。2011年底，部分免疫Bartha-K61疫苗株的豬場出現(xiàn)了以神經(jīng)系統(tǒng)疾病和仔豬高死亡率為特征的PRV 突變株[8-10]，并迅速蔓延至中國大部分地區(qū)，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，也對(duì)PR 疫情防控提出了新的檢測需求，特別是在如何區(qū)分疫苗株與野毒株感染、隱性感染的鑒定、免疫保護(hù)水平評(píng)價(jià)等方面。新型檢測技術(shù)方法的出現(xiàn)為PR防控提供了更多選擇，但如何篩選有效的檢測方法對(duì)于PR 防控具有重要的意義。本文就PRV 蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、臨床癥狀、血清學(xué)診斷技術(shù)及核酸檢測技術(shù)展開敘述，闡述近年P(guān)RV新型檢測技術(shù)的靈敏度及各檢測方法臨床應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為臨床PRV凈化、防控過程檢測方法的選擇提供參考。

1 PRV流行特點(diǎn)

PRV 屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，與牛皰疹病毒Ⅰ型和馬皰疹病毒Ⅰ型具有較高的同源性[11]。PRV 為線狀雙股DNA，基因組大小為143 kb，具有典型皰疹病毒特征，病毒粒子呈球形或橢圓形，有囊膜，直徑約為150～180 nm，由含病毒基因組的核蛋白核心、病毒的多面體核衣殼、蛋白衣殼和含有病毒編碼糖蛋白細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層膜組成[12-13]；其中病毒多面體核殼皮呈二十面體結(jié)構(gòu)包裹病毒DNA，具有保護(hù)病毒DNA的作用。迄今為止，已鑒定到的PRV基因有72種，主要是一些病毒復(fù)制相關(guān)的酶、結(jié)合點(diǎn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白和毒力蛋白等[14]。PRV 的毒力是由編碼胸腺激酶（TK）及糖蛋白gE、gI 和核苷酸還原酶（RR）等多種基因協(xié)同控制[15-17]；其中TK 基因作為主要的毒力基因，若發(fā)生失活，宿主的毒力將降低或喪失?，F(xiàn)有的PRV 缺失疫苗株均是針對(duì)TK、gE、gI 和RR等毒力基因的缺失對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用[18-19]，也成為臨床通過檢測缺失疫苗株蛋白的抗體區(qū)分疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物的關(guān)鍵。

多種動(dòng)物均可感染PRV，如反芻動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和食肉動(dòng)物，病死率可達(dá)到100%[20-21]。豬是PRV的儲(chǔ)存宿主，感染后潛伏期一般為3～6 d，臨床癥狀隨年齡、感染毒株的毒力及免疫效果的不同而表現(xiàn)出很大差異[22-23]。PR 常以輕微或隱性感染為主，表現(xiàn)為一過性發(fā)熱、便秘等癥狀，多在3～4 d恢復(fù)，若繼續(xù)發(fā)展則會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，偶爾也可引起死亡。妊娠母豬感染PRV 后，常經(jīng)垂直傳播感染胎兒，其發(fā)病率和病死率隨著日齡增長而逐漸降低，斷乳仔豬可長期帶毒、排毒[24]。感染種豬和仔豬長期帶毒是本病長期流行和難以根除的關(guān)鍵。飼養(yǎng)管理不善、衛(wèi)生條件差、其他疫病控制不力、各種應(yīng)激均可誘發(fā)PR，且PR 無嚴(yán)格的季節(jié)性，以寒冷季節(jié)多發(fā)[11]。此外，由于PRV 本身具有很強(qiáng)的免疫逃逸能力，不僅豬體內(nèi)能夠持續(xù)感染，破壞免疫系統(tǒng)，還可誘發(fā)其他疾病的產(chǎn)生，給養(yǎng)殖戶帶來極大的損失。目前尚無針對(duì)PRV有效的藥物，只能通過疫苗接種進(jìn)行預(yù)防和高免血清治療降低病死率，因此高效靈敏的PRV檢測方法是臨床中PR防控和健康養(yǎng)殖的有效支撐。

2 PRV檢測技術(shù)

PR的檢測技術(shù)、診斷準(zhǔn)確率是預(yù)防PRV的先決條件，早發(fā)現(xiàn)早防控方可有效降低養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，目前臨床PRV的常用診斷技術(shù)以血清學(xué)診斷和核酸診斷為主。

2.1 血清學(xué)檢測技術(shù)

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是應(yīng)用最廣泛的血清抗體檢測方法，與其他方法相比因具有更高的靈敏度和更簡單的特性而備受關(guān)注。而選擇抗體或抗原的不同則具有不同的檢測意義，以PRV gE 缺失疫苗建立的ELISA 診斷方法，可快速有效地鑒別PRV 野毒感染抗體和免疫gE 基因缺失疫苗而產(chǎn)生的抗體，對(duì)野毒的發(fā)現(xiàn)具有重要意義[25]；gB蛋白作為PRV的一種必須糖蛋白和重要免疫原，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平可以反映豬群的免疫狀態(tài)，因此，選擇gB 蛋白建立的ELISA方法可有效評(píng)估疫苗的免疫效果。

劉旻翾等[26]針對(duì)PRV gB糖蛋白高度保守的抗原優(yōu)勢肽段設(shè)計(jì)的間接ELISA 方法，僅對(duì)PRV 血清檢測陽性，與其他病毒陽性血清均無反應(yīng)陽性；最低檢測下限血清稀釋度為1∶128，高于IDEXX PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒下限稀釋度（1∶4），批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)小于10%，可有效區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。張洪亮等[27]利用Bartha-K61株gB基因核心抗原區(qū)和閔A株gE基因核心抗原區(qū)建立了一種PRV抗體間接ELISA檢測方法，僅與陽性血清反應(yīng)，敏感性可達(dá)1:1 600，批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)小于10%。趙靜[28]依據(jù)制備和篩選的gB 單克隆抗體（mAb）312H 為阻斷抗體建立的阻斷ELISA 檢測方法，與豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）-1 DV株、PRRSV-2 F112株血清均無交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于3%，對(duì)PRV 變異株二倍梯度稀釋（1∶2～1∶2 048）陽性血清，比IDEXX 試劑盒敏感性高2～8 倍。PRV 變異株對(duì)gB 不同表位的抗原漂移影響和個(gè)體對(duì)不同表位的變異多樣化，阻斷ELISA會(huì)出現(xiàn)一定的誤判[29]，與間接ELISA相比仍需進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)；其高靈敏度和更簡單的特性仍是鑒別疫苗免疫抗體和野毒感染抗體的首選，為PRV的防控和凈化工作提供檢測依據(jù)。

2.1.2 膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）

GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測的一種新型免疫檢測技術(shù)，檢測不依賴儀器設(shè)備，具有可直接判讀結(jié)果、操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，特別適合基層獸醫(yī)使用[30]。王華俊等[31]利用膠體金標(biāo)記純化的抗PRVgB單克隆抗體10D4組裝成側(cè)向?qū)游觯↙FA）方法通用膠體金層析試紙，檢測下限為1∶640、TCID50為1×108.6/0.1 mL的滅活抗原，與CSFV、PRRSV、PCV2、豬細(xì)小病毒（PPV）、PEDV 均無交叉反應(yīng)。雷有玲等[27]以重組gE 蛋白和豬IgG 組裝膠體金PRV gE 抗體免疫層析試紙；最低檢出1∶1 280 倍稀釋樣品，與IDEXX gE-ELISA 抗體試劑盒符合率為95.31%。郭力偉等[32]以重組gE蛋白為免疫原，5D10 和6E8 為標(biāo)記抗體和檢測抗體組裝檢測PRV野毒株的膠體金免疫層析試紙條，與CSFV、PRRSV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、PPV、PCV-2和PRV疫苗株均無交叉反應(yīng)，且野毒株檢出量可達(dá)1×102.83TCID50，與PCR方法的符合率達(dá)92.59%。以gE、gB 等抗體組裝膠體金試紙條，操作簡便、靈敏度較高、不依賴設(shè)備儀器，更適合基層養(yǎng)殖單位進(jìn)行PRV野毒的快速鑒別診斷。

2.1.3 熒光微球免疫檢測技術(shù)（FMIA）

FMIA是一種結(jié)合熒光微球作為抗原復(fù)合物結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)檢測方法，適用于單一復(fù)雜樣品中不同分析物的高通量、多重和同時(shí)檢測，檢測快速，具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。有研究[33-34]將PRV gE、gB 重組蛋白作為抗原分別與12號(hào)、28號(hào)磁珠微球偶聯(lián)，用gE-12、gB-28偶聯(lián)復(fù)合體作為捕獲載體，分別建立了gE、gB IgG 抗體FMIA 檢測方法，在此基礎(chǔ)上建立了PRV gE 和gB IgG 抗體的雙重?zé)晒馕⑶蛎庖邔W(xué)檢測方法。經(jīng)ROC 曲線分析顯示，gE 臨界值為5 991.5 時(shí)，AUC 最大為0.981，敏感度為92.3%，特異性為99.26%；gB 臨界值為2 862 時(shí)，AUC 最大為0.989，敏感度為96.3%，特異性為95.74%；此方法具有重復(fù)性好、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)。這種方法的建立可應(yīng)用于PRV野毒感染豬和疫苗免疫豬的快速鑒別診斷及保護(hù)性抗體的檢測，是一種多重抗體檢測的重要方法，為動(dòng)物疫病多重抗體的檢測診斷提供了思路，值得大面積推廣。

2.1.4 競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法（CLEIA）

CLEIA是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)的結(jié)合，通過化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)物濃度的正比關(guān)系，檢測微量抗原或抗體的一種新型免疫測定技術(shù)[35]；比間接ELISA方法需求時(shí)間短、操作簡單，可定量分析[36]。馬震原等[36]以PRV gB蛋白組建了可快速檢測的一種競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫抗體檢測方法，最低可檢測1∶2 048 稀釋的國家參考血清，與CSFV、PRRSV、PCV2 等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無交叉反應(yīng)；與中和試驗(yàn)陽性符合率為94%，陰性符合率為96.92%，明顯優(yōu)于商品化ELISA 試劑盒，為PRV gB 抗體的快速定量檢測提供了一個(gè)科學(xué)可靠的技術(shù)手段。此方法快捷、敏感、高效，能夠較好地在動(dòng)物疫病防控一線中推廣與應(yīng)用。

2.2 核酸檢測技術(shù)

2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR 由變性、退火、延伸等3個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，其特異性主要依賴與靶基因序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR一般應(yīng)用于檢測血液、血清或器官樣品中的基因組序列，具有檢測速度快、操作簡單、取樣少、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但PCR 檢測時(shí)需注意的是3 周內(nèi)未接種過偽狂犬弱毒疫苗的豬，以免造成誤診。胡銘哲等[37]利用PRV全基因組篩選出的基因片段建立了一種鑒定Ⅰ型和Ⅱ型PRV 基因型的PCR 分型方法，檢測CSFV、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、PRRSV、PEDV 和豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）時(shí)均為陰性，兩種分型方法針對(duì)Ⅰ型和Ⅱ型PRV的最低檢測限均為1×104copies/μL。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，單重和雙重PCR 檢測結(jié)果一致。趙宇等[38]根據(jù)GenBank 中公布的PRV gE 基因和PCV3 基因組序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并建立了一種能夠同時(shí)檢測PRV 和PCV3 的雙重PCR 檢測方法，對(duì)PCV2、PPV、CSFV、PRRSV、PEDV 無反應(yīng)，PRV最低檢測值為502.0 copies/μL，PCV3 最低檢測值為91.2 copies/μL。結(jié)果表明，該方法可快速檢測PRV 和PCV3，具有很好的特異性和靈敏度，為PRV 流行病學(xué)調(diào)查、感染豬群的清群凈化提供了有效技術(shù)手段。

2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

qPCR是將擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)收集的熒光基因信號(hào)使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板的定量分析。與常規(guī)PCR 方法比較更快速、靈敏、不易交叉污染，可進(jìn)行定量分析，是病原學(xué)診斷中常用的方法。常晨等[39]根據(jù)PRV gI/gE基因序列建立一種鑒別PRV 野毒株的qPCR 方法，靈敏度達(dá)到102copies/μL，具有較好的特異性和重復(fù)性，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證qPCR 比普通PCR 能夠更靈敏地檢出多種組織的帶毒量。溫書香等[40]利用PRV gE基因構(gòu)建了一種qPCR方法，可快速、特異地鑒別野毒株與疫苗株，檢測靈敏度可達(dá)10 copies/μL，與CSFV、PRRSV、PPV、PCV 不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性，且與兩種商品化試劑盒驗(yàn)證結(jié)果一致。此檢測方法可應(yīng)用于日常PRV 野毒株與疫苗免疫株的鑒別診斷，為PRV的凈化提供技術(shù)支撐。

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

LAMP是由Notomi[41]利用識(shí)別靶序列上的8個(gè)特異區(qū)域和Bst DNA 聚合酶在恒溫下形成瀑布式的核酸高效擴(kuò)增，具有操作方便、反應(yīng)迅速、成本低廉和結(jié)果可視等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體的檢測[42-43]。許宗麗等[43]利用PRV gB 基因的保守序列建立了一種在常規(guī)65 ℃水浴鍋中30 min內(nèi)通過肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果的LAMP 可視化檢測方法，與CSFV、PCV2 等均無反應(yīng)，敏感性可達(dá)1 fg，與普通PCR 檢測結(jié)果一致。陳珍金等[44]基于LAMP引入PRV gB基因序列保守區(qū)段設(shè)計(jì)篩選出的引物建立了一種LAMP 檢測方法，與CSFV、PCV2、PRRSV等8種病原無反應(yīng)，敏感性可達(dá)10 fg/μL，穩(wěn)定性強(qiáng)，與qPCR結(jié)果高度一致，且操作簡單、便捷，此方法的建立為PRV 的快速檢測和基層檢疫提供了新的選擇。部分LAMP檢測方法的研究見表1。

2.2.4 重組聚合酶擴(kuò)增（RPA）

RPA 是一種等溫DNA 擴(kuò)增技術(shù)[45]，重組酶和引物形成蛋白-DNA混合物并啟動(dòng)尋找模板DNA上的同源序列；已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的快速檢測，也是一種適用于現(xiàn)場檢測的方法[46-48]。劉立兵等[49]根據(jù)PRV gB和gE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了一種在38 ℃恒溫反應(yīng)20 min 可實(shí)現(xiàn)對(duì)PRV 野毒和疫苗毒的特異性鑒別檢測的雙重RPA 方法，最低檢測限均為102copies/μL，與熒光定量PCR 檢測限一致，且檢測結(jié)果符合率100%。這種方法建立的PRV雙重RPA方法特異性強(qiáng)，敏感性高，對(duì)儀器設(shè)備要求低，操作簡單，反應(yīng)快速，對(duì)于我國豬群中國PRV的流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

2.2.5 DNA芯片

DNA芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相雜交新技術(shù)，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或DNA探針按一定序列固化于基片上的DNA陣列。寡核苷酸微陣列亦是DNA 芯片的一種。吳鳳筍等[50]利用PRV gE 基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建DNA芯片，通過對(duì)探針質(zhì)量濃度、雜交溫度和雜交時(shí)間的篩選和優(yōu)化實(shí)現(xiàn)1×10-6ng 級(jí)靈敏度，高出普通PCR 靈敏度10 倍。羅寧等[51]利用PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV 等10 種病毒基因的靶基因點(diǎn)和具有Cy3 標(biāo)記的熒光標(biāo)記探針制作基因芯片，并經(jīng)1 006份樣品符合檢測，最低檢測濃度可達(dá)105copies/μL，與普通PCR/RT-PCR 相比，符合率96.79%以上；該研究結(jié)果為臨床開展多病原聯(lián)合檢測技術(shù)提供了思路。DNA 芯片技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，是動(dòng)物疫病診斷技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

3 結(jié)論

PRV 變異株導(dǎo)致Barthk 61 疫苗株免疫后感染出現(xiàn)以神經(jīng)系統(tǒng)疾病和仔豬高死亡率為特征的PR 暴發(fā)以來，疫苗免疫效果存在缺陷，且藥物治療效果不佳，使PR的防控愈加困難；只有充分了解現(xiàn)有PRV檢測診斷技術(shù)的靈敏度及臨床中各檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)，才能更好地對(duì)PR 進(jìn)行凈化。同時(shí)，PR的監(jiān)測和凈化也具有重要的公共衛(wèi)生意義。自首次報(bào)道以來，基于臨床癥狀、動(dòng)物接觸史或血清抗體檢測結(jié)果的相關(guān)研究較多見，偶見有人類感染PRV 的報(bào)道。因此，PR 的監(jiān)測與凈化不但有利于提高養(yǎng)豬行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，也會(huì)大大降低人感染PRV的風(fēng)險(xiǎn)。