牛冠狀病毒病診斷及防治的研究進(jìn)展

李小龍，石亞楠，鮑顯偉，李 昊，王雪妍，許立華

（ 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021 ）

冠狀病毒（coronaviruses，CoV）可感染家畜、家禽、野生動(dòng)物和人類，其中牛冠狀病毒（bovine coronaviruses，BCoV）所引發(fā)的牛冠狀病毒病在全球大范圍存在，可引起腸道和呼吸道雙重臨床癥狀，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。CoV 是非節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，也是目前已知基因組最大的RNA 病毒，長度約為26～32 kbp。CoV 亞科可分為Alpha（α）、Beta（β）、Gamma（γ）和Delta（δ）等4 個(gè)屬，又因?yàn)橥粚僦袕?fù)制酶結(jié)構(gòu)存在差異而劃分為不同譜系，BCoV屬于β屬。本文對(duì)牛冠狀病毒病的病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)制、鑒別診斷和預(yù)防等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在加強(qiáng)對(duì)牛冠狀病毒病的認(rèn)知，為該病的防控提供參考。

1 牛冠狀病毒病病原學(xué)

1.1 培養(yǎng)特性

分離培養(yǎng)BCoV 的細(xì)胞主要包括非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero 細(xì)胞）、綿羊胎腎細(xì)胞、胎牛胸腺細(xì)胞和牛腎細(xì)胞（MDBK 細(xì)胞）等細(xì)胞系。Storz 等[1]研究表明，分離培養(yǎng)BCoV 時(shí)添加適量胰酶可對(duì)病毒增殖和出現(xiàn)細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）等發(fā)揮重要作用。

1.2 基因組學(xué)

迄今為止，BCoV 只有一種基因型。BCoV 的基因組約31 kb，其中包括10 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）以及兩側(cè)的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。ORF1 約占5'端2/3 的基因序列，可分為ORF1a和ORF1b，分別翻譯為復(fù)制酶多聚蛋白pp1a 和pp1ab，之后被蛋白水解酶（主要為木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶）切割成數(shù)種非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structuralprotein，NSP）[2]。ORF4、8、9 和10 分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N），其他ORF編碼額外的NSP。一些β屬病毒編碼一種凝集素酯酶輔助蛋白，稱為血凝素-酯酶蛋白（HE）[3]，基因組基本結(jié)構(gòu)為5'UTRORF1a-ORF1b-HE-S-E-M-N-3'UTR-3'端聚腺苷酸尾。HE 蛋白在病毒表面形成穗狀突起，作為一種血凝素能夠與細(xì)胞表面的9-O-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合，外在表現(xiàn)為能夠凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞。HE 蛋白具有乙酰酯酶活性，可與糖蛋白膜表面的唾液酸結(jié)合，通過與含有9-O-乙酰化唾液酸的細(xì)胞表面結(jié)合使細(xì)胞受體失活，這種能力對(duì)病毒的傳染性至關(guān)重要[4]，并可作為第二種病毒附著蛋白啟動(dòng)感染。此外，HE蛋白在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[5]。

S 蛋白含有大量抗原表位，主要的生物學(xué)功能是參與病毒與靶細(xì)胞的附著以及病毒和細(xì)胞膜的融合。S蛋白與細(xì)胞受體之間的相互作用是CoV 宿主范圍和組織向性的主要決定因素。S蛋白由細(xì)胞胰蛋白酶樣蛋白酶介導(dǎo)分裂為S1和S2亞基。S1亞基上的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠連接細(xì)胞受體[6]，以及誘導(dǎo)中和抗體合成和負(fù)責(zé)血凝活性。S1亞基可能與宿主范圍和組織向性有關(guān)[7]，CoV感染始于S1結(jié)構(gòu)域跟宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合。S2 蛋白則能夠介導(dǎo)感染期間病毒和宿主細(xì)胞的膜融合。

E 蛋白是一種小型的膜結(jié)合型蛋白，在病毒內(nèi)有少量存在，分布在病毒的包膜上，作為離子通道發(fā)揮作用，與M蛋白共同參與表達(dá)病毒包膜的形成、組裝與釋放[8]。M 蛋白是CoV 外膜的主要成分，是病毒粒子中最豐富的蛋白質(zhì)[9]，還參與病毒出芽:當(dāng)病毒在出芽時(shí)陷于膜內(nèi)部分M蛋白的羧基末端進(jìn)入核心，可維持病毒核心結(jié)構(gòu)，同時(shí)加快病毒的出芽和增殖。N 蛋白與其余4 種結(jié)構(gòu)蛋白不同，由細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離核糖體合成；N蛋白包裹基因組形成核蛋白復(fù)合體，起到保護(hù)病毒遺傳物質(zhì)的作用；還可與宿主蛋白結(jié)合，參與病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)進(jìn)程。此外，因?yàn)楹艘職さ鞍仔蛄懈叨缺Ｊ?，所以N 蛋白通常是病毒RNA檢測(cè)分析的主要靶蛋白[10]。

2 牛冠狀病毒病流行病學(xué)與致病機(jī)制

2.1 流行病學(xué)

目前，BCoV 在世界范圍內(nèi)廣泛分布。Kim 等[11]于2019年1月—2021年6月采集韓國患有腹瀉的未斷奶犢牛糞樣846 份，陽性檢出率為5.9%。David 等[12]采集了以色列境內(nèi)2017—2021 年2～6 歲發(fā)生冬季痢疾的病牛的糞便和直腸拭子853 份，使用RT-qPCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率為29.3%。楊海峰等[13]對(duì)我國14 個(gè)省份的數(shù)個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中表現(xiàn)呼吸道癥狀的176頭犢牛采集咽拭子，陽性檢出率為21.59%。鄧飛等[14]對(duì)2020年3月—5月間四川387 份出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀病牛的糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽性檢出率為16.8%。Zhu等[15]采集黑龍江省表現(xiàn)明顯腹瀉的牛糞樣1 016份、鼻拭子367份，經(jīng)檢測(cè)其中糞檢陽性率為12.20%、鼻拭子檢陽性率為21.53%。

BCoV 主要通過呼吸道和消化道進(jìn)行傳染，故一般成群發(fā)病，且痊愈牛仍能夠通過呼吸道分泌物或排泄物持續(xù)排毒，病毒可在空氣、飲水、墊料等外界環(huán)境中長時(shí)間存在。BCoV的主要易感動(dòng)物是牛，但在馬、駱駝等家畜以及犬和鹿、長頸鹿等動(dòng)物身上也檢測(cè)出了“類BCoV”[16-17]。這些病毒經(jīng)ELISA、免疫熒光等抗BCoV抗體檢測(cè)，結(jié)果均為陽性，證明其與BCoV 存在交叉免疫。BCoV 具有如此廣泛的宿主范圍可能是因?yàn)镾 蛋白的變異[18]；也有學(xué)者認(rèn)為是由于HE 蛋白的存在，該蛋白使病毒能夠與不同類型的細(xì)胞結(jié)合[19]。

2.2 致病機(jī)制

BCoV 主要通過氣溶膠-鼻途徑和糞-口途徑傳播，BCoV對(duì)細(xì)胞的入侵取決于病毒表面S蛋白與細(xì)胞受體相互作用，其對(duì)牛上呼吸道組織細(xì)胞和腸組織細(xì)胞的親嗜力較強(qiáng)。首先，HE 蛋白和S 蛋白參與病毒和宿主細(xì)胞的黏附，經(jīng)細(xì)胞膜融合使得核衣殼進(jìn)入上呼吸道組織上皮細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞內(nèi)。近年來，有研究提出CoV識(shí)別結(jié)合宿主細(xì)胞，可能使用雙受體結(jié)合基序系統(tǒng)[20]。病毒正鏈RNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)利用宿主的復(fù)制酶體系完成基因組復(fù)制，被翻譯成復(fù)制酶多蛋白，之后CoV 編碼蛋白酶，以切割復(fù)制酶多蛋白生成數(shù)種單獨(dú)NSP，許多NSP 聚集組裝成復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（replicase-transcriptase complex，RTC）并負(fù)責(zé)基因組復(fù)制和亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄[21]。復(fù)制酶以負(fù)鏈RNA作為模板復(fù)制出互補(bǔ)負(fù)鏈RNA，并轉(zhuǎn)錄為正鏈RNA 和亞基因組mRNAs，而后者將作為結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白的模板[22]。亞基因組翻譯表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白HE、S、E、M和N，完成翻譯后的M、S 和E 蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體（ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC）[23]。N 蛋白與病毒基因組結(jié)合形成的螺旋核衣殼，而ERGIC 與具有結(jié)構(gòu)蛋白的膜結(jié)合，形成新的、成熟的病毒體。子代病毒主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體表面，最終在胞質(zhì)空泡的平滑細(xì)胞膜區(qū)域以出芽的方式使細(xì)胞膜發(fā)生破裂[24]，進(jìn)而侵入其他細(xì)胞。

BCoV通過腸道感染時(shí)，腸絨毛生長受到影響，腸上皮細(xì)胞死亡、脫落，并被未成熟的腸上皮細(xì)胞取代，出現(xiàn)小腸絨毛發(fā)育不良以及結(jié)腸嵴萎縮等現(xiàn)象[25]。BCoV以氣溶膠的形式感染上呼吸道并在呼吸道上皮細(xì)胞中繁殖，破壞呼吸道中纖毛清除功能，使機(jī)體易受其他病原體感染，在環(huán)境選擇壓力下繼發(fā)感染的可能性會(huì)上升；同時(shí)感染后期BCoV 感染的組織抑制干擾素及促炎細(xì)胞因子的釋放，造成免疫抑制[26]。且在試驗(yàn)性感染中，BCoV 在動(dòng)物上呼吸道中大量復(fù)制后，動(dòng)物會(huì)吞咽含有該病毒的黏液分泌物進(jìn)入胃腸道，通過黏液分泌物包裹的方式可能使這種不穩(wěn)定但具有傳染性的BCoV轉(zhuǎn)移到腸道，導(dǎo)致腸道感染和通過糞便排出體外[27]。

3 牛冠狀病毒病臨床癥狀

根據(jù)不同毒株、不同感染部位，BCoV所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)也有所不同。BCoV依據(jù)其分離病料不同（牛鼻分泌物、肺組織和腹瀉糞便）可分為牛呼吸道冠狀病毒（BRCoV）和牛腸致病性冠狀病毒（BECov）[28]，其中BECoV還可進(jìn)一步細(xì)分為犢牛腹瀉和冬季痢疾[29]。犢牛腹瀉主要見于1～2周齡的犢牛，排出淡黃色或灰白色水樣糞便，嚴(yán)重時(shí)排出血便；腹瀉導(dǎo)致機(jī)體水與電解質(zhì)流失，嚴(yán)重時(shí)可引起機(jī)體脫水、酸中毒[30]。牛冬季痢疾主要是成年牛于冬季發(fā)病，患病牛表現(xiàn)腹瀉，眼鼻分泌物增多，若泌乳奶牛感染還表現(xiàn)為泌乳量下降并且影響之后的生產(chǎn)性能。BRCoV可感染不同年齡段的牛，多見于2～6月齡的牛，臨床表現(xiàn)為鼻炎、流鼻涕、呼吸困難、咳嗽和發(fā)熱等，若與其他呼吸道疾病的病原體混合感染則會(huì)出現(xiàn)支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎和壞死性大葉肺炎，導(dǎo)致病情加劇及牛群病死率增加。

4 牛冠狀病毒病診斷技術(shù)

4.1 病毒分離

一般采集病牛的糞便、血樣、鼻拭子或病死牛的遠(yuǎn)端腸組織、肺組織等臨床樣品進(jìn)行BCoV的分離，但該檢測(cè)方法存在試驗(yàn)條件嚴(yán)格、操作步驟復(fù)雜和費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，一般不應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

4.2 免疫學(xué)檢測(cè)

4.2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組化技術(shù)原理是通過熒光素、金屬離子、同位素等標(biāo)記BCoV 抗原或與BCoV 相結(jié)合的特異性抗體，對(duì)病毒在組織中進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的檢測(cè)技術(shù)。在試驗(yàn)中使用針對(duì)BCoV的高免疫抗血清或單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以檢測(cè)冰凍或石蠟包埋的呼吸道或腸道組織中的病毒抗原[31]。但高免疫抗血清或單克隆抗體制備時(shí)間長，耗費(fèi)高，不適用于大規(guī)模檢測(cè)。

4.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）

劉合義等[32]、胡林杰等[33]、李晨露[34]建立了基于BCoV N蛋白的抗體間接ELISA，經(jīng)臨床檢測(cè)，其結(jié)果與病毒中和試驗(yàn)結(jié)果符合率很高。上述研究結(jié)果表明，與其他血清學(xué)檢測(cè)方法相比，ELISA的敏感性更高，操作更加簡便，更適用于大規(guī)模樣品的檢測(cè)。

4.2.3 中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)是診斷BCoV 的金標(biāo)準(zhǔn)，其原理是在適當(dāng)條件下使病毒與抗體相互反應(yīng)，之后將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，再測(cè)定殘存的病毒感染力的一種方法。中和試驗(yàn)具有較高的敏感性和特異性，但操作復(fù)雜，試驗(yàn)要求高，耗時(shí)長，因而很少在臨床檢測(cè)中使用。

4.2.4 血凝與血凝抑制試驗(yàn)

BCoV的HE蛋白能夠凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，據(jù)此可通過血凝與血凝抑制試驗(yàn)對(duì)BCoV進(jìn)行診斷。陸承平[35]曾在BCoV的流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用了血凝與血凝抑制的方法進(jìn)行檢樣，結(jié)果顯示，該方法的檢測(cè)結(jié)果與中和試驗(yàn)、ELISA法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)度均較高。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

4.3.1 RT-PCR及多重RT-PCR

劉合義等[36]建立了檢測(cè)BCoV 的RT-PCR，結(jié)果顯示該方法反應(yīng)速率快，特異性強(qiáng)，最低可檢測(cè)到1個(gè)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）的病毒含量。但BCoV常與其他病毒混合感染，如牛輪狀病毒，因而生產(chǎn)中需要同時(shí)檢測(cè)多種病原的方法。柳強(qiáng)等[37]、候佩莉等[38]、季彬等[39]建立了檢測(cè)包括BCoV 的多種病毒的多重RT-PCR 方法，均具有很好的特異性和敏感性，可應(yīng)用于多種病毒性疾病的快速診斷。Cho 等[40]建立了以N 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的巢式PCR，具有較高的敏感性，最低檢出限度為2×102TCID50/0.1 mL。

4.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

沈付嬈等[41]建立了BCoV SYBR GreenⅠq-PCR方法，最低檢測(cè)限為7.8 copies/μL，與牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均無交叉反應(yīng)，批內(nèi)、批間重復(fù)變異系數(shù)均低于1.5%。譚爍等[42]建立了BCoV Taq Man qRT-PCR，對(duì)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限為33.6 copies/μL。彭志豪等[43]、劉夢(mèng)瑤等[44]建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，均具有較好的特異性、敏感性及重復(fù)性。

4.3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種特異性引物，通過鏈置換性DNA 聚合酶的作用下僅需數(shù)十分鐘；具有高效、方便、快速和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。韓廷義等[45]建立了檢測(cè)BCoV 的RT-LAMP 技術(shù)，針對(duì)冠狀病毒的N 基因設(shè)計(jì)引物，最低可檢出50 個(gè)拷貝的RNA；且完成了可視化，能夠通過肉眼進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的觀察。隨著疾病診斷技術(shù)不斷變革，第三代PCR、微流控芯片、納米金LAMP標(biāo)記技術(shù)、規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）技術(shù)等技術(shù)與生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)合的愈加緊密。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)選擇適合當(dāng)時(shí)環(huán)境的方法進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到高效、準(zhǔn)確和快速的目的。

5 牛冠狀病毒病治療與預(yù)防

截至目前仍沒有針對(duì)BCoV 的特定治療方法，也沒有抗病毒藥物，因此很難控制其傳播。牛冠狀病毒病的治療仍以收斂止瀉、平衡電解質(zhì)、補(bǔ)充體液、抗菌消炎等對(duì)癥療法和支持療法為主。但最近越來越多研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白是研發(fā)廣譜冠狀病毒抑制劑的潛在目標(biāo)[46]，可能為BCoV 的防治提供了新方向。

對(duì)牛冠狀病毒病最主要的預(yù)防措施是注射疫苗，其目的是獲得特異性保護(hù)力。目前國外已有BCoV的商品化疫苗，如俄羅斯研制的預(yù)防新生犢牛腹瀉的四聯(lián)滅活疫苗[47]以及日本研制的BCoV滅活油佐劑疫苗等。美國輝瑞動(dòng)物保健公司的Scour Guard 3（K）等滅活疫苗可以接種給妊娠后期的母牛以提高獲得性免疫水平[48]，犢牛通過吮吸初乳攝入保護(hù)性抗體，以保護(hù)犢牛免受臨床BCoV感染。也有一部分疫苗可直接作用于犢牛，通過口服的方式提升犢牛免疫力。Takamura 等[49]研發(fā)了一種由受感染細(xì)胞的可溶性細(xì)胞提取物與油基佐劑混合制成的疫苗，該疫苗抗體效價(jià)高，且尚未出現(xiàn)不良反應(yīng)。Vega等[50]開發(fā)了一種通過口服免疫球蛋白Y（IgY）抗體產(chǎn)生被動(dòng)免疫的新型疫苗可用于控制新生犢牛腹瀉。此外還有一種鼻內(nèi)疫苗可誘導(dǎo)即時(shí)的先天反應(yīng)產(chǎn)生干擾素，進(jìn)而迅速起到保護(hù)作用，犢?？蛇m時(shí)接種減毒的鼻內(nèi)活疫苗。盡管我國也有學(xué)者進(jìn)行過BCoV 疫苗的相關(guān)試驗(yàn)[51]，但尚無流通的國產(chǎn)商品化疫苗。目前對(duì)于BCoV疫苗的開發(fā)更偏向于安全、高效、成本更低的基因工程疫苗[52]。對(duì)于BRCoV相關(guān)疫苗的研究較少，也沒有商品化疫苗的存在。自從2019年新冠病毒暴發(fā)后，由CoV 導(dǎo)致的呼吸道癥狀引起人們的高度重視，因此今后BCoV疫苗研究也可能更注重呼吸道與腸道多毒株聯(lián)合疫苗的開發(fā)。

除了接種疫苗外，科學(xué)的飼養(yǎng)管理也能夠在一定程度上預(yù)防牛冠狀病毒病。如在養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用次氯酸鈉等消毒劑對(duì)牛舍、臥床等進(jìn)行嚴(yán)格消毒，加強(qiáng)通風(fēng)與打掃，定期更換墊料。此外，注重科學(xué)飼喂，提高機(jī)體抵抗力，也可降低牛冠狀病毒病的發(fā)生概率。

6 展望

近年來，隨著BCoV的相關(guān)研究不斷深入，人們已對(duì)該病毒的基因結(jié)構(gòu)、流行特性和致病機(jī)制等方面具有一定了解。但仍存在許多問題亟待解決:病毒基因組可能出現(xiàn)變異、重組事件，威脅人類安全；需要加強(qiáng)對(duì)某些蛋白功能、致病進(jìn)程和免疫逃避等方面的研究；腸道型和呼吸道型BCoV的發(fā)病機(jī)制和因果關(guān)系還需繼續(xù)研究。

目前市面流通的商品化疫苗存在免疫時(shí)間短、繼發(fā)肌炎等缺點(diǎn)，故應(yīng)加快新型疫苗的研發(fā)，如DNA 疫苗、亞單位疫苗。因此，加強(qiáng)BCoV的研究，完善相關(guān)疾病的防控，對(duì)保障畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。